Tetrandrin ublažava ozljede podocita putem blokade signala kalpaina zavisne od kalcija

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Yin Ding, Xuanli Tang, Yuhui Wang, Dongrong Yu, Caifeng Zhu i Jin Yu*

Abstract

Pozadina:Podociti su postali ključna meta za intervencije u proteinuricibubregbolesti. Mnoge studije su izvijestile da prekomjerna ekspresija proteina 6 kationskog kanala prolaznog receptora (TRPC6) u ozljedi podocita povećava intracelularni Ca2 plus priliv i stimulira Ca2 plus-ovisnu proteazu kalpain-1 signalizaciju. Tradicionalni kineski lijek, tetrandrin, neselektivni blokator Ca2 plus kanala, dugo se koristi za liječenje kroničnihbubregbolest. Ovo istraživanje je imalo za cilj da istraži moguće mehanizme koji leže u osnovi antiproteinuričkih svojstava tetrandrina.

Metode:Istraživali smo učešće tetrandrina u Ca2 plus kalpain{1}} zavisnoj signalizaciji u mišjim podocitima i adriamicinom izazvanom nefropatijom pacova. Ciklosporin A (CsA) i U73122 su korišteni kao pozitivne kontrole. Ispitivana je vitalnost ćelije, citotoksičnost, koncentracija Ca2 plus, aktivnost kalpaina i nivoi ekspresije mRNA i proteina kalpain-1 signalnih puteva. Mjerene su kliničke i patološke promjene.

Rezultati:Tetrandrin je smanjio intracelularni Ca2 plus priliv u kultivisane TRPC6-podocite sa prekomjernom ekspresijom. U studijama in vitro i in vivo, primjena tetrandrina smanjila je aktivnost kalpaina i ekspresiju kalpaina-1 i obnovila ekspresiju nizvodnog Talina-1 i nefrina. U poređenju sa CsA, tretman tetrandrinom je pokazao superiorne inhibitorne efekte na aktivnost kalpaina i ekspresiju kalpaina{4}}.

Zaključci:Tetrandrin ima terapeutski potencijal u oštećenju podocita tako što blokira Ca2 plus aktivaciju kalpain{2}} signalnog puta. Tetrandrin je smanjio proteinuriju, poboljšao funkciju bubrega i ublažio patološka oštećenja bubrega.

Ključne riječi:tetrandrin, povreda podocita, tranzitorni potencijal receptora kationskog kanala protein 6, kalpain-1

Cistanche tubulosa sprječava bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobili uzorak

Pozadina

Podociti su preduvjet za održavanje selektivne permeabilnosti barijere glomerularne filtracije i strukturnog integriteta glomerula. Povreda podocita je tipično povezana s proteinurskim bubrežnim bolestima, uključujući fokalnu segmentalnu glomerulosklerozu (FSGS), membransku nefropatiju, bolest minimalnih promjena i dijabetičare.bubregbolest [1–4]. Zaštita i obnavljanje podocita od štetnih faktora predstavlja veliki izazov u uspješnom liječenju bolesti bubrega.

Podociti su visoko specijalizirane, terminalno diferencirane stanice smještene izvan bazalne membrane glomerula i koje karakteriziraju nožni procesi. Disfunkcija regulacije signalizacije kalcija u podocitima dovodi do dezorganizacije citoskeleta aktina podocita, oštećenja procesa stopala, poremećaja prorezne dijafragme i proteinurije. Protein 6 kationskog kanala sa potencijalnim receptorom (TRPC6), novi protein povezan sa prorezom dijafragme u podocitima, identifikovan je kao nespecifični Ca2 plus provodni jonski kanal [5–8]. Ekspresija glomerularnog TRPC6 je povećana kod mnogih nasljednih i stečenih proteinurijskih bolesti. Prethodne studije su izvijestile da prekomjerna ekspresija TRPC6 u podocitima izaziva superiorno povećanje intracelularnog Ca2 plus priliva, za koji se vjeruje da je odgovoran za ozljedu stanica podocita. Povećano opterećenje kalcijem unutar podocita aktivira nizvodne signalne puteve, uključujući kalpain-1, Talin-1, nefrin i kalcineurin, da modulira aktivnost ili ekspresiju ciljnih gena [9-12]. Fangji Huangqi Tang je klasična tradicionalna kineska medicina (TCM) za liječenje nefrotskog sindroma [13]. Sastoji se od šest biljaka: Radix Stephania Tetrandra (korijeni Stephania tetrandra), Radix Astragali (korijeni Astragalus membranaceus), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (korijeni Atractylodes macrocephaly), Radix Glycyrrhizalyzae of Glycyrrhizaberiasis (korijen Atractylodes macrocephaly), (korijeni Zingiber Officinale) i Fructus Ziziphi Jujubae (Fructus of Ziziphus jujuba) [1]. Tetrandrin, jedna od glavnih aktivnih komponenti Radix Stephania Tetrandra, neselektivnog blokatora Ca2 plus kanala, testiran je u kliničkim ispitivanjima i za njega je indicirano da ublažava proteinuriju i poboljšava funkciju bubrega [14, 15]. Prethodna studija je pokazala blokirajuće efekte tetrandrina na Ca2 plus zavisnu RhoA signalizaciju u podocitima [16], ali osnovni mehanizmi nisu razjašnjeni. Ovdje su razvijeni TRPC6-modeli prekomjerne ekspresije in vitro i in vivo. Nakon primjene tetrandrina, procijenjene su promjene u TRPC6-zavisnoj Ca2 plus signalizaciji, uključujući nizvodne ciljeve, kalpain-1, Talin-1, nefrin i kalcineurin. Kao pozitivne kontrole korišteni su ciklosporin A (CsA), inhibitor kalcineurina, koji se široko koristi u liječenju proteinurije) [17] i U73122, inhibitor otvaranja kanala TRPC6 [18].

Metode

Ćelijska kultura i konstrukcija plazmida

Uslovno besmrtne ćelije ćelijske linije mišjih podocita (MPC5), dobijene od profesora Petera Mundela (Mount Sinai School of Medicine, SAD), održavane su na 33 stepena radi proliferacije, a zatim prebačene na 37 stepeni radi diferencijacije. Ekspresijski plazmid TRPC6 je konstruisan kloniranjem pune dužine kodirajuće DNK sekvence TRPC6 gena u EcoRI/BamHI mesta pCDH-GFP-PURO vektora i upakovan u lentivirus. Kada su diferencirani i narasli do približno 80 posto konfluencije, podociti su zasijani pri gustini ćelija od 4×104 po cm2 i inkubirani u kombinaciji sa TRPC6-s prekomjernom ekspresijom lentivirusa. Za dalje eksperimente korišćena je stabilna ćelijska linija TRPC6, verifikovana korišćenjem TRPC6 proteina i ekspresije mRNA. Tus, MPC5 podociti su podijeljeni u tri grupe, normalnu kontrolnu (NC) grupu, grupu blanko lentivirusa (Lv-NC) i grupu sa prekomjernom ekspresijom TRPC6- (OverTRP).

Liječenje lijekovima in vitro stanicama i ispitivanje citotoksičnosti

Vijabilnosti ćelija se pristupilo pomoću testa Cell Counting kit{{0}} (CCK-8), prema uputstvima proizvođača. Ukupno 5000 MPC5 podocita po jažici je uzgajano u tri primjerka u 96-pločama. Ćelije su tretirane serijom CsA (0–2 μmol/L; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i tetrandrinom (0–40 μmol/L; Sigma Aldrich) na 37 stepeni tokom 48 sati. CCK-8 je zatim dodat u ploče (10 μL/bažirić), koje su zatim inkubirane u mraku 2 sata. Apsorpcija na 450 nm je mjerena pomoću čitača mikroploča (BioTek Instruments, SAD). Citotoksičnost je ispitana kvantificiranjem oslobađanja laktat dehidrogenaze (LDH) korištenjem kompleta za ispitivanje citotoksičnosti LDH-WST (Dojindo Laboratories, Japan). Kao pozitivna kontrola, ćelije su tretirane sa 10 μmol/LU73122 (Cal biochem, USA) na 37 stepeni tokom 10 minuta.

Ekstrakcija RNK i kvantitativna reverzna transkriptaza-polimeraza lančana reakcija (qRT-PCR)

Ukupna RNK je pripremljena iz kultiviranih ćelija ibubregtkiva korišćenjem RNAiso Plus reagensa (Takara, Japan) i reverzno transkribovano u cDNA PrimeScript™ RT Master Mix kit (Takara) prema protokolu proizvođača. qRT-PCR je izveden pomoću Power SYBR Green PCR Master Mixa (Thermo Fisher Scientific, Njemačka). Prajmerske sekvence ciljnih i referentnih gena navedene su u Dodatnoj tabeli S1. Podaci su prikupljeni korišćenjem ABI Prism 7900HT FAST PCR sistema u realnom vremenu. Relativna kvantifikacija ekspresije ciljnog gena je normalizovana korišćenjem komparativne 2-ΔΔCt metode. Kao interna kontrola korištena je gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH).

Western blotting

ukupni uzorci proteina su ekstrahovani iz kultivisanih ćelija ibubregmaramice. Koncentracije proteina određivane su korištenjem kompleta za analizu proteina BCA (Thermo Fisher Scientific). Uzorci su razdvojeni na 10% natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gelu i prebačeni na poliviniliden difluoridnu membranu. Membrana je zatim blokirana preko noći na 4 stepena primarnim antitelima, odnosno anti-TRPC6 (Santa Cruz, SAD), anti-cal pain-1 (Abcam, UK), anti-Talin-1 (Abcam) , anti-nefrin (Santa Cruz) i antikalcineurin (Abcam). Nakon ispiranja, membrana je inkubirana sa kozjim antizečjim IgG (H plus L; Jackson ImmunoResearch Laboratories, SAD). Membrana je također obrađena da detektuje GAPDH (Abcam) za jednako opterećenje. Te trake koje prepoznaje primarno antitelo su vizualizovane, a optička gustina proteinskih traka je analizirana korišćenjem softvera TanonImage (Tanon, Kina).

Određivanje citosolnog Ca2 plus u kultivisanim podocitima.MPC5 podociti su zasejani i tretirani tetrandrinom, CsA i U73122 tokom 48h, 48h, odnosno 10min. Podociti su zatim inkubirani sa RPMI-1640 dopunjenim sa 10μM Fluo-3AM (Dojindo Laboratories) 30 minuta u mraku. Nakon toga, odmah su isprani fiziološkim rastvorom puferiranim fosfatom, u kojem su održavani i pobuđeni na 488 nm. Relativna koncentracija citosolnog Ca2 plus jona procenjena je merenjem intenziteta fluorescencije korišćenjem Zeiss laserskog konfokalnog sistema za snimanje (Zeiss, SAD).

Mjerenje aktivnosti kalpaina

Aktivnost kalpaina je određena korištenjem Calpain Activity Assay Kit od Abcam Inc., prema protokolu proizvođača. Supernatant (150 uL) podocita ilibubregtkiva su uzeta u odgovarajućem puferskom rastvoru (145mmol/L Nacl, 100mmol/L Tris-HCL, pH7,3) i 0,15mLN-Succinil-Leu-Tyr-AMC (500 umol/L). Nakon 1-h inkubacije na 37 stepeni u mraku, uzorci su očitani pomoću fluorometra opremljenog sa ekscitacionim filterom od 360 nm i emisionim filterom od 440 nm.

Adriamycin-induced nefropatija (ADRN) model štakora Na osnovu Fermijeve aproksimacije veličine uzorka [19] i razlike proteinurije između kontrolne i modelne grupe u našim preliminarnim eksperimentima, određen je ukupan broj štakora potreban u našoj studiji. Ukupno 56 zdravih mužjaka Sprague-Dawley pacova, težine približno 200 g i starosti oko 8 sedmica (Zhejiang Institute of TCM), nasumično je podijeljeno u sedam grupa (n =8 pacova/grupa), odnosno ADR grupa, ADR plus grupa sa niskim dozama tetrandrina (4mg/kg/d), ADR plus grupa sa srednjim dozama tetrandrina (8mg/kg/d), ADR plus grupa sa visokim dozama tetrandrina (16mg/kg/d), ADR plus grupa tretirana CsA (30mg /kg/d), ADR plus srednja doza tetrandrina (8mg/kg/d) u kombinaciji sa grupom CsA (30mg/kg/d) i NC grupom. Pacovi u grupi modela i grupama za liječenje lijekovima anestezirani su intraperitonealnom injekcijom ketamin hidrohlorida (50 mg/kg), a dvije doze ADR-a (4 mg/kg) su ubrizgane u kaudalnu venu kako bi se razvio FSGS model pacova. Nakon 12 sedmica, uzorci urina štakora su prikupljani 24 sata pomoću metaboličkih kaveza, nakon čega je uslijedilo uzimanje krvi i žetvabubrezi. Uočena je klinička efikasnost, a mjerene su promjene u 24-h proteinima u urinu, albuminu u plazmi, serumskom kreatininu (Scr) i azotu u urinu (BUN) korištenjem komercijalno dostupnih dijagnostičkih kompleta sa automatskim hemijskim analizatorom (HITACHI 7180 ).

Sve eksperimentalne procedure koje uključuju upotrebu životinja odobrene su od strane Etičkog odbora za eksperimente na životinjama na Zhejiang institutu TCM-a (Tianmushan Road br. 132) i strogo su izvedene u skladu s principima navedenim u NIH Vodiču za brigu i korištenje laboratorijskih životinja .

Histološko bojenje, elektronska mikroskopija i analiza

Ratbubrezifiksirani su u paraformaldehidu, dehidrirani korištenjem niza stupnjevanih etanola i ugrađeni u parafin. Presjeci (5- μm-debljine) su obojeni hematoksilinom i eozinom (H&E) i Massonovim trihromom i pregledani pod optičkim mikroskopom. Bubrezi su perfuzirani i fiksirani glutaraldehidom, a zatim izrezani na 1-mm3 blokove tkiva za ugradnju epoksida. Elektronska mikroskopija je izvedena standardnim procedurama. Pet ultramikrografija je nasumično dobijeno od svakog uzorka. Stopa fuzije procesa stopala podocita (PFR) izračunata je korištenjem sljedeće formule: PFR ( posto )=∑LFP / ∑LBM×100 posto, gdje je ∑LFP ukupna dužina spojenog procesa stopala, a ∑LBM je ukupna dužina periferne kapilarne bazalne membrane (BM).

Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednja ± standardna greška mjerenja i analizirani pomoću SPSS 20.0 (IBM Statistics SPSS, SAD) i GraphPad Prism 6 za Windows (GraphPad Software Inc., SAD). Normalna distribucija je procijenjena qq dijagramima i SW testom. Podaci su pokazali normalnu distribuciju. Kada su upoređene dvije grupe podataka, primijenjen je t-test nezavisnih uzoraka. Razlike između tri ili više nezavisnih grupa su upoređene korištenjem jednosmjerne analize varijanse praćene Tukeyjevim post hoc testom. Statistički značaj je postavljen na str<>

Rezultati

Izbor optimalnih koncentracija i citotoksičnosti tetrandrina, CsA i U73122

CCK{{0}} test je korišten za otkrivanje vitalnosti ćelija. Kao što je prikazano na slikama 1a i b, maksimalna koncentracija od 10μmol/L tetrandrina i 0.1μmol/L CsA nije uticala na održivost MPC5 podocita. Test oslobađanja LDH dalje je potvrdio da 10 μmol/L tetrandrina i 0,1 μmol/L CsA tokom 48 sati nisu pokazali toksičnost, dok je 10 μmol/LU73122 tokom 10 minuta pokazalo očekivanu toksičnost (slika 1c). Stoga su naredni eksperimenti sa ćelijama koristili tetrandrin i CsA pri 10 μmol/L i 0,1 μmol/L, respektivno.

Tetrandrin je smanjio intracelularni Ca2 plus dotok u kultivisane MPC5 ćelije koje prekomerno eksprimiraju TRPC6

Koristeći plazmidnu transfekciju, uspješno je uspostavljen ćelijski model prekomjerne ekspresije TRPC6 u MPC5 podocitima. qRT-PCR i Western blot analiza su pokazali da su nivoi ekspresije TRPC6 u Over-TRP grupi značajno porasli u poređenju sa onima u NC i Lv-NC grupama (p<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

Fluorescentna slika (Slika 2c) i semi-kvantitativna analiza (Slika 2d) pokazuju da prekomjerna ekspresija TRPC6 pojačava intracelularni Ca2 plus priliv, dok nije bilo očiglednih razlika između NC i Lv-NC grupa. Deset ćelija OverTRP grupe je zatim tretirano eksperimentalnim lekovima. Grupe koje su prethodno tretirane lijekom (tetrandrin, CsA i U73122) imale su inhibitorne efekte na intracelularni Ca2 plus priliv (P<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

Učinci tetrandrina na aktivnost i ekspresiju kalpaina-1, kalcineurina, Talin-1 i nefrina u MPC5 stanicama

Pokazalo se da intracelularni Ca2 plus aktivira kalpain, Ca2 plus zavisnu cisteinsku proteazu i kalcineurin, Ca2 plus/kalmodulin zavisnu proteinsku fosfatazu. U skladu sa prethodnim zapažanjima, nivoi aktivnosti i ekspresije kalpaina i kalcineurina u grupi sa prekomernom TRP bili su veći od onih u NC i Lv-NC grupama (p<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0.05) i nefrin (str<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0.05; Slika 3f, g, j i k).

Gelovi i mrlje pune dužine uključeni su u dodatnu sliku S1.

Eksperimenti in vivo koristeći model ADRN pacova Da bi se karakterizirao odgovor na tetrandrinom posredovanu inhibiciju TRPC6/kalpain{2}} signalizacije in vivo, razvijen je model ADRN kod pacova. Profili ekspresije mRNA i proteina TRPC6 značajno su povećani u ADRN grupi u poređenju sa onima kod pacova hranjenih normalnom hranom (NC grupa; p<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

Tretman CsA nije blokirao aktivaciju kalpaina izazvanu prekomjernom ekspresijom TRPC6 (slika 4c), a efekat nije bio tako snažan kao tetrandrina na ekspresiju proteina bola u kalpainu-1 (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

Tretman sa CsA nije blokirao aktivaciju kalpaina izazvanu prekomjernom ekspresijom TRPC6 (slika 4c), a efekat nije bio tako snažan kao tetrandrina na ekspresiju proteina kalpain-1 (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

Nadalje, procijenjena je ekspresija Talin{0}} i nefrina (sl. 4h, i, l i m). I nivoi Talina-1 i nefrina su smanjeni kod ADRN štakora u poređenju sa onim u NC grupi (p<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

Gelovi i mrlje pune dužine uključeni su u dodatnu sliku S2.

Tetrandrin je potisnuo progresiju ADRN-a i spasio histopatologiju Učinak tetrandrina nabubregfunkcija kod Sprague-Dawley pacova tretiranih ADRN-om je naknadno procijenjena (slika 5a-d). Nije bilo početnih značajnih razlika u nivoima proteinurije 24-h, Scr i BUN među grupama. Dvanaest nedelja kasnije, nivoi 24h-proteinurije, Scr i BUN u ADRN grupi su statistički povećani, dok je nivo albumina u plazmi bio značajno smanjen, u poređenju sa onima u NC grupi (P<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0.05; podaci nisu prikazani).

Promjene u histomorfologiji prikazane su na slici 6. Kod ADRN pacova, H&E i Massonovo bojenje je pokazalo FSGS, tubulointersticijalnu fibrozu i infiltraciju bubrežnih intersticijskih inflamatornih stanica. Osim toga, elektronsko mikroskopsko snimanje glomerula otkrilo je jako izbrisane, ugojene i spojene procese stopala podocita sa 80-100 posto PFR podocita. Pacovi u podgrupama tetrandrina (grupe sa srednjim i visokim dozama) su imali manje lezija od ADR grupe različitog opsega, a poboljšanje u grupi sa visokim dozama nadmašilo je ono u grupi sa srednjom dozom. U grupama sa niskim, srednjim i visokim dozama tretiranih tetrandrinom, PFR podocita je bio 70 – 80 procenata, 50 – 60 procenata i 30 – 40 procenata, respektivno. Ovi podaci sugeriraju da je tetrandrin štitio od strukturnih oštećenja bubrežnih glomerula izazvanih primjenom ADR-a. Nije bilo značajnih razlika u patološkim promjenama pod svjetlosnim mikroskopom među grupama (visoke doze tetrandrina, CsA i tetrandrina u kombinaciji sa CsA). Dodatno, PFR podocita u ADRN grupi koja je tretirana CsA bila je ista kao u grupama koje su tretirane visokim dozama tetrandrinom.

Diskusija

Podociti postaju sve važniji kao meta za intervencije u FSGS i srodnim nefrotskim bolestima [20, 21]. Ovdje je, na osnovu in vitro i in vivo podataka, bilo tako

pokazali su da je zaštita podocita i antiproteinurički efekat tetrandrina, neselektivnog blokatora Ca2 plus kanala, posredovan inhibicijom intracelularnog Ca2 plus influksa i Ca2 plus-zavisne kalpain-1 signalne kaskade, uključujući Talin-1 , nefrin i kalcineurin. Tetrandrin je bio efikasniji nego u ometanju inhibicije kalpaina{7}}.

Prema prethodnim nalazima, podocitni TRPC6 je kanal koji uglavnom doprinosi promjenama Ca2 plus influksa u normalnim i patološkim stanjima [7, 22]. Opšte je poznato da aktivnost kalpaina zavisi od nivoa kalcijuma i da je povezana sabubregpovreda, posebno renalna anti-glomerularna povreda BM [10, 23]. Među 15 identifikovanih izoformi kalpaina, nedavno je pokazano da kalpain-1 povezuje aktivnost TRPC6 sa povredom podocita [24]. Izvještava se da kalpain-1 cijepa sidreni protein Talin-1 povezan s citoskeletom podocita i protein dijafragme proreza, nefrin, koji remeti integritet podocita i inducira tešku proteinuriju [8–12, 16]. Kalcineurin je fosfataza zavisna od Ca2 plus za koju je ranije dokazano da igra ulogu u podocitima ibubregfunkcija. Akumulirani dokazi sve više ukazuju na to da kalpain može cijepati i aktivirati kalcineurin na proteolitički način [25, 26]. Ova studija je stvorila modele prekomjerne ekspresije TRPC6 virusnom infekcijom u kultiviranim podocitima i injekcijom adriamicina kod SD štakora. U skladu s tim, pokazali smo da je TRPC6-posredovao Ca2 plus priliv aktivirao aktivnost kalpaina i ekspresiju kalpaina-1 člana porodice kalpaina. Povećani kalpain-1 je naknadno cijepao nizvodni Talin-1 i nefrin.

Tetrandrin je alkaloid ekstrahovan iz biljke tradicionalne kineske medicine i neselektivni je blokator Ca2 plus kanala. Ovdje je ponovo potvrđeno da tetrandrin inhibira prekomjernu ekspresiju TRPC6 i smanjuje priliv Ca2 plus u ćelije i pacove koji prekomjerno eksprimiraju TRPC6, kao što je prethodno dokumentirano [16]. Što je još važnije, ova studija se fokusira na interventni efekat tetrandrina na signalni put ovisan o kalcijumu. Uočeno je da, za razliku od CsA, tetrandrin smanjuje aktivnost neutralne proteaze (kalpain) aktivirane kalcijem. Nadalje, tetrandrin je smanjio ekspresiju porodice proteaza aktiviranih kalcijumom, kalpaina-1, i vratio smanjenu ekspresiju Talina{10}} i nefrina. U poređenju sa CsA, primjena tetrandrina je pokazala superiorne efekte na inaktivaciju kalpaina i smanjenu ekspresiju kalpaina-1. Ovi rezultati su pokazali da tetrandrin ima terapeutski potencijal u oštećenju podocita blokiranjem TRPC6-zavisne aktivacije kalpain{13}} signalnog puta.

Fosfolipaza C (PLC) je identificirana kao TRPC6-vezujući partner [27]. U73122 inhibira PLC tako da se stvara manje diacilglicerola i smanjuje se otvaranje kanala TRPC6 [18, 24]. U73122 je, dakle, korišten paralelno kao pozitivna kontrola, i pokazao je primjetan efekat u smanjenju intracelularnog Ca2 plus priliva, inhibiciji aktivnosti kalpaina i ekspresije kalpaina-1 u podocitima koji prekomjerno eksprimiraju TRPC6. Međutim, in vitro testovi citotoksičnosti su pokazali očiglednu toksičnost za podocite.

U ovoj studiji, nakon 12 sedmica injekcije ADR-a, ozbiljna proteinurija, hipoalbuminemija i povišeni nivoi BUN i Scr bili su evidentni kod pacova koji su tretirani ADR{1}}. Svetlosna mikroskopija otkrila je FSGS, tubulointersticijalnu fibrozu i infiltraciju bubrežnih intersticijskih inflamatornih ćelija kod ADRN štakora. Elektronska mikroskopija je pokazala široko rasprostranjeno brisanje procesa stopala. Podaci in vivo su dalje pokazali da terapija tetrandrinom može smanjiti proteinuriju, poboljšati funkciju bubrega i ublažiti progresiju glomeruloskleroze. Nakon tretmana tetrandrinom, patološke promjene pod svjetlosnim mikroskopom i elektronskim mikroskopom, 24-h proteinurija, albumin plazme, Scr i BUN kod ADRN pacova su značajno poboljšane u odnosu na one u NC grupi.

Inhibitor kalcineurina, CsA, dugo se koristi za liječenje proteinurijebubregbolesti [28]. Kalcineurin je klinički važan kao direktna meta imunosupresivnog lijeka CsA [17, 29]. CSA smanjuje ekspresiju kalcineurina i smanjuje nuklearni faktor aktiviranih T-ćelija posredovan kalcineurinom [30-32]. Nedavni dokazi podržavaju stabilizirajući učinak CsA na citoskelet aktina podocita, kao što je sinaptopodin, blokiranjem defosforilacije sinaptopodina posredovane kalcineurinom [17]. Također je pokazano da kalpain može cijepati i aktivirati kalcineurin na proteolitički način [25, 26]. Podaci iz ove studije su potvrdili da CsA inhibira aktivnost i ekspresiju kalcineurina jače od tetrandrina. Kao što je ranije objavljeno, čini se da CsA ne utiče direktno na aktivnost kalpaina.

Glavno ograničenje studije bio je neuspeh da se demonstrira efekat ovisan o dozi među podgrupama tetrandrina (grupe sa niskom dozom, srednjom dozom i visokom dozom). Jedno od mogućih objašnjenja moglo bi biti da je raspon doza koji smo koristili bio previsok za pacove. Osim toga, individualne razlike u eksperimentu na životinjama mogu biti znatno veće od razlika u dozama. Relativno mala veličina uzorka može smanjiti statističku moć. Stoga su potrebne daljnje studije koje uključuju znatno manje doze i odgovarajuću veličinu uzorka kako bi se utvrdio tačan raspon doze i učinak tetrandrina kod ARDN štakora.

Ukratko, u regulaciji signalnih puteva kalcijuma, tetrandrin je pokazao očigledan inhibitorni efekat na kalpain-1, dok je CsA direktno uticao na inhibiciju kalcineurina. Ovi nalazi sugeriraju da kombinirano liječenje tetrandrinom i CsA može utjecati na višestruke ciljeve kalcijumske signalne mreže kako bi se poboljšali klinički ishodi. Potvrđujuće studije su neophodne da bi se potvrdila ova zapažanja, kao i da bi se razjasnili mehanizmi sinergijskih efekata.

Skraćenice

FSGS: Fokalna segmentalna glomerularna skleroza; MCD: bolest minimalnih promjena; MN: Membranozna nefropatija; DKD: Dijabetičarbubregbolest; TRPC6: Protein 6 kationskog kanala potencijalnog receptora; Ca2 plus : Kalcijum; TCM: Klasična tradicionalna kineska medicina; Tet: Tetrandrin; CsA: ciklosporin A; Scr: Kreatinin u serumu; BUN: Azot u urinu iz krvi; PFR: Brzina fuzije procesa; BM: Bazalna membrana; ADRN: Adriamicin-indukovana nefropatija; PLC: Fosfolipaza C.

References

1. Garg P. Pregled biologije podocita. Am J Nephrol. 2018;47(Suppl 1):3–13.

2. Khalilpourfarshbaf M, Hajiaghaalipur F, Selvarajan KK, et al. Terapije bazirane na mezenhimalnim matičnim stanicama protiv oštećenja podocita kod dijabetičke nefropatije. Tissue Eng Regen Med. 2017;14:201–10.

3. Nagata M. Povreda podocita i njene posledice. Kidney Int. 2016;89:1221–30.

4. Pavenstädt H, Kriz W, Kretzler M. Cell biology of the glomerular podocite. Physiol Rev. 2003;83:253–307.

5. Riehle M, Büscher AK, Gohlke BO, et al. TRPC6 G757D mutacija gubitka funkcije povezana je sa FSGS. J Am Soc Nephrol. 2016;27:2771–83.

6. Ilatovskaya DV, Blass G, Palygin O, et al. NOX4/TRPC6 put u regulaciji kalcija u podocitima i oštećenju bubrega kod dijabetesne bolesti bubrega. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1917–27.

7. Reiser J, Polu KR, Möller CC, et al. TRPC6 je kanal povezan sa glomerularnim prorezom dijafragme potreban za normalnu funkciju bubrega. Nat Genet. 2005;37:739–44.

8. Huang H, You Y, Lin X, et al. Inhibicija signalnog puta TRPC6 ublažava ozljedu podocita uzrokovanu TGF- 1. Cell Physiol Biochem. 2017;41:163–72.

9. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Kalcijum zavisna proteaza Calpain-1 povezuje aktivnost TRPC6 sa povredom podocita. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–109.

10. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. Aktivacija i sekrecija kalpaina potiču glomerularnu ozljedu kod eksperimentalnog glomerulonefritisa: dokazi od kalpastatin-transgenih miševa. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–23.

11. Tian X, Kim JJ, Monkley SM, et al. Talin1 povezan s podocitima je kritičan za održavanje barijere glomerularne filtracije. J Clin Investig. 2014;124:1098–113.

12. Jiang L, Ding J, Tsai H, et al. Prekomjerna ekspresija prolaznog receptorskog potencijalnog kationskog kanala 6 u podocitima inducira preuređenje citoskeleta kroz povećanje intracelularnog Ca2 plus i RhoA aktivacije. Exp Biol Med (Maywood). 2011;236:184–93.

13. Liu X, Zhou QG, Zhu XC, et al. Skrining za potencijalne aktivne komponente Fangji Huangqi tanga u liječenju nefrotskog sindroma korištenjem integrirane metabolomike zasnovane na "korelaciji između kemijskih i metaboličkih profila". Front Pharmacol. 2019;10:1261.

14. Liu KC, Lin YJ, Hsiao YT, et al. Tetrandrin inducira apoptozu u ćelijama humanog nazofaringealnog karcinoma NPC-TW 039 stresom endoplazmatskog retikuluma i Ca2 plus/Calpain putevima. Anticancer Res. 2017;37:6107–18.

15. Wang YJ, He LQ, Sun W, et al. Optimizirani projekt tradicionalne kineske medicine u liječenju kronične bubrežne bolesti 3. faze: multicentrično dvostruko slijepo randomizirano kontrolirano ispitivanje. J Ethnopharmacol. 2012;139:757–64.

16. Yu J, Zhu C, Yin J, et al. Tetrandrin potiskuje prolazni potencijal receptora za oštećenje podocita izazvano prekomjernom ekspresijom proteina katjonskog kanala 6 preko blokade RhoA/ROCK1 signalizacije. Drug Des Devel Ther. 2020;14:361–70.