Uzrok policistične bolesti bubrega

za više informacija:ali.ma@wecistanche.com

Prekomjerna ekspresija PKD1 uzrokuje policističnu bolest bubrega

Caroline Thivierge, Almira Kurbegović, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté i Marie Trude

Patogenetski mehanizmi koji su u osnoviautosomno dominantnapolicistična bolest bubrega(ADPKD) ostaje da se razjasni. Iako postoje dokazi da je Pkd1(policistična bolest bubrega 1)haploinsuficijencija gena i gubitak heterozigotnosti mogu uzrokovati stvaranje cista kod miševa, paradoksalno visoke razine Pkd1(policistična bolest bubrega 1) otkrivena je ekspresija ADPKD u bubrezima (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega) pacijenti. Da bi se utvrdilo da li je Pkd1(policistična bolest bubrega 1)dobijanje funkcije može biti patogenetski proces, Pkd1 bakterijski umjetni hromozom (Pkd1-BAC) je modificiran homolognom rekombinacijom kako bi bio usmjeren isključivo na trajnu ekspresiju Pkd1 prvenstveno na bubreg odrasle osobe. Generirano je nekoliko transgenih linija koje su specifično eksprimirale Pkdl transgen u bubrezima 2- do 15-premašiti nivoe endogenog Pkd1. Svi transgeni miševi su reproduktivno razvili tubularne i glomerularne troškove i bubrežnu insuficijenciju i umrli su od zatajenja bubrega. Ovaj model pokazuje da je prekomjerna ekspresija divljeg tipa Pkd1 sama po sebi dovoljna da pokrene cistogenezu koja liči na ljudski ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega). Naši rezultati su također otkrili upadljivo povećanu ekspresiju c-myc bubrega kod miševa iz svih transgenih linija, što ukazuje da je c-myc kritičan in vivo nizvodni efektor Pkd1(policistična bolest bubrega 1)molekularni Dathwavs, Ova studija ne samo da je proizvela neprocjenjivu i prvu PKD(policistična bolest bubrega)model za procjenu molekularne patogeneze i terapije, ali također pruža dokaze da bi povećanje funkcije moglo biti patogenetski mehanizam u ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega).

Click to Cistanche za bolest bubrega

Autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega(ADPKD) je jedna od najčešćih genetskih bolesti kod ljudi. Karakterizira ga progresivni razvoj višestrukih bubrežnih cista koje zahvaćaju sve segmente nefrona. Ostale manifestacije uključuju stvaranje cista u jetri i pankreasu, kao i intrakranijalne aneurizme i kardiovaskularne defekte. ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)tipično dovodi do bubrežne insuficijencije s progresijom do završnog stadijuma bubrežne bolesti do kasne srednje dobi.

Otprilike 85 posto ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)slučajevi su povezani s mutacijama u PKD1(policistična bolest bubrega 1)gen. Ovaj PKD1(policistična bolest bubrega 1)gen je velik, prostire se na 54 kb i sastoji se od 46 egzona. Generiše transkript od 14.2-kb i kodira 4., 302-protein aminokiseline koji se zove policistin-1(4, 9-11). Ekspresija humanog PKD1 i policistina{11}} je analizirana u normalnom i ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)bubrezi. Tokom razvoja bubrega, policistin-1 se lako otkriva u glomerularnim i tubularnim epitelnim ćelijama (pregledano u referenci 37 i referencama u njoj). Kod normalnih odraslih osoba, mi i drugi smo pokazali da PKD1(policistična bolest bubrega 1)RNK i protein se eksprimiraju na umjerenim do niskim nivoima u sabirnim i distalnim tubulima, dok su nivoi povećani (~2- puta) u ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)bubrezi (22, 39). Zanimljivo je da je perzistentna ili pojačana ekspresija policistina-1 otkrivena u većini bubrežnih epitelnih cista, iako je bojenje izostalo u značajnoj manjini cista(29). Pored bubrega, PKD1(policistična bolest bubrega 1)ekspresija je normalno raširena u drugim tkivima odraslih, uključujući epitelne i neepitelne tipove ćelija (6,14,18,29,30, 39).

Više od 200 različitih PKD1(policistična bolest bubrega 1)opisane su mutacije, od kojih su većina mutacije deletion-insertion, frameshift ili besmislene mutacije. Predviđa se da će oni rezultirati skraćenim oblicima proteina, u skladu s inaktivacijom jednog alela.

Međutim, značajan udio su missense ili mutacije unutar okvira koje se nalaze u cijelom genu i često su jedinstvene za određenu porodicu (33, 34). Kao što naziv govori, ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)je dominantan i prenosi se mutirani PKD1(policistična bolest bubrega 1)alel je dovoljan da izazove bolest. Međutim, fokalna priroda bubrežnih cista u ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)sugerira da je mutacijski mehanizam za PKD1(policistična bolest bubrega 1)može biti dva pogotka ili gubitak heterozigotnosti. Podrška za ovaj mehanizam dobijena je detekcijom PKD1(policistična bolest bubrega 1)klonske somatske mutacije u ćelijama iz značajnog udjela cista (3, 21, 32). Mehanizam gubitka heterozigotnosti mogao bi objasniti široko varirajući fenotip koji se obično opaža u pojedinačnim porodicama.

Studije na mišu Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gen može pružiti vrijedan uvid u funkciju(e) PKD1 zbog bliske sličnosti između ljudskog i mišjeg gena i genskog proizvoda. U normalnom razvoju, mišji Pkd1 se eksprimira na visokim nivoima iz stadijuma morule i detektuje se u svim derivatima ćelija neuralnog grebena. uključujući mozak odraslih, luk aorte, hrskavicu i mezenhimsku kondenzaciju (16, 17). Prijavljeno je da su homozigotni mutantni miševi ciljani za deleciju Pkd1 umirali in utero i da su razvili ciste bubrega i pankreasa (2,19,24-26, 40). Ovi prethodni pokušaji generiranja mišjih modela nažalost nisu pružili održive životinje postnatalno. Ipak, pojava bubrežnih cista kod ovih homozigotnih Pkd1 mutantnih miševa bila bi u skladu s hipotezom o mehanizmu mutacije dva pogotka kod ljudi koji uključuje mutaciju zametne linije i somatsku inaktivaciju normalnog alela. Međutim, miševi heterozigotni za Pkd1 ciljanu deleciju također su pokazali PKD sa povremenim cistama jetre i pankreasa uprkos kasnom nastanku kod odraslih, podržavajući mehanizam haploinsuficijencije ili smanjenja doze gena. Štaviše, gubitak heterozigotnosti ili haploinsuficijencije možda nije jedini mehanizam za ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)patogeneza. Zaista, ovi mehanizmi su u suprotnosti sa upornom ili pojačanom ekspresijom PKD1(policistična bolest bubrega 1)vidi se kod većine ljudskih bubrežnih cista osim ako se ne proizvode nefunkcionalni proteini. Ovaj nalaz kontinuirane ili povećane ekspresije PKD1 postavlja pitanje da li pojačanje funkcije ili prekomjerna ekspresija mogu biti operativni. Da bismo istražili patogenetski mehanizam povećanja funkcije Pkd1, izolovali smo i okarakterizirali mišji Pkd1 bakterijski umjetni hromozom (Pkd1-BAC) koji je naknadno modificiran homolognom rekombinacijom u Escherichia coli do ciljane ekspresije Pkd1(policistična bolest bubrega 1)posebno na bubrege. Izvještavamo o proizvodnji tri transgene linije koje su eksprimirale Pkd1 transgen na različitim nivoima. Svi miševi su reproducibilno pokazali brojne sličnosti sa ljudskim ADPKD i konzistentno su se razvijali u ranoj fazi s brzim napredovanjem morfoloških i funkcionalnih promjena bubrega i umrli su od zatajenja bubrega do srednje dobi. Osim toga, trenutna studija opisuje in vivo mehanizam pomoću kojeg Pkd1 može posredovati u ovom PKD fenotipu. Ovi miševi predstavljaju prvi model PKD proizvedenog jedinom bubrežnom prekomjernom ekspresijom ortolognog PKD1(policistična bolest bubrega 1)gen.

MATERIJALI I METODE

Izolacija BAC klonova koji sadrže Pkd1(policistična bolest bubrega 1)locus. Pkd1-BAC klonovi iz bakterijskog soja domaćina E. coli DH10B (RecA; RecBC) izolovani su iz 129Sv mišje pBelo11BAC biblioteke (Research Genetics). Skrining BAC super bazena je izveden PCR sa sljedećim prajmerima: 5 regija, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (naprijed Pkd1 ekson 1) i 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC-3 (obrnuti Pkd1 egzon 1); i 3 regije, 5-TCG GCCCTAGCGTCTGCAGCC-3 (naprijed Pkd1 ekson 39) i 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (reverzni Pkd1 ekson 40). Jedan pozitivan klon za obje amplifikacije je identificiran i analiziran na standardnoj gel elektroforezi i pulsnom polju (PFGE) nakon čega je uslijedio Southern blot. Za Southern blot analizu, dizajnirano je sedam mišjih Pkd1 sondi: genomski egzon 1 (516 bp; nukleotidi [nt] 1 do 516; NCBI pristupni broj U70209), genomski egzon 2-3 (220 bp), genomski egzon {{ 31}} (8,479 bp), cDNK egzon 15-20 (1,724 bp; nt 6455 do 8179), cDNK egzon 25-34 (1,315 bp; nt 9415 do 10730), cDNK egzon 36-45 ( 1,655 bp; nt 10963 do 12618), i genomski egzon 45-46 (1,640 bp) (16). Nekoliko regija, uključujući BAC umetnute ekstremitete ovog mišjeg Pkd1-BAC-a, također je sekvencirano i potvrđeno je da su ortologni humanom PKD1 genu i susjednim regijama.

REZULTATI

Proizvodnja SBPkdl(policistična bolest bubrega 1) rAc-BAC homolognom rekombinacijom. Da bi se utvrdilo da li je Pkd1 pojačanje funkcije dovoljno da proizvede ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)fenotipa, prvo smo izolovali genomski klon koji sadrži cijeli Pkdl gen u biblioteci BAC vektora 129/Sv. Ova biblioteka je skrinirana pomoću PCR-a sa dva seta prajmera za gen Pkd1 koji je obuhvatao ekson 1 na 5' kraju i egzone 39 do 40 prema 3' kraju (Sl.1). Identifikovan je pozitivan BAC klon za gen Pkd1 koji je uključivao cijelo susjedno tijelo Tsc2 gena. Pkd1 umetak je detaljno okarakterisan kako bi se osiguralo da genomska struktura odgovara onoj endogenog Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gen mišjeg soja 129/Sv iz kojeg je izveden insert i iz inbred soja C57BL/6J. Genomske mape lokusa Pkd1 u BAC i ovih inbred sojeva pomoću Southern blot analize, sa četiri digestije restrikcijskim enzimima i sedam sondi koje pokrivaju cijeli Pkdl gen, izgledale su identične bez dokaza o preuređenju (slika 1). Ovaj BAC je sadržavao ~121-kb umetak uključujući-37 kb uzvodne i -39 kb nizvodne sekvence Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gen kako je određeno elektroforezom i sekvenciranjem.

Ovaj Pkd{0}}BAC klon je modificiran dvama uzastopnim događajima homologne rekombinacije u E.coli. The Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gen je označen u eksonu 10 zamjenom nukleotida (G do A) kako bi se stvorilo novo EcoRI mjesto na poziciji 2355 na cDNK mapi. Ova tiha tačkasta mutacija je proizvedena da bi se razlikovao Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gen i transkript BAC od onog endogenog porijekla. Osim toga, zamijenili smo 5'regulatorne elemente Pkd1-BACgena koristeći prednosti prethodno identificiranih "SB" specifičnih elemenata bubrežnog epitela iz SBM-a (povezanih sa c-Myc) ili SBF-a povezanih sa c- fos)konstrukt-trans-gen za ograničavanje ekspresije na bubrege (36,38)(slika 2a).

Ovaj novi SBPkd1TAc-BAC je digestiran sa Notl-om, jedinstvenim mjestom koje se nalazi odmah uzvodno od SB elemenata, i ClaI unutar tijela Tsc2 gena, skraćujući Tsc2 regulatorne elemente i 5'polovinu genskog tijela kako bi se osigurao nedostatak egzogene ekspresije Tsc2 u svim tkivima i da se uklone prokariotske sekvence BACvektora (sl.1 i 2). Ovaj 70- kb Notl-Clal linearizovani fragment je izolovan, pročišćen i kvantifikovan za mikroinjekciju oocita (36).

Proizvodnja i analiza SBPkd1rAc transgenih miševa. Četiri transgena osnivača koji nose nekoliko kopija SBPkd1rAc transgena dosljedno razvijaju PKD(policistična bolest bubrega). Od četiri miša osnivača SBPkdlrAc utvrđenih Southern analizom, ustanovljene su tri SBPkd1rAG transgene linije sa dvije do devet kopija transgena (slika 2b). Karakterizacija integriteta transgena u ovim linijama praćena je 5', internim i 3' sondama kao što je prikazano reprezentativnim primjerima na slici 2b. Transgene linije otkrile su sa 5'"SB" sondom traku od 10,9 kb u skladu sa SBPkd1rAc trans-genom integrisanim u orijentaciju od glave do repa i otkrivene sa 3' sondom 7.1-kb pojas (Sl. 2b). Osim toga, interna sonda je otkrila 9.4-kb endogeni Pkd1 opseg, kao i 6.9-kb i 2.5-kb trake transgena zbog mjesta umetanja EcoRI u eksonu 10 (slika 2b). Ovi miševi su sadržavali kompletne kopije transgena zasnovane na analizi genomske strukture preklapanja.

Pkd1(policistična bolest bubrega 1)dobijanje funkcije kod odraslih SBPkdlrAc transgenih miševa. Ekspresija SBPkdlrAG transgena i gena Pkd1 ispitivana je u različitim organima. Kvantifikacija nivoa transkripta iz transgena i/ili endogenog gena izvršena je Northern blot analizom (slika 3a). Kao što se očekivalo, transgenski i endogeni transkripti gena bili su slične dužine (14,2 kb). Na osnovu kontrolne ekspresije GAPDH, bubrezi iz svih SBPkd1TAG mišjih linija su imali konzistentno povećanu ekspresiju transkripta u poređenju sa normalnim nivoima Pkdl kod odraslih bubrega (n=3) slične starosti. Bubrežni transgen i endogena ekspresija za različite transgene linije pokazuju raspon od 2- do 15- puta iznad kontrolnih nivoa endogenog Pkd1 bubrega (slika 3a). Posebno, transgena linija 39 (n {{11} }) je pokazao veći Pkd1(policistična bolest bubrega 1)nivoi od redova 3(n=3) i 41 (n =4). Nadalje, nivoi ekspresije Pkd1 izmjereni Northern blot analizom koreliraju sa onima dobijenim PCR-om u realnom vremenu korištenjem prajmera u egzonima 1 i 2 (slika 3b).

Kvantifikacija nivoa ekspresije transgena specifično je izvršena PCR-om u realnom vremenu i semikvantitativnim RT-PCR-om u tri transgene linije u odrasloj dobi korištenjem prajmera u 5'-netranslatiranom području (B, -globin promotor) i u eksonu 2 Pkd1(policistična bolest bubrega 1)(Sl.3b). Ekspresija SBPkdlrAc kod transgenih miševa je upoređena sa S16 ribosomalnim proteinskim genskim proizvodom kao internim standardom. Uslovi korišteni za semikvantitativnu RT-PCR amplifikaciju bili su unutar linearnog raspona. Ekspresija transgena PCR-om u realnom vremenu i semikvantitativnim RT-PCR-om konzistentno i specifično su pokazali najveću ekspresiju u bubrezima od svih transgenih linija u odnosu na druge organe (sl. 3b i c). Nivoi bubrežne ekspresije za pojedinačni uzorak bili su ponovljivi sa bilo kojom od korištenih tehnika detekcije. Najviši nivoi Pkd1(policistična bolest bubrega 1)transgenska renalna ekspresija izmjerena je za linije 39 i 41. Da bi se pratilo da li je povećan Pkd1(policistična bolest bubrega 1)ekspresija koja je rezultat transgena ili endogenog gena, ista grupa miševa iz tri transgene linije je upoređena za renalnu ekspresiju Pkd1 transgena i za renalnu ukupnu (transgensku i endogenu) ekspresiju Pkd1 putem PCR-a u realnom vremenu. Zanimljivo je da su linije 39 i 41 u odnosu na liniju 3 pokazale da je povećana ekspresija Pkdl transgena bubrega bila slična ili veća od ukupne ekspresije Pkd1 u bubregu, ukazujući na transgen kao specifično odgovoran za ovu indukovanu ekspresiju. U različitim organima (uključujući srce, pluća, mozak, jetru, gušteraču i slezenu), SBPkd1rAg transgen je pokazao vrlo slabu ekspresiju, povremeno otkrivenu u slezeni i plućima, sa malo ili neotkrivenom ekspresijom u drugim organima (slika 3b). Kvantifikacija PCR-om u realnom vremenu pokazala je 10- do 1,000-put niži nivo ekspresije transgena u ekstrarenalnim tkivima u odnosu na ekspresiju bubrega (slika 3c). "SB" regulatorni elementi SBPkdlrA transgena dali su preferencijalnu ekspresiju bubrega; ova posebna distribucija organa je takođe određena kada se koristi u transgenima povezanim sa c-myc (SBM) i c-fos (SBF) (36, 38).

C-myc, nizvodni efektor Pkd1(policistična bolest bubrega 1)signalnih puteva kod SBPkdlrAc miševa. Da bismo stekli uvid u intracelularni patogenetski mehanizam SBPkdlrAg transgenih miševa, zatim smo pokušali pratiti nivo ekspresije c-myc bubrega na osnovu našeg prethodnog zapažanja deregulacije c-myc u humanom ADPKD-u. (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)bubrezi(22). Analiza bubrega je obavljena sa sve tri transgene linije 3(n =4),39(n =7), i 41 (n=4) kao i kontrole (n=4). Kao što je prikazano na slici 3d, postoji značajna ekspresija endogenog c-myc indukovanog kod SBPkd1TAG miševa u odnosu na kontrolne miševe slične starosti. Zanimljivo, nivo ekspresije c-myc u nekim SBPkd1-c bubrezima. posebno linija 39, dostigla je nivoe koji se mogu uporediti sa onim uočenim u PKD SBM modelu transgenog miša proizvedenog bubrežnom c-myc ekspresijom.

Anomalije bubrega kod SBPkd1raG miševa slične PKD(policistična bolest bubrega). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>6 za svaku liniju) razvijene su višestruke tubularne (T) i glomerularne ciste (G) (sl. 4d, f i g). Ciste su uočene u tubulima iz kortikalnog i medularnog regiona, kao i sabirnim tubulima iz papile (Sl. 4d i e). Transgeni miševi su pokazali tubularnu epitelnu hiperplaziju (vrh strelice) koja uključuje i cistične i ne-cistične tubule i čestu hipertrofiju (sl. 4g i h), ali ozbiljnost je varirala između pojedinačnih miševa. Intersticijska fibroza (F), perivaskularni limfoidni infiltrati i proteinski izljevci (P) su često uočeni (sl. 4d i e).

Za preciznije definiranje mjesta lokalizacije povećanog Pkd1(policistična bolest bubrega 1)ekspresiju u bubrezima, izvršili smo hibridizaciju in situ koristeći prethodno korištenu sondu egzon 36-45(16). Hibridizacijski signal je bio lokaliziran specifično na epitelne stanice koje oblažu cistu i hiperplastične tubule kao i glomerularne ciste. Osim toga, neki signal je uočen preko epitela necističnih ili blago proširenih tubula, vjerovatno identificirajući tubule koji su predodređeni za buduće cistične promjene (sl. 4i i j).

Histološka analiza bubrega također je izvršena na transgenim miševima pri rođenju (n =8), postnatalnog dana 10 (P10) (n =3), P20 (n =5), P35 (n { {7}}), i P45(n=3) u poređenju sa negativnim leglama iste starosne grupe (n 2 do 4). Zanimljivo je da su svi novorođeni transgeni miševi pokazali tubularnu i glomerularnu dilataciju u odnosu na kontrolno negativno leglo (sl. 4k i l), što ukazuje da su bubrežne anomalije inicirane in utero kao što je uočeno kod SBM miševa i kod ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)pacijenata. Tubularna i glomerularna dilatacija povećavala se u veličini i broju s progresivnom starošću. Do P35, transgeni miševi su pokazali ozbiljniju hiperplaziju i dokaze glomeruloskleroze. Promijenjene fiziološke funkcije bubrega kod SBPkd1TAG miševa. Fiziološke funkcije bubrega svih transgenih miševa pokazale su karakteristike slične PKD(policistična bolest bubrega), dok se kod netransgenih legla nikada nije razvila bolest. U roku od nekoliko mjeseci nakon rođenja, oboljele životinje razvile su kroničnu bubrežnu insuficijenciju. Ove životinje su praćene funkcionalnih parametara bubrega mjerenjem nivoa u serumu i urinu, azota uree u krvi (BUN) i kreatinina, osmolalnosti urina, proteina u urinu i izlučivanja jona (Tabela 1). Svi miševi iz tri linije u poređenju sa kontrolnom skupinom pokazali su defekte koncentracije, što je uobičajen nalaz u ADPKD, i posljedično su pokazali smanjene koncentracije BUN-a, kreatinina, proteina i željeza u urinu. Transgenični osnivači SBPkd1TAG i potomci (n 6) iz svake linije su kvalitativno praćeni na proteinuriju na uzorcima urina pomoću SDS-PAGE (slika 5). Miševi stariji od 2 mjeseca pokazali su neselektivnu proteinuriju koja je napredovala s godinama. Pored toga, povećani su nivoi serumskog BUN-a i serumskog kreatinina, što je otkrilo bubrežnu insuficijenciju (Tabela 2). Budući da kronična bubrežna insuficijencija obično dovodi do promjena u hematološkim parametrima, oni su ispitivani kod SBPkd1TAG transgenih miševa starosti od 3 do 14 mjeseci (Tabela 2). Ovi transgeni miševi su bili anemični, što je dokazano značajno smanjenim brojem crvenih krvnih zrnaca, pri čemu su hemoglobin i hematokrit dostigli polovinu normalnih nivoa. Ostali parametri crvenih krvnih zrnaca, kao što je postotak retikulocita, nisu bili pogođeni, kao što se očekivalo kada su inducirani bubrežnim defektom. Ove životinje su stalno umirale od zatajenja bubrega u 5.9  2.8 mjeseci starosti (n 42) za transgensku liniju 39 iu kasnijim godinama, 14.6 3.1 mjeseci (n 20) i 11 .7 6.5 mjeseci (n 7), za redove 3 i 41, redom.

Fig. 1. Šematski prikaz i detaljna analiza restrikcijske karte mišjeg Pkd1-BAC-a.

Obrasci digestije genomske DNK Pkd1(policistična bolest bubrega 1)-BAC su upoređeni sa Pkd1(policistična bolest bubrega 1)lokus u 129Sv i C57Bl/6J inbred sojevima miševa. Proizvedeno je sedam sondi koje obuhvataju većinu mišjeg Pkd1 gena:

(a) egzon 1, (b) egzon 2-3, (c) egzon 7-15, (d) egzon 15-20, (e) egzon 25-34, (f) egzon 36-45, i (g) egzon 45-46, označen od a do g na genomskom Pkd1(policistična bolest bubrega 1)reprezentacija i preko pojedinačnih mrlja.

Southern blot analiza nakon restrikcijskih digestija (BamHI, EcoRI, HindIII i KpnI) genomske DNK iz Pkd{0}}BAC i mišjeg Pkd1(policistična bolest bubrega 1)lokusi su pokazali identične obrasce sa svih sedam sondi. M, HindIII marker; 129, 129/Sv; C57, C57Bl/6J.

DISKUSIJA

Ovdje izvještavamo o izolaciji i karakterizaciji mišjeg Pkd1-BAC-a. Ovaj Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gen je označen i regulatorni elementi su zamijenjeni da ciljaju ekspresiju specifično na bubrege sa dva uzastopna događaja homologne rekombinacije. Transgeni miševi proizvedeni s ovim novim genom SBPkd1TAG pokazali su 2- do 15- puta povećanje ekspresije Pkd1 i reproduktivno razvili rane bubrežne morfološke promjene tipične za PKD. Bubrežna insuficijencija je očigledna u srednjim godinama, a miševi prerano umiru od zatajenja bubrega. Naši rezultati također pokazuju da je mehanizam prekomjerne ekspresije Pkd1 odgovoran za ovaj fenotip posredovan signalnom aktivacijom c-myc in vivo. Ova studija pokazuje da je povećanje funkcije mišjeg Pkd1 u bubrezima dovoljno da proizvede PKD bubrežni fenotip. Budući da mišji Pkd1 gen nije dupliciran kao kod ljudi (27), direktno smo identificirali i izolirali BAC klon koji je sadržavao cijeli gen Pkd1. Kompletna karakterizacija 129/Sv mišjeg Pkd1-BAC, indirektno poređenje sa dva druga inbred soja miševa, potvrdila je integritet Pkd1 lokusa. Pkd1-BAC insert sadržavao je 37 do 39 kb uzvodnih i nizvodnih sekvenci od Pkd1 gena. Naša analiza je pokazala da je gen Pkd1 u ovom BAC-u bio bona fide mišji divlji tip lokusa koji bi mogao poslužiti za daljnja istraživanja. Iako postoje jaki dokazi da formiranje cista u ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)može biti rezultat gubitka heterozigotnosti nakon somatske inaktivacije normalnog PKD1(policistična bolest bubrega 1)alela (3, 21, 32), postoje i sugestivni dokazi za kontinuiranu ili čak povećanu ekspresiju policistina-1 u cističnom tubularnom epitelu (22, 29). Potonje zapažanje postavlja pitanje da li je prekomjerna ekspresija Pkd1 per se dovoljan približan uzrok cistogeneze. Kod transgenih miševa koji nose ljudski PKD1(policistična bolest bubrega 1), TSC2, RAB 26, NTHL1 i SLC9A3R2 geni, samo manjina miševa razvila je ciste i nijedan nije imao uočljivu ekspresiju transgena u odrasloj dobi uprkos 30 kopija transgena (31). Kod tih transgenih miševa bilo je teško utvrditi jasnu ulogu prekomjerne ekspresije Pkd1 u cistogenezi. Naš model se razlikuje po tome što je dvije do devet kopija divljeg tipa samo Pkd1, bez susjednih gena, integrirano u transgene miševe. Budući da gen Pkd1 ima bitne funkcije u različitim organima ili tkivima, kao što je opisano za brojne miševe sa ablacijom gena Pkd1, sistemska prekomjerna ekspresija Pkd1 mogla bi dovesti do dodatnih zbunjujućih efekata. Shodno tome, bavili smo se ulogom Pkd1 dobijanja funkcije koristeći pristup koji cilja Pkd1 specifično na bubrege. Homolognom rekombinacijom, prvo smo zamenili Pkd1 uzvodni regulatorni region sa "SB" renal restriktivnim regulatornim elementima, čime smo sprečili smanjenu ekspresiju gena koja se normalno vidi za Pkd1 u odrasloj dobi, kao i potencijalnu sekundarnu regulaciju petlje povratne sprege (36, 38). Drugo, označili smo mišji Pkd1 transgen (Pkd1TAG) tihom tačkastom mutacijom u eksonu 10, ali nismo ubacili oznaku epitopa kako bismo osigurali da će se proizvoditi potpuno funkcionalni protein "divljeg tipa" sa očuvanom strukturom i integritetom. Iz ovog modificiranog BAC-a, SBPkd1TAG fragment je pročišćen od Tsc2 gena i BAC vektora kako bi se spriječila interferencija Tsc2 gena, koji također može izazvati cistični fenotip (8, 20, 28), kao i da bi se izbjegao inhibitorni učinak prokariotske sekvence (5).

Četiri različita SBPkd1TAG transgena osnivača miša i tri nezavisne linije proizvedene su sa specifičnim bubrežnim Pkd1(policistična bolest bubrega 1)-pojačano izražavanje. Posebno je upečatljiva potpuna penetracija fenotipa kod ovih transgenih miševa. Osnivač SBPkd1TAG i linija miša dijele nekoliko zajedničkih fiziopatoloških karakteristika sa ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega). To uključuje razvoj cista u korteksu, meduli i glomerulima zajedno sa epitelnom hiperplazijom, intersticijskom fibrozom i žarišnom intersticijskom upalom.

Jer PKD(policistična bolest bubrega)fenotip je konzistentno uočen kod svih različitih transgenih miševa osnivača i integracija transgena u genom miša je slučajan fenomen, fenotip ne može biti rezultat efekta hromozomske pozicije, već samo povećane ekspresije Pkd1. Zaista, pokazalo se da je ekspresija Pkd1 transgena u svim linijama ograničena na bubrege, kao što je ranije uočeno za druge transgene regulisane "SB" elementima (36, 38). Štaviše, ova povećana ekspresija Pkd1 uzrokovana je transgenom, a ne indirektnom endogenom aktivacijom Pkd1. Stoga, naši rezultati pružaju jasne dokaze da povećanje funkcije funkcionalnog Pkd1 divljeg tipa može proizvesti višestruke bubrežne ciste. Važno je da ovi SBPkd1TAG miševi čine prvi mišji model generiran jedinom prekomjernom ekspresijom mišjeg ortologa ljudskog PKD1 gena.

SBPkd1TAG miševi pokazuju da Pkd1(policistična bolest bubrega 1)prekomjerna ekspresija je primarni patogenetski mehanizam bubrežne cistogeneze. Važno je da se čini da najviši nivoi ekspresije transgena u bubrezima koreliraju s progresijom i ozbiljnošću fenotipa. Također smo otkrili da prekomjerna ekspresija Pkd1 u razvoju fenotipa SBPkd1TAG vjerovatno signalizira aktivaciju c-myc in vivo. Moguće je da bi ova aktivacija čak mogla biti direktna kroz rep C-terminalnog policistina-1 koji prolazi kroz proteolitičko cijepanje i nuklearnu translokaciju (7). Pošto se pokazalo da pojačana ekspresija c-myc u bubrezima kod odraslih miševa indukuje PKD, bilo bi vrlo konzistentno podržati c-myc kao glavni nizvodni efektor Pkd1 signalnih puteva. Ovaj rezultat je također u korelaciji s našim prethodnim nalazima povećane ekspresije c-myc u bubrezima svih ljudskih ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)analizirano (22). Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da je c-myc glavni posrednik Pkd1(policistična bolest bubrega 1)cistogeneza. Naši rezultati iz modela povećanja funkcije Pkd1, zajedno sa mišjim Pkd1 haploinsuficijencijom i gubitkom funkcije, ukazuju na to da bilo koja disregulacija Pkd1 može dovesti do cistogeneze (2, 19, 23–26, 31, 40).

Teški Pkd1(policistična bolest bubrega 1)neravnoteža kod miševa izazvana Pkd1(policistična bolest bubrega 1)ablacija ili transgenska prekomjerna ekspresija uzrokovala je rani početak i brzu progresiju bubrežnih cista i utjecala na visok udio tubula. Nasuprot tome, blaža neravnoteža Pkd1, kao što je haploinsuficijencija, dovela je do sporijeg napredovanja PKD s više fokalnih cista. Očigledni paradoksalan razvoj sličnog fenotipa putem suprotne disregulacije policistina{1}} mogao bi se objasniti zajedničkim rezultatom, naime relativnom neravnotežom koncentracije proteina koja bi mogla promijeniti formiranje ili funkciju aktivnog policistinskog multiproteinskog kompleksa. Uzeti zajedno, naši rezultati i rezultati drugih istraživača tvrde da je mehanizam formiranja cista u ADPKD (autosomno dominantnapolicistična bolest bubrega)vjerovatno će proizaći iz tri patogenetska mehanizma: povećanje funkcije, gubitak funkcije i efekti doziranja gena. Novi miševi SBPkd1TAG predstavljaju moćan model bubrežne cistogeneze koji može pružiti glavni uvid u patofiziologiju PKD(policistična bolest bubrega), Pkd1(policistična bolest bubrega 1)putevi transdukcije signala i partneri u interakciji. Proučavanje ovog modela također može dovesti do razvoja novih terapijskih strategija za obnavljanje normalne ravnoteže proteina unutar Pkd1 multimernog kompleksa.

REFERENCE

1. Blouin, MJ, H.Beauchemin, A.Wright, MEDe Paepe, M.Sorette, A.-M. Bleau.B. Nakamoto. C.-N, Ou, G. Stamatovannopoulos, i M. Trudel 2000. Genetička korekcija bolesti srpastih ćelija: uvidi pomoću transgenih mišjih modela. Nat. Med. 6:177-182.

2. Boulter, C., S.Mulroy, S.Webb, S. Fleming, K. Brindle i R. Sandford. 2001. Kardiovaskularni, skeletni i bubrežni defekti kod miševa sa ciljanim poremećajem Pkd1(policistična bolest bubrega 1)gene.Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 98:12174-12179.

3. Brasier, JL, i EPHenske.1997. Gubitakpolicistična bolest bubrega(PKD1) regija hromozoma 16p13 u stanicama bubrežne ciste podržava model gubitka funkcije za patogenezu ciste. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connors, WRDackowski, LRPetry, TJVan Raay, JM Millholland, M. Venet, G.Miller, RM Hakim, GMLandes, KW Klinger, F. Qian, LF Onuchic, T.Watnick, GG Germino i NA Doggett.1995. Analiza genomske sekvence zaautosomno dominantna policistična bolest bubrega(PKD1) gen predviđa prisustvo ponavljanja bogatog leucinom. Hum. Mol. Genet.4:575-582.

5.Chada,K, J.Magram, K.Raphael,G.Radice, E.Lacy i F.Costantini.1985. Specifična ekspresija stranog -globinskog gena u eritroidnim ćelijama transgenih miševa. Priroda 314:377-380.

6. Chauvet, V, F. Qian, N. Boute, Y. Cai, B.Phakdeekitacharoen, LF Onuchic, T.Attie-Bitach, L.Guicharnaud, O.Devuyst, GG Germino i M.-C. Gubler.2002. Ekspresija PKD1(policistična bolest bubrega 1)i PKD2(policistična bolest bubrega 2)transkripti i proteini u ljudskom embrionu i tokom normalnog razvoja bubrega. Am. J. Pathol 160:973-983.

7. Chauvet, V., X. Tian, ​​H.Husson, DHGrimm, T.Wang, T.Hiesberger, P. Igarashi, AM Bennett, O. Ibraghimov-Beskrovnava, S. Somlo i MJ Caplan.2004. Mehanički podražaji indukuju cijepanje i nuklearnu translokaciju policistin-1 C kraja. J. Clin. Investig. 114:1433-1443.

8. Cheadle, JPMP Reeve, JR Sampson i DJ Kwiatkowski.2000. Molekularno genetski napredak u tuberoznoj sklerozi. Hum. Genet.107:97-114. 9. Konzorcij, EPKD1993. Identifikacija i karakterizacija gena tuberozne skleroze na hromozomu 16. Ćelija 75:1305-1315.

10. Konzorcij, EPKD1994. Gen za policističnu bolest bubrega 1 kodira transkript od 14 kb i nalazi se unutar dupliciranog regiona na hromozomu 16. Ćelija 77:881-894.

11. Konzorcij, IPKD1995. Policistična bolest bubrega: kompletna struktura PKD1(policistična bolest bubrega 1)gen i njegov protein. Ćelija 81:289-298.

12. Couillard, M., R. Guillaume, N. Tanji, V. DAgati i M. Trudel.2002. c-myc-indukovana apoptoza kod policistične bolesti bubrega je nezavisna od FasL Fas interakcije. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, ME, i M. Trudel.1994. Transgeni SAD miš: model ljudske glomerulopatije srpastih ćelija. Kidney Int. 46:1337-1345.

14. Geng, L., Y. Segal, B. Peissel, N. Deng, Y. Pei, F. Carone, HGRennke, AM Glücksmann-Kuis, MC Schneider, M. Ericsson, STReeders i J.Zhou. 1996. Identifikacija i lokalizacija policistina, PKD1(policistična bolest bubrega 1)genski proizvod. J. Clin. Investig. 98:2674-2682.

15. Gong, S., XWYang, C. Li i N. Heintz.2002. Visoko efikasna modifikacija bakterijskih umjetnih hromozoma (BAC) korištenjem novih šatl vektora koji sadrže R6Ky porijeklo replikacije. Genome Res. 12;1992-1998.