Blagotvorni efekti ekstrakta Cistanche Tubulosa na poboljšanje niske crijevne permeabilnosti ehinakozida (ECH) i akteozida (ACT).
Mar 25, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Tadatoshi Taninoa, Noriaki Nagaib i Yoshinori Funakamib
* Fakultet farmaceutskih nauka, Univerzitet Tokushima Bunri, Tokushima i b Farmaceutski fakultet Univerziteta Kinki, Osaka, Japan
Abstract
CiljeviCilj ove studije bio je da se pozabavi korisnim efektimaCistanchetubulosaekstrakto poboljšanju niske crijevne permeabilnosti ehinakozida (ECH) i akteozida (ACT).MetodeApsorpcija ECH i ACT u ekstraktu C. tubulosa je okarakterisana korišćenjem monosloja ćelija Caco{0}} creva čoveka sa intaktnim jedinjenjima. Apsorpcija ECH i ACT zavisna od transportera glukoze potvrđena je in situ tehnikom intestinalne perfuzije.Ključni nalaziPrividna permeabilnost (Papp) nije se značajno razlikovala između intaktnog ECH i intaktnog ACT-a. U prisustvu floridzina, Papp ECH i ACT u visokoj dozi je smanjen na 20 posto u odnosu na odgovarajuću neliječenje, ali nije izmijenjen floretinom i verapamilom. Ekstrakt C. tubulosa u malim i visokim dozama povećao je Papp ECH i ACT (oba po tri puta), što je rezultiralo njihovim velikim učešćem u apsorpciji neovisnoj o transporteru glukoze ovisnom o natriju. Pri niskoj koncentraciji, floridzin je značajno potisnuo istovremene razine ECH i ACT u portalnoj krvi.ZaključakDijetalni i medicinski C.tubulosaekstraktpoboljšanje intestinalne apsorpcije ECH i ACT može poslužiti za bolje upravljanje ljudskim zdravljem, iako bi trebalo smanjiti uključenost transporta osjetljivog na floridzin.
Ključne riječiacteoside; monoslojevi Caco{0}} ćelija;Cistanchetubulosaekstrakt; ehinakozid; transporter glukoze osjetljiv na floridzin
Uvod
Koreni odCistanchetubulosatradicionalno se koriste za lijekove i hranu. Poznato je da ekstrakt C. tubulosa posjeduje farmakološke efekte u različitim bolestima mozga, funkcijama protiv starenja, metabolizmu masti i rastu kose.[1–4] Nedavno su iz C. tubulosa izolovani iridoidi, monoterpenoidi, feniletanoidni glikozidi i lignani. . [5,6] Feniletanoidni glikozidi, klasa polifenolnih jedinjenja, glavni su hemijski sastojci uCistanchevrste,[7] iako se njihove količine razlikuju među različitim vrstama. Ehinakozid (ECH; Slika 1) je jedan od glavnih feniletanoidnih glikozida u Herba Cistanchis. Hidrolizira se u akteozid (ACT; također se naziva verbaskozid) enzimima bakterijskog porijekla u debelom crijevu.[8,9] ECH i ACT posjeduju blagotvornu aktivnost hepatoprotekcije[10] i anti-inflamacije[11] kod životinja glodara. Iznenađujuće, visoko topiv u vodi ECH poboljšava ponašanje i neurohemijske rezultate kod mišjeg modela Parkinsonove bolesti i inhibira aktivaciju kaspaze-3 i kaspaze-8 u neuronima cerebelarne granule.[9] Dobro je poznato da krvno-moždana barijera striktno ograničava ulazak i distribuciju ksenobiotika u mozak iz krvi. Wu et al. [12] su također pokazali da se ACT rastvorljiv u vodi brzo distribuira u moždanim tkivima pacova. Zbog toga se ECH i ACT mogu transportovati u mozak, crijeva i jetru posebnim sistemom(ima).
Slika 1. Hemijske strukture ehinakozida i akteozida.
Iako postoje jaki dokazi koji ukazuju na to da je konzumacija ekstrakta C. tubulosa korisna za ljudsko zdravlje, propusnost čistog ECH kroz monoslojeve Caco{{0}} ćelija pri apikalnoj koncentraciji od 8,4 ± 1,6 ug/ml je jednak ili manji od paracelularnog transportnog markera manitola.[13] Kada se pacovima oralno daje čisti ECH (doza, 1{{10}}0 mg/kg), apsorpcija je izuzetno brza (Tmax, 15 min), a maksimalna koncentracija u serumu je veoma nizak (Cmax, 0.61 ± 0.32 ug/ml).[14] Apsolutna bioraspoloživost ECH je samo 0,83 posto. Slično, kada se Caco{15}} ćelije inkubiraju sa fenolnom frakcijom djelimično prečišćenom iz otpadne vode mlinova maslina, apsorpcija čistog ACT-a je brza s vršnom akumulacijom nakon 30 min i ukupnom efikasnošću akumulacije od 0,1 posto, što osigurava intracelularni nivoi 130 pmol/mg ćelijskog proteina.[15] Kod pacova, maksimalna koncentracija (0,13 ± 0,03 ug/ml) čistog ACT-a je postignuta u roku od 30 minuta nakon oralne doze sa 100 mg/kg[12], što implicira brzu intestinalnu apsorpciju. Oralna bioraspoloživost ACT-a, kao i ECH-a, prilično je niska (0,12 ± 0,04 posto), što ukazuje na mogućnost efekata prvog prolaska kroz crijevni trakt i jetru. U žuči štakora, metilacijski i glukuronidacijski konjugati ECH su glavni metaboliti,[16] iako je opseg metabolizma u jetri i dalje nejasan. Preliminarno smo utvrdili da su ECH i ACT prilično stabilni u homogenatima crijevne sluznice štakora i umjetne želučane kiseline (podaci nisu prikazani). Najar et al. [17] su pokazali da ACT inhibira aktivnost P-glikoproteina (P-GP)-ATPaze na način sličan verapamilu (reprezentativni inhibitor P-gp), što implicira modulator P-gp; međutim, neizvjesno je da li je ACT dostupan kao P-gp supstrat. Zanimljivo je da su nedavni nalazi flavonoid-D-glukozida u ishrani pokazali da protein rezistencije na više lijekova (MRP2) maskira natrijum-zavisni transporter glukoze (SGLT)1- posredovanje preuzimanja kvercetin 4′-O- -glukoze, [18,19] koji je odgovoran za vrlo lošu apsorpciju. Međutim, vrlo se malo zna o osjetljivosti polifenolnih glukozida na apsorpcione transportere, uključujući transportere glukoze. Informacije o karakteristikama apsorpcije kvercetin 4′-glukozida i ECH koji brzo propušta krvno-moždanu barijeru potaknule su nas da istražimo unos feniletanoidnih glikozida osjetljivih na prijenosnike u ekstraktu C. tubulosa u ishrani.
U ovoj studiji smo istraživali apsorpciju intaktnog ECH i ACT posredovanu transporterom glukoze koristeći monoslojeve ljudskih crijevnih Caco{1}} ćelija. Istovremeno, apsorpcijski transport ECH i ACT istovremeno u ekstraktu C. tubulosa u ishrani karakteriziran je in vitro modelom i in situ intestinalnim perfuzionim sistemom sa uzorkovanjem krvi iz portala, koji može lako razlikovati stepen apsorpcije i izbjegavanje hepatičnog prvog. -prolaz dispozicije.
Materijali i metode
Materijali
Netaknuti ECH i ACT bili su velikodušni pokloni od Eishin Trading Co., Ltd (Osaka, Japan). Floridzin i floretin su kupljeni od Tokyo Kasei Co., Ltd. (Tokio, Japan). Verapamil i p-kumarinska kiselina, korišćeni kao interni standardi za test tečne hromatografije visokih performansi (HPLC), dobijeni su od Sigma-Aldrich (St Louis, MO, SAD). Sve ostale korišćene hemikalije bile su analitičkog kvaliteta i komercijalno dostupne.
Biljni materijal i priprema metanolnog ekstrakta
C. tubulosa (SCHRENK) R. WIGHT (Orobanchaceae) je višegodišnja parazitska biljka koja raste na korijenu vrsta Salvadora ili Calotropis, a rasprostranjena je u sjevernoafričkim, arapskim i azijskim zemljama. Osušene stabljike C. tubulosa su u prahu i ekstrahovane tri puta metanolom pod refluksom 3 h. Isparavanje rastvarača pod sniženim pritiskom dalo je metanolni ekstrakt. Metanolni ekstrakt (komercijalna kvaliteta, serija br. 20070130;
registarski trgovački naziv, Sabaku Ninnjinn Kanka) bio je velikodušan poklon od Eishin Trading Co., Ltd preko Muraoka i Morikawa (Univerzitet Kinki, Japan), a botaničku identifikaciju izvršio je profesor Jia Xiaoguang u Xinjiang Institutu za tradicionalni kineski i Ethnologic Medicines.
Analiza biljnih ekstrakata: hromatografija
Odredili smo sadržaj ECH i ACT u ekstraktu C. tubulosa (serija br. 20070130) pomoću HPLC analize opisane u nastavku. Dobijeni podaci prikazani su u tabeli 1.
Ćelijska kultura
Ćelije Caco{{0}}, kupljene iz Američke kolekcije tipskih kultura (ATCC, Rockville, MD, SAD), korištene su na pasusima 38–53. Uzgajani su u medijumu kulture koji se sastojao od Dulbeccove modifikovane Eagleove podloge (DMEM, Nacalai Tesque Co., Kjoto, Japan) sa dodatkom 0.1 mM neesencijalnih aminokiselina, 10 procenata toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma, 100 U/ml penicilina G i 0,1 mg/ml streptomicin sulfata.
Transportne studije
Caco{0}} ćelije su postavljene gustoćom od 6,4 × 103 ćelija/cm2 na polikarbonatnim filterima. Jednoslojevi su korišteni za transportne eksperimente 21-25 dana nakon sjetve. Netaknuti ECH i ACT koji su bili ekvivalentni svom sadržaju uCistanchetubulosa ekstrakt(4.5 and 13.5 mg/ml) were mixed with DMEM medium containing 0.5% dimethylsulfoxide to maintain the integrity of the cell monolayer over the periods of the experiments. Intact ACT equivalent to ECH content in the extract was also dosed in the incubation medium. The extract was suspended in a DMEM medium and was centrifuged to remove insoluble components. Supernatants were loaded to the apical side. At the indicated times, an aliquot of the incubation medium was withdrawn from the basolateral side and was mixed with acetonitrile containing an internal standard for the assay. In separate experiments, phloridzin (fifinal concentration, 1 mM) and verapamil (fifinal concentration, 0.2 mM) was added to the apical side of the monolayer; however, phloretin (fifinal concentration, 0.3 mM) was treated on both sides of the monolayer. The integrity of monolayers was monitored by transepithelial electrical resistance (TEER) using Millicell-ERS (Millipore, Bedford, MA, USA) before and after transport experiments. TEER values of monolayers used were >300 Ω·cm2.
In-situ intestinalna perfuzija
Mužjaci Wistar pacova (23{{20}}–250 g) su dobijeni iz SLC Japan (Hamamatsu, Japan). Životinje su bile smještene u klimatiziranoj prostoriji u ciklusu svjetlo/mrak od 12 sati 1 sedmicu prije upotrebe. Pacovi su hranjeni standardnom laboratorijskom hranom (Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio, Japan) s vodom ad libitum i gladili su preko noći prije testa. In situ studija recirkulacije perfuzije izvedena je prema modificiranoj proceduri koju su opisali Mihara et al. [20] Ukratko, pacovi su anestezirani 25-postotnom otopinom uretana (1 mg/kg) kako bi se izbjeglo smanjenje krvnog tlaka. Napravljena je srednja abdominalna incizija i otkriveno je tanko crijevo. Žučni kanal je podvezan kako bi se izbjeglo izlučivanje žuči u perfuzat. Cijelo tanko crijevo kao jedan segment (od dvanaestopalačnog crijeva do ileuma) je ispirano normalnim fiziološkim rastvorom na 37 stepeni u trajanju od 10 minuta dok ispiranje nije postalo bistro. Staklene cijevi povezane sa silikonskim cijevima su zatim kanilirane u oba kraja tankog crijeva i pričvršćene koncem za šav. Zatim je tanko crijevo zamijenjeno u abdomenu, a kanile su spojene na peristaltičku pumpu. Portalna vena je kanulirana polietilenskom cijevi (PE10). Ekstrakt C. tubulosa koji je komercijalno dostupan suspendiran je u Krebs-Henseleit bikarbonatnom puferu (pH 7,4) da bi se dobila konačna koncentracija od 4,5 mg/ml i centrifugiran je 10 minuta na 8000 rpm da bi se uklonile nerastvorljive komponente. Supernatant u odsustvu ili prisustvu floridzina (1 mM) je sakupljen u rezervoar, koji je održavan na temperaturi od 37 ± 0,5 stepeni tokom eksperimenta. U naznačeno vrijeme, krv je uzeta kroz kanilu portalne vene. Nakon centrifugiranja uzoraka krvi, nastala plazma je deproteinizirana acetonitrilom koji je sadržavao interni standard i centrifugirana na 3000 rpm. Supernatanti su upareni, a ostatak je otopljen mobilnom fazom koja se sastojala od acetonitrila i 0,5 posto sirćetne kiseline. Pomešani rastvor je stavljen na HPLC kolonu. Pacovi su korišteni u skladu sa etičkim procedurama u skladu sa Smjernicama za njegu i korištenje laboratorijskih životinja koje su izdala japanska vlada i Kinki Univerzitet.
HPLC analiza
HPLC analiza je izvršena na sistemu opremljenom Shimadzu SPD{{0}}A, UV detektorom, Shimadzu LC-10A pumpom i Shimadzu C-R4A hronotopskim integratorom (Kjoto, Japan). ECH i ACT su razdvojeni pomoću Inertsil ODS kolone (5 μm, 4,6 × 150 mm, GL Sciences Inc., Osaka, Japan). Korištena je mobilna faza acetonitrila i 0,5 posto sirćetne kiseline u omjeru 15:85 (v/v) pri brzini protoka od 1,0 ml/min. Detekcija je izvršena na 334 nm.
Kinetička analiza
Koeficijenti prividne permeabilnosti (Papp) procijenjeni su iz nagiba linearnog dijela vremenskog toka transporta jedinjenja kroz monoslojeve Caco{0}} ćelija, kako slijedi:
Papp{{0}} （dQ/dt）/ A1C0)
gdje je dQ/dt stopa permeabilnosti, C0 je početna koncentracija otopljene tvari u donorskoj komori, a A je površina membrane (4,7 cm2).
U studiji intestinalne perfuzije kod štakora, površina ispod krive koncentracije u plazmi-vrijeme (AUC0-90) u portalnoj veni od nulte do posljednjeg mjerenja izračunata je prema linearnom trapezoidnom pravilu.
Fizičko-hemijska svojstva
Polarna površina i nepolarna površina jedinjenja izračunate su pomoću programa SAS (verzija 0.8, Olsson, T.; Sherbukhin, V., Synthesis and Structure Administration, 1997–2001, AstraZeneca, Cary , NC, SAD). Eksperimentalno određene vrijednosti log P i pKa dobijene su iz literature.
Statistička analiza
Podaci su analizirani jednosmjernom analizom varijanse praćeno Tukeyjevim posthoc testom. Vrijednosti vjerovatnoće manje od 5 posto smatraju se značajnim.
Rezultati
Apsorptivni transport ehinakozida i akteozida kroz monoslojeve Caco{0}} ćelija
Kod miševa i pacova, intaktni ECH[1{{20}},14] i ACT[12,21] se daju oralno u dozama od 100–1{{ 39}{{41}0 mg/kg. Korišteni ekstrakt C. tubulosa sadržavao je približno 30 posto ECH i 15 posto ACT po dozi. Budući da je ekstrakt promijenio osmotski pritisak i pH u inkubacionom mediju, koncentracije od 4,5 i 13,5 mg/ml određene su na osnovu oralne doze (neoštećena jedinjenja: 2–20 mg/20 g tijela težina) kod miševa. Ekstrakt u malim (4,5 mg/ml) i visokim dozama (13,5 mg/ml) sadržavao je 2,0 i 6,1 mg za ECH i 1,0 i 3,0 mg za ACT, respektivno. Primijenili smo količine ekstrakta C. tubulosa koje su bile mnogo manje od oralnih doza ECH i ACT prijavljenih kod ljudi (preporučena količina ekstrakta u ishrani: 150 mg koji sadrži približno 45 mg za ECH i 22,5 mg za ACT). Pri niskim i visokim dozama intaktnih spojeva, profili apsorpcije (Slika 2) i Papp nisu se značajno razlikovali između ECH i ACT kao ECH ekvivalenta (Tabela 2). Kada je ekstrakt C. tubulosa u visokoj dozi od 13,5 mg/ml stavljen u podlogu, Papp vrijednosti (1,27 ± 0,13 i 0,34 ± 0,03 × 10-6 cm/s, respektivno) ECH i ACT pratećih komponenti bile su tri puta veće od onih (0,38 ± 0,09 i 0,10 ± 0,03 × 10−6 cm/s, respektivno) intaktnog ECH i ACT (Tabela 2). Ekstrakt je, za razliku od intaktnih spojeva, značajno poboljšao transport apsorpcije ECH i ACT.
Slika 2 Apsorptivni transport ehinakozida i akteozida kroz monoslojeve Caco{1}} ćelija u transwell sistemu. Praćen je apikalni do bazolateralni transport. Zatvoreni simboli su ehinakozid (krug) i akteozid (kvadrat).Cistanchetubulosaekstrakt doziran pri niskim i visokim koncentracijama od 4,5 (a) i 13,5 mg/ml (b). Otvoreni simboli su netaknuti ehinakozid (krug) i netaknuti akteozid (kvadrat) koji odgovaraju sadržaju ehinakozida i akteozida uCistanchetubulosaekstraktdozirano, respektivno. Intaktni akteozid (otvoreni trougao) je takođe stavljen u medijum kao doza ekvivalentna intaktnom ehinakozidu (otvoreni krug). Rezultati su dati sa standardnim devijacijama (n=3).
Inhibitorni efekat floridzina, floretina i verapamila
To characterize the intestinal absorption of ECH and ACT, Caco-2 cell monolayers were incubated with representative inhibitors. Apical glucose transporter 1-sensitive phloridzin dramatically reduced the Papp of intact ECH and ACT to 20% of non-treatment at the high dose (Table 2). Basolateral glucose transporter (GLUT) 2-sensitive phloretin did not decrease the transport of intact ECH and ACT (Figure 3). In this study, higher concentrations (>0.3 mM) floretina nije bilo moguće koristiti zbog primjetne toksičnosti za ćelije. Osim toga, P-gp je identificiran kao važan igrač odgovoran za interakciju između biljnih lijekova i klinički važnih supstrata P-gp. Verapamil nije poboljšao apsorptivni transport intaktnih jedinjenja (Slika 3).
Apsorptivni transport ECH i ACT u ekstraktu (niska doza) značajno je inhibirao floridzin (Tabela 2 i Slika 4). Ekstrakt u visokoj dozi potisnuo je inhibiciju osjetljivu na floridzin, iako je transport intaktnog ECH i ACT bio osjetljiviji na floridzin (Tabela 2).
Slika 3. Efekat floretina i verapamila na apsorptivni transport intaktnog ehinakozida i akteozida. Apikalni prema bazolateralnom transportu praćen je nakon primjene intaktnog ehinakozida koji odgovara sadržaju ehinakozida u ekstraktu od 13,5 mg/ml na apikalnoj strani (n=3). Akteozid (zatvoreni kvadrat) je u doziranju bio ekvivalentan intaktnom ehinakozidu (zatvoreni krug) u odsustvu inhibitora (n=3). Otvoreni i zatvoreni dijamanti pokazuju transport u prisustvu 0.2 mM verapamila i 0.3 mM floretina, respektivno. Eksperimenti inhibicije su izvedeni u duplikatu.
In situ studija intestinalne perfuzije
U in situ studiji, testirali smo da li su ECH i ACT u ekstraktu C. tubulosa transportovani pomoću SGLT1 koji se nalazi na apikalnoj strani tankog creva. Kada je dijetalni ekstrakt u maloj dozi (4,5 mg/ml) bio perfuziran, ECH i ACT su se brzo pojavili u krvi portala (Slika 5). AUC je određen kao 2702,8 ± 384,1 μm·min za ECH i 698,3 ± 197,2 μm·min za ACT. Nakon što je AUC normalizovan sadržajem ekstrakta C. tubulosa, apsorbovana količina se nije značajno razlikovala između ECH i ACT. SGLT1-osetljivi floridzin, za razliku od floretina, značajno je potisnuo apsorptivni transport istovremenih ECH (AUC, 649,4 ± 248,2 μm·min) i ACT (nije detektovan).
Diskusija
Neki biljni sastojci su supstrati P-gp visoko izraženog u jetri, crijevima, mozgu i bubrezima. P-gp je odlučujući faktor za in vivo bioraspoloživost, dispoziciju i distribuciju biljnih lijekova, uključujući gospinu travu, kurkumin, ehinaceju, ginseng, ginko i đumbir.[22,23] Bioraspoloživost genisteina{{5} }glukozid, derivat flavonoida, takođe je bio ograničen intestinalnim MRP2 transporterom.[24] Stoga je ova studija osmišljena kako bi se istražila svojstva apsorpcije ECH i ACT istovremeno u dijetetskom i medicinskom ekstraktu C. tubulosa.
Polarizirani monoslojevi Caco{{0}} ćelija, kao i crijeva,[25], eksprimiraju glavne intestinalne transportere efluksa lijekova, kao što su P-gp, MRPs i protein otpornosti na rak dojke.[26] Pokazalo se da dijetalni flavonoidi kvercetina[27] i miricetina[28] inhibiraju P-gp-posredovani efluks kako u ćelijskim linijama tako i na životinjskim modelima. Verapamil, inhibitor P-gp, nije promijenio permeabilnost ACT-a i ECH-a kroz monoslojeve Caco{9}} ćelija (Slika 3), što ukazuje da intaktni ECH i ACT nisu bili ograničeni P-gp effluks pumpom. Naše prethodne studije su pokazale da proteini MRP2 nisu eksprimirani u monoslojevima Caco{13}} ćelija.[29] P-gp i MRP{16}}posredovani efluks bi se mogao isključiti u ECH i ACT transportu. Neki glikozidi kvercetina sa niskom lipofilnošću su se efikasnije apsorbovali od samog kvercetina.[30] Takođe je važno napomenuti da se ACT sa šećernom grupom brzo distribuira u moždanim tkivima. Naša pažnja je usmjerena na kombinirano djelovanje dva transportera glukoze u enterocitima: SGLT u membrani četkice i olakšani difuzijski transport glukoze (GLUT) u bazolateralnoj membrani. Ćelijska kultura Caco-2 može se koristiti kao model za proučavanje GLUT2 osjetljivog na floretin i transportera SGLT1 i 2 koji je osjetljiv na floridzin.[31–34] Glukoza se transportuje od apikalne do bazolateralne strane Caco{{27. }} monoslojevi velikom brzinom sa Papp od 36,8 ± 1,1×10−6 cm/s.[35] Posjeduje veći Papp od transcelularnog transportnog markera propranolola (23,4 ± 2,8 × 10-6 cm/s). Kao što je prikazano u Tabeli 2, intaktni ECH i ACT su imali mnogo niži Papp od onog prijavljenog za glukozu i pasivni propranolol. Izračunali smo logaritam koeficijenta podjele (oktanol-voda), log P, je izračunato na −2.32 i 0.077 za ECH i ACT, respektivno. Vjeruje se da se polarna ili hidrofilna jedinjenja transportuju paracelularnim putem (preko uskih spojeva). Čini se da se dva feniletanoidna glikozida, poput manitola, transportuju paracelularnim putem. Međutim, floridzin je dramatično smanjio apsorpcionu permeabilnost intaktnog ECH i ACT (Tabela 2), što sugerira da apikalni SGLT1 igra glavnu ulogu u crijevnoj apsorpciji intaktnog ECH i ACT. U ekvivalentnoj dozi, veća hidrofobna ACT permeabilnost bila je blizu ECH permeabilnosti (Slika 2 i Tabela 2). Yoshikawa et al. [36] su pokazali da su fasilitativni transporteri (GLUT 1 i 2), kao i SGLT1 osjetljivi na floridzin, intenzivno eksprimirani u tankom crijevu. Pošto su apsorbovane količine jedinjenja zasnovane na ravnoteži mase između unosa i eliminacije, procenili smo učešće GLUT2. Glukoza prelazi apikalne membrane enterocita pomoću SGLT1 sa visokim afinitetom i malim kapacitetom i izlazi preko bazolateralne membrane kroz GLUT2 sa niskim afinitetom i visokim kapacitetom. Floretin (specifični inhibitor GLUT2) nije ukinuo transport intaktnog ECH i ACT (Slika 3). Funes et al. [37] su pokazali da ACT snažno interaguje sa fosfatnim grupama fosfolipidnih membrana. Kako su hidroksilne grupe u izobilju u ACT strukturi, najvjerovatnije interakcije su vodonične veze između ovih grupa i polarnih glava glicerola ili fosfatnih grupa fosfolipida. Kada su intaktni ECH i njemu ekvivalentni ACT inkubirani sa Caco{62}} monoslojevima tokom 11 sati, ćelijska akumulacija ACT-a (0,24 ± 0,04 nmol/cm2) bila je tri puta veća od ECH (0,07 ± 0,01 nmol/cm2). Mislili smo da su SGLT{74}} osjetljivi ECH i ACT polako premješteni iz enterocita u krvotok, što je vjerovatno dovelo do niskog uočenog Papp-a. U poređenju sa visoko hidrofilnim ECH, niska permeabilnost ACT-a može biti posledica interkalacije u ćelijske membrane.
Polifenolna jedinjenja se konzumiraju u biljnim mešavinama tokom kliničke primene i komercijalno su dostupna kao dodaci ishrani. U in-vitro studiji je pokazano da na apsorpciju fenolnog epikatehina nije utjecao sastav sastojaka materijala za hranu za piće.[38] Nasuprot tome, matrice proizvoda Hypericum perforatum L. utiču na transport kvercetin glukozida (rutina i izokvercitrina) i hiperozida kroz Caco-2 ćelije zbog razlika u fitokemijskom sastavu matriksa i karakteristikama transporta, tj. paracelularnom prijenosu i prijenosu posredovanim nosačem ili aktivnim transport.[39] U ovoj studiji, C. tubulosa je osigurala trostruko veći transepitelni transport od intaktnih ECH i ACT (Slika 2 i Tabela 2). Nagađamo da komponente u ekstraktu C. tubulosa aktiviraju transporter osjetljiv na floridzin i/ili ubrzavaju eliminaciju intracelularnog ECH i ACT. Činilo se da ekstrakt C. tubulosa u visokim dozama uvelike maskira moć transporta osjetljivog na floridzin (Tabela 2). Dijetalni ugljikohidrati[40] i proteini[41] stupaju u interakciju s nekim polifenolima u gastrointestinalnom traktu. Morikawa et al. [10] su pokazali da se pet iridoida, kankanozida AD i kankanola, monoterpenskog glikozida, kankanozida E, dva feniletanoidna oligoglikozida, kankanozida F i G, i aciliranog oligošećera, kankanoze, može izolovati iz ekstrakta C. tubulosa koji se trenutno koristi. Ostali sastojci, uključujući proteine u ekstraktu C. tubulosa, ostaju nejasni. Zajedno sa gornjim spekulacijama, osmišljeni smo da ispitamo da li druge komponente stupaju u interakciju sa SGLT1 i inhibiraju apsorpciju ECH i ACT.
In-vivo experiments cannot easily distinguish between the extent of absorption and avoidance of first-pass disposition through the liver. The in-situ intestinal perfusion model has an advantage over in-vivo and in-vitro models due to the easy control of experiment parameters exclusion of the impact of other organs and maintenance of an intact intestinal blood supply.[22] The involvement of the phloridzin-sensitive glucose transporter was evaluated in an in-situ intestinal perfusion system. As shown in Figure 5, absorbed amounts of ECH and ACT concomitants in C. tubulosa extract (low dose) were greatly abolished by phloridzin, which agrees with our in-vitro data (Figure 4). Using peptides and 20 drugs passively absorbed, a good correlation is obtained between in-vivo drug absorption and the drug permeability of Caco-2 monolayers.[42] Drugs with a Papp of >1 × 10−6 cm/s se potpuno apsorbuju kod ljudi, dok se slabo apsorbuju lekovi i peptidi (<1% of="" dose)="" have="" papp="" values="" of=""><1 ×="" 10−7="" cm/s.="" surprisingly,="" the="" papp="" of="" the="" ech="" concomitant="" (high="" dose)="" was="">1 × 10−6 cm/s (Tabela 2), što ukazuje na visoku oralnu bioraspoloživost kod životinja i ljudi. Crespy et al. [43] su pokazali da se efluks u in situ intestinalnoj perfuzionoj studiji nije značajno razlikovao između floridzina i floretina. Oni[44] su također pokazali da je oralna bioraspoloživost floridzina sa visokom osjetljivošću na SGLT1 bila samo 10 posto kod pacova. Buduće studije trebaju procijeniti bioraspoloživost i učinak prvog prolaska kroz jetru ECH istovremeno nakon oralne primjene dijetalnog ekstrakta u visokoj dozi. In-situ rezultati impliciraju da uzimanje ekstrakta C. tubulosa može poboljšati nisku oralnu apsorpciju intaktnog ECH i ACT.
Slika 4 Inhibitorni efekat floridzina na apsorptivni transport ehinakozida i akteozida uCistanchetubulosaekstrakt. Praćen je apikalni do bazolateralni transport. Zatvoreni krugovi i kvadrati su ehinakozid (a) i akteozid (b) u ekstraktu od 4,5 mg/ml bez floridzina, respektivno. Zatvoreni dijamanti pokazuju tretman sa 4,5 mg/ml ekstrakta uključujući 1 mM floridzina. Rezultati su dati sa standardnim devijacijama (n=3).
Slika 5. Vremenski tokovi koncentracija ehinakozida i akteozida u krvi portala tokom in situ recirkulacijske intestinalne perfuzije štakora. Kružni i kvadratni simboli su ehinakozid i akteozid.Cistanchetubulosaekstraktu koncentraciji od 4,5 mg/ml perfuziran je u odsustvu (zatvoreni simboli) ili prisutnosti (otvoreni simboli) 1 mM floridzina na 37 stepeni. Rezultati su dati sa standardnim devijacijama (n=3–4). *P < 0.05="" u="" odnosu="" na="" dijetetski="" ekstrakt="" u="" prisustvu="">
Zaključak
Dijetalni i medicinski ekstrakt C. tubulosa koji poboljšava crijevnu apsorpciju ECH i ACT može poslužiti za bolje upravljanje ljudskim zdravljem, iako bi trebalo smanjiti učešće transporta osjetljivog na floridzin.
Deklaracije Sukob interesa
Autor(i) izjavljuje(ju) da nema sukoba interesa za otkrivanje.
Finansiranje
Ovaj rad je djelimično podržan od strane Visokotehnološkog istraživačkog centra sa Univerziteta Kinki.
Priznanja
Autori se žele zahvaliti Osamu Muraoka (Kinki Univerzitet, Osaka, Japan) i Toshio Morikawa (Kinki Univerzitet, Osaka, Japan) za nabavkuCistanchetubulosaekstrakti čisti sastojci. Veoma smo zahvalni Masahiru Iwakiju (Univerzitet Kinki) na njihovoj podršci u studiranju.
Reference
1. Tanaka J et al. Efekat odCistanchetubulosa ekstraktna razne bolesti mozga. Stil hrane 21 2008; 12: 24–26.
2. Tanaka J et al. Funkcije protiv starenjaCistanchetubulosa ekstrakt. Stil hrane 21 2008; 12: 27–29.
3. Tanaka J et al. Funkcije ljepote i rasta koseCistanchetubulosaekstrakt. Stil hrane 21 2008; 12: 29–32.
4. Tanaka J et al. Efekat metabolizma mastiCistanchetubulosaekstrakt. Stil hrane 21 2008; 12: 30–33.
5. Yoshizawa F et al. Sastojci odCistanchetubulosaSchrenk (Hook) f.II. izolacija i struktura novog feniletanoidnog glikozida i novog neolignan glikozida. Chem Pharm Bull 1990; 38: 1927–1930.
6. Yoshikawa M et al. Feniletanoidni aminoglikozidi i acilirani oligošećeri sa vazorelaksantnom aktivnošću izCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 2006; 14: 7468–7475.
7. Tu PF et al. Analiza feniletanoidnih glikozida Herba cistanche metodom RP-HPLC. Yao Xue Xue Bao 1997; 32: 294–300.
8. Lei L et al. Metabolička regulacija feniletanoidnih glikozida iz Herbecistanchesu gastrointestinalnom traktu psa. Yao Xue Xue Bao 2001; 36: 432–435.
9. Geng X et al. Neuroprotektivni efekti ehinakozida u mišjem MPTP modelu Parkinsonove bolesti. Eur J Pharmacol 2007; 564: 66–74.
10. Morikawa T et al. Acilirani feniletanoidni aminoglikozidi sa hepatoprotektivnim djelovanjem iz pustinjske biljkeCistanchetubulosa. Bioorg Med Chem 2010; 18: 1882–1890.
11. Paola RD et al. Efekti verbaskozida, biotehnološki pročišćenih biljnim kulturama biljnih ćelija syringa Vulgaris, u modelu parodontitisa glodara. J Pharm Pharmacol 2011; 63: 707–717.
12. Wu YT et al. Određivanje akteozida uCistanchedeserticola i Boschniakia rossica i njena farmakokinetika kod štakora koji se slobodno kreću korištenjem LC-MS/MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2006; 844: 89–95.
13. Matthias A et al. Studije propusnosti alkilamida i konjugata kafeinske kiseline iz ehinacee korištenjem modela monosloja caco{1}} ćelija. J Clin Pharm Therapeut 2004; 29: 7–13.
14. Jia C et al. Određivanje ehinakozida u serumu štakora tečnom hromatografijom visokih performansi reverzne faze sa ultraljubičastom detekcijom i njegova primjena na farmakokinetiku i bioraspoloživost. J Chromatogr 2006; 844: 308–313.
15. Cardinali A et al. Verbaskozidi iz vode iz mlina masline: procjena njihove biodostupnosti i crijevnog unosa korištenjem in vitro sistema za varenje/kako{1}}. J Food Sci 2011; 176: H48–H54.
16. Jia C et al. Metabolizam ehinakozida, dobrog antioksidansa, kod pacova: izolacija i identifikacija njegovih bilijarnih metabolita. Drug Metab Dispos 2009; 37: 431–438.
17. Najar IA et al. Modulacija aktivnosti P-glikoprotein ATPaze nekim fitokonstituentima. Phytother Res 2009; 24: 454–458.
18. Walgren RA et al. Efluks dijetalnog flavonoida kvercetin 4′-beta-glukozida kroz monoslojeve ljudskih intestinalnih caco-2 ćelija putem apikalnog proteina povezanog sa višestrukom rezistencijom-2. J Pharmacol Exp Ther 2000a; 294: 830–836.
19. Walgren RA et al. Stanični unos dijetalne flavonoid kvercetin 4′-beta-glukozidaze natrijum-ovisnim transporterom glukoze SGLT1. J Pharmacol Exp Ther 2000b; 294: 837–843.
20. Mihara K i dr. Metabolizam prvog prolaza kroz crijevo eperizona kod pacova. Pharm Res 2001; 18: 1131–1137.
21. Isacchi B et al. Antihiperalgetička aktivnost verbaskozida u dva modela neuropatskog bola. J Pharm Pharmacol 2011; 63: 594–601.
22. Cook TJ et al. Intestinalna permeabilnost hlorpirifosa primjenom metode intestinalne perfuzije u jednom prolazu kod pacova. Toxicology 2003; 184: 125–133.23. Kumar YS et al. Interakcija biljnih lijekova posredovana P-glikoproteinom i citokromom P-450-. Metabol droga Drug Interact 2010; 25: 3–16.
24. Walle UK et al. Prijenos genistein{1}}glukozida putem CACO-2 ćelija crijeva čovjeka: potencijalna uloga za MRP2. Res Commun Mol Pathol Pharmacol 1999; 103: 45–56.
25. Ito K et al. Apikalna/bazolateralna površinska ekspresija transportera lijekova i njena uloga u vektorskom transportu lijekova. Pharm Res 2005; 22: 1559–1577.
26. Laitinen L et al. Ćelijske kulture Caco-2 u procjeni intestinalne apsorpcije: efekti nekih istovremeno primijenjenih lijekova i prirodnih spojeva u biološkim matricama. (Univerzitet u Helsinkiju, Finska, 2006.) Akademska disertacija, str. 1–66.
27. Scambia G et al. Kvercetin pojačava efekat adriamicina u MCF-7 ćelijskoj liniji humanog raka dojke otpornoj na više lijekova: P-glikoprotein kao moguća meta. Cancer Chemother Pharmacol 1994; 34: 459–464.
28. Choi DH et al. Utjecaj miricetina, antioksidansa, na farmakokinetiku losartana i njegovog aktivnog metabolita, EXP-3174, kod pacova: moguća uloga citokroma P450 3A4, citokroma P450 2C9 i P- inhibicija glikoproteina miricetinom. J Pharm Pharmacol 2010; 62: 908–914.
29. Tanino T et al. Prolijek paklitaksel-2′-etil karbonata može zaobići ćelijski efluks posredovan P-glikoproteinom kako bi povećao citotoksičnost lijeka. Pharm Res 2007; 24: 555–565.
30. Hollman PC et al. Apsorpcija dijetalnih glikozida kvercetina i kvercetina kod zdravih dobrovoljaca sa ileostomom. Am J Clin Nutr 1995; 62: 1276–1282.
31. Kellett GL et al. Difuzna komponenta intestinalne apsorpcije glukoze je posredovana glukozom indukovanim regrutacijom GLUT2 na membranu daske za četke. Biochem J 2000; 350: 155–162.
32. Matter K et al. Razvrstavanje endogenih proteina plazma membrane odvija se sa dva mjesta u kultiviranim ljudskim intestinalnim epitelnim stanicama (Caco-2). Cell 1990; 60: 429–437.
33. Mahraoui L et al. Prisustvo i diferencijalna ekspresija mRNA transportera SGLT1, GLUT1, GLUT2, GLUT3 i GLUT5 heksoze u klonovima Caco{6}} ćelija u odnosu na rast ćelije i potrošnju glukoze. Biochem J 1994; 298: 629–633.
34. Mesonero J et al. Ekspresija transportera fruktoze GLUT 5 zavisna od šećera u Cac-2 ćelijama. Biochem J 1995; 312: 757–762.
35. Walgren RA et al. Transport kvercetina i njegovih glukozida kroz Caco-2 ćelije epitela ljudskog crijeva. Biochem Pharmacol 1998; 55: 1721–1727.
36. Yoshikawa T et al. Komparativna ekspresija transportera heksoze (SGLT1, GLUT1, GLUT2 i GLUT5) kroz gastrointestinalni trakt miša. Histochem Cell Biol 2011; 135: 183–194.
37. Funes L et al. Učinci verbaskozida, fenilpropanoidnog glikozida iz limunove verbene, na membrane modela fosfolipida. Chem Phys Lipids 2010; 163: 190–199.
38. Neilson AP et al. Utjecaj sastava čokoladne matrice na biodostupnost kakao flavan{1}ola in vitro i biodostupnost kod ljudi. J Agric Food Chem 2009; 57: 9418–9426.
39. Gao S et al. Visoko promjenjivi sadržaji fenola u proizvodima gospine trave utiču na njihov transport u ljudskom crijevnom Caco-2 ćelijskom modelu: farmaceutska i biofarmaceutska osnova za standardizaciju proizvoda. J Agric Food Chem 2010; 58: 6650–6659.
40. Schramm DD et al. Učinci hrane na apsorpciju i farmakokinetiku kakao flavanola. Life Sci 2003; 73: 857–{4}}.
41. Laurent C et al. Vinska matrica bez etanola i polifenola stimuliše diferencijaciju ljudskih crijevnih Caco{1}} stanica. Utjecaj njihove povezanosti s ekstraktom sjemenki grožđa bogatim procijanidinom. J Agric Food Chem 2005; 53: 5541–5548.
42. Artursson P et al. Korelacija između oralne apsorpcije lijeka kod ljudi i prividnih koeficijenata propusnosti lijeka u ljudskim unutrašnjim epitelnim (Caco-2) ćelijama. Biochem Biophys Res Commun 1991; 175: 880–885.
43. Crespy V et al. Poređenje intestinalne apsorpcije kvercetina, floretina i njihovih glukozida kod pacova. J Nutr 2001a; 131: 2109–2114.
44. Crespy V et al. Bioraspoloživost floretina i floridzina kod pacova. J Nutr 2001b; 131: 3227–3230.