Terahercna spektroskopija visoke rezolucije termičke razgradnje plinskih produkata dijabetičke i nedijabetičke krvne plazme i peleta bubrežnog tkiva
Mar 28, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Abstract
značaj:Jedan od savremenih trendova u medicinskoj dijagnostici zasniva se na metabolomici, pristupu koji omogućava određivanje metabolita koji mogu biti specifičnosti bolesti. Gasna spektroskopija visoke rezolucije omogućava ispitivanje sadržaja gasnog metabolita u uzorcima biološkog porekla. Predstavljamo razradu metode proučavanja dijabetičkih i nedijabetičkih bioloških uzoraka, pripremljenih u obliku peleta, teraherc (THz) spektroskopijom visoke rezolucije.
Cilj:Osnovna ideja rada je proučavanje sadržaja gasnih produkata termičke razgradnje dijabetičkih i nedijabetičkih osušenihkrvna plazmaitkiva bubregaza otkrivanje skupa gasnih markera koji karakteriziraju dijabetes metodom THz spektroskopije visoke rezolucije.
pristup:Predstavljamo pristup proučavanju dijabetičara i nedijabetičarakrvna plazma(ljudi i pacovi) itkiva bubrega(pacovi), korišćenjem spektroskopije visoke rezolucije zasnovane na nestacionarnom efektu frekvencijskog opsega THz. Razvijene su metode pripreme uzoraka krvi i tkiva bubrega u obliku peleta i isparavanja uzoraka.
Rezultati:Mjerenja spektra rotacijske apsorpcije para pri zagrijavanju peleta pripremljenih od krvi ibubrežnog tkivaizvedene su u frekvencijskom opsegu od 118 do 178 GHz. Apsorpcione linije koje se pojavljuju u spektrima para uzorka su detektovane i identifikovane. Molekularni sadržaji proizvoda termičke razgradnje razlikovali su se za nedijabetičke i dijabetičke uzorke; npr. glavni marker je aceton koji se pojavljuje u krvi dijabetičara (ljudi i pacova) i kod dijabetičarabubrežnog tkiva.
Zaključci: Naš rad ilustruje potencijalnu mogućnost određivanja sadržaja metabolita u biološkim uzorcima za dijagnostiku i prognozu bolesti za kliničku medicinu. © Autori. Objavio SPIE pod Creative Commons Attribution 4.0 Unported License. Distribucija ili reprodukcija ovog djela u cjelini ili djelomično zahtijeva potpunu atribuciju originalne publikacije, uključujući njen DOI. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Ključne riječi: teraherc spektroskopija visoke rezolucije; termička razgradnja; tkivo;krvna plazma; dijabetes; liofilizacija.
Ključne riječi:teraherc spektroskopija visoke rezolucije; termička razgradnja; krvna plazma; dijabetes; liofilizacija, bubrežno tkivo.
1. Uvod
U današnje vrijeme problem dijagnostike društveno važnih bolesti (dijabetes, bolesti raka i dr.), uključujući i ranu fazu, izaziva veliku pažnju naučnih grupa u svijetu.Jedan od novih pristupa koji otvara nove mogućnosti u dijagnostici i liječenju različitih bolesti je metabolomika. Metabolomika je oblast nauke koja istražuje konačne i međuproizvode metabolizma biološkog sistema (ćelije, organa ili celog organizma). Metabolomika može otkriti metabolite koji mogu biti specifične karakteristike bolesti i mogu igrati veliku ulogu u dijagnozi i prognozi bolesti. Mediji, koji sadrže konačne i međuprodukte metabolizma u ljudskom organizmu i korisni za otkrivanje metabolita povezanih s bolestima i patologijama, su izdahnuti dah, krv, urin, pljuvačka itd.
Jedna od društveno važnih bolesti koja ugrožava kvalitetu života ljudi je dijabetes. Dijabetes melitus tip 2 je ranije bio bolest srednjih godina, a sada se dijagnosticira kod odraslih, mladih i djece. Rezultati metabolomskih istraživanja uzoraka krvi i urina pacijenata sa dijabetesom od 18 godina, kao i djece od 1 do 13 godina, predstavljeni su u bazi podataka humanog metaboloma (HMDB).1 Uglavnom, krv (21 hemijska supstanca uključujući izomere), urin ( Ispitivano je 30 hemijskih supstanci uključujući izomere) i cerebrospinalna tečnost (1 hemijska supstanca). Na primjer, (R)-3-hidroksibutirna kiselina je otkrivena u sve tri vrste tekućina. U obje tekućine (krvi i urinu) otkrivene su neke tvari (acetosirćetna kiselina, D-fruktoza i D-glukoza). Karakterističnija karakteristika dijabetesa (aceton, CH3COCH3) bila je prisutna samo za urin. Uzorci tečnosti, rezultati istraživanja predstavljeni u HMDB, istraženi su različitim metodama-gasnom hromatografijom;2 gasnom hromatografijom sa masenom spektrometrijom;3,4 gasno-tečnom hromatografijom sa masenom spektrometrijom;5 spektroskopijom visoke rezolucije nuklearne energije protonska magnetna rezonanca;6 i metode koje koriste posebne uređaje za praćenje stanja pacijenata sa dijabetesom, sistem za kontinuirano praćenje glukoze.7
Razvoj kronične bolesti bubrega glavna je komplikacija dijabetes melitusa. Iako je određivanje glikiranog albumina uobičajen pristup skriningu, oštećenje bubrega može početi mnogo prije nego što se pojave klinički značajne promjene u albuminu u urinu. S obzirom na multifaktorsku patogenezu hronične bubrežne bolesti, različiti markeri su razmatrani za njen skrining.8,9 Međutim, njihova dijagnostička vrijednost bez biopsije bubrega čini se upitnom.
Spektroskopski pristup može pružiti informacije o sadržaju bioloških uzoraka koji se mogu koristiti za medicinsku dijagnostiku. Frekvencijski opseg teraherca (THz) je veoma važan za proučavanje gasova, tečnosti i tkiva živih organizama. Postoje neki pregledi posvećeni primjeni metoda THz frekvencijskog opsega, uključujući THz spektroskopiju u vremenskom domenu, THz reflektometriju i THz snimanje za biologiju i medicinu.10
THz spektroskopija u vremenskom domenu omogućava detekciju spektra, gdje koeficijent apsorpcije ili indeks refrakcije ima neke spektralne karakteristike koje odgovaraju prisutnosti nekih biomolekula (proteina, šećera, itd.) u uzorcima ili njihovim različitim koncentracijama.11
Molekularna apsorpciona spektroskopija, a posebno THz gasna spektroskopija je vrlo obećavajući pristup za istraživanje višekomponentnih gasnih mešavina različitog porekla.12 Uzorci u tečnom i čvrstom stanju mogu se istraživati isparavanjem ili termičkom razgradnjom. Metaboliti-markeri društveno važnih bolesti (dijabetes, rak, itd.) mogu se otkriti po njegovim spektralnim linijama u apsorpcionim spektrima koji se vrše pri prenošenju zračenja kroz uzorke gasa.
Nivo acetona u uzorcima izdahnutog daha i urina uzetim od pacijenata sa dijabetesom (12 osoba) mjeren je spektrometrom terahercnog opsega sa faznim pomakom djelujućeg zračenja. Eksperimenti su rađeni u saradnji sa Nacionalnim medicinskim istraživačkim centrom Almazov. Mjerenja su obavljena na apsorpcionim linijama acetona sa centralnim frekvencijama od 150,537 i 151,647 GHz. Mjerenja su obavljena bez grijanja. Istovremenom analizom uzoraka izdahnutog daha i urina oboljelih od dijabetesa otkriveno je da je nivo acetona u urinu bio mnogo veći nego u izdahnutom dahu, u nekim slučajevima i za red veličine.13,14
Rezultati ispitivanja gasne spektroskopije visoke rezolucije THz zakrvna plazmapacijenata i pacova (uslovno zdravih i sa dijabetesom) kao i pacovabubrežnog tkiva(zdravi i dijabetičari) predstavljeni su sušeni i presovani u pelete. Markice ilikrvna plazmaživih organizama, bez ikakve pripreme, mora se ispitati odmah nakon uzorkovanja. Priprema u obliku peleta omogućava ispitivanje nakon dovoljno dugog vremena nakon uzimanja uzoraka krvi ili biopsije bubrega.
2 Eksperimenti i metodologija
2.1 Metoda za pripremu peleta krvne plazme i peleta za bubrege
Venska krv pacijenata sa dijabetes melitusom tipa 2 i uslovno zdravih učesnika prikupljena je u Endokrinološkom odeljenju Nacionalnog medicinskog istraživačkog centra Almazov; centar pruža medicinsku negu za dijabetičare. Tri pacijenta i dva učesnika bili su muškarci, odgovarajuće dobi (39 do 43 godine). Svi eksperimentalni protokoli korišćeni u ovom istraživanju pregledani su i odobreni od strane pacijenata i učesnika i Komisije za upotrebu Medicinskog centra. Venska krv je uzeta ujutro nakon 8 do 12 sati gladovanja u epruvetu sa antikoagulansom K3EDTA (Vacutest Kima, Italija). Plazma je dobijena za analizu biohemijskih parametara centrifugiranjem pune krvi na 3000 o/min u trajanju od 15 min u laboratorijskoj centrifugi (Eppendorf 5702R, Njemačka) na temperaturi od þ4 stepena. Vrijednosti biohemijskih parametarakrvna plazmauzorci i referentni intervali prikazani su u tabeli 1 (nivo glikiranog hemoglobina dobijen je u punoj krvi). Tabela 1 pokazuje da se koncentracija glukoze, triglicerida i glikiranog hemoglobina u uzorcima bolesnika sa dijabetesom povećava 1,5, 2, odnosno 2,3 puta.
Studija je provedena i na muškim pacovima Wistar u dobi od 8 sedmica i težine od 180 do 200 g, prema protokolu eksperimentalnih studija koji je odobrila Komisija za negu i upotrebu životinja Instituta za eksperimentalnu medicinu Nacionalnog medicinskog istraživačkog centra Almazov. Nivo glukoze kod životinja eksperimentalne grupe bio je 21 mmol ∕ l nakon 120 min nakon punjenja glukozom. Intaktni pacovi su korišteni kao kontrolna grupa. Venska krv je sakupljena iz donje šuplje vene prije nego što su životinje eutanazirane. Takođe, uzet je i bubreg. Uzorci krvi su sakupljeni u epruvete koje sadrže antikoagulans.
Testni uzorci su zamrznuti na temperaturi od −80 stepeni (hladnjak za niske temperature DW-86L388A, Haier, Kina). Zatim je liofiliziran sušenjem zamrzavanjem Vaco 2 (ZirBus, Njemačka) na temperaturi od −50 stepeni i pritisku od 3 Pa. Zamrzavanje se vrši prije liofilizacije, jer tokom liofilizacije pod uticajem visokog unutrašnjeg pritiska biološke komponente mogu biti uništen. Osušeni uzorci su bili sunđer koji se sastojao od bioloških kristala. Sunđer je uništen metalnom lopaticom i zdrobljen do kristala veličine nekoliko desetina mikrometara. Upotreba maltera i tučka je bila nemoguća, jer bi mlevenje proteina u sastavu uzoraka dovelo do njihovog neželjenog prianjanja i formiranja okruglih granula.
Prašak liofiliziranih uzoraka je izvagan (analitička vaga OHAUS Discovery, Švicarska) i zatim stavljen u čelični kalup za presu. Koristeći laboratorijske prese (Angkor, Rusija i Specac, UK) na određenom pritisku kalupa,krvna plazmadobijene su pelete i pelete za bubrege. Svaki kristal peleta sadrži određeni postotak masti (triglicerida), proteina (albumina) i fibrinogena – svi su normalni ili glikirani (u slučaju dijabetičara). Pelete uzoraka iz kontrolne grupe u daljem tekstu se nazivaju "nedijabetičke pelete", a pelete uzoraka izdijabetička grupa se u daljem tekstu naziva "dijabetička peleta".
Eksperimentalna postavka spektroskopije visoke rezolucije od 2,2 THz
THz spektroskopija visoke rezolucije zasnovana na nestacionarnim efektima omogućava analizu sastavnog sastava gasa i pare višekomponentnih gasnih mešavina. Spektrometri pružaju osjetljivost blizu teorijske granice sa rezolucijom ograničenom samo Doplerovim efektom i mogu snimiti brze procese. Osetljivost je očuvana čak i uz značajno smanjenje pritiska gasa i iznosi približno 0.2 ppb u režimu skeniranja za neke gasove (npr. amonijak na merenjima apsorpcione linije blizu frekvencije od 572 GHz). Osim toga, omogućava određivanje sastavnog sastava plinske mješavine sa visokom pouzdanošću.12 Istraživanje proizvoda termičke razgradnje peleta provedeno je metodom THz nestacionarne gasne spektroskopije u opsegu od 118 do 178 GHz. Spektrometar koristi fazno zaključanu petlju za automatsku kontrolu frekvencije lampe povratnog talasa i faznog pomaka, registraciju u vremenskom domenu, usrednjavanje i obradu spektroskopskog prelaznog signala. Uređaj registruje signal u vremenskoj domeni. Pare uzoraka analizirane su slijedećom procedurom. Pelete su stavljene u epruvetu, uz pomoć vakuum pumpe, postepeno zagrejana epruveta (do 240 stepeni) i dobijena mešavina proizvoda termičke razgradnje uzorka je puštena u mernu ćeliju. Datoteka podataka obično uključuje snimke odabranog ili ukupnog radnog opsega spektrometra. Stoga se supstance mogu identifikovati po apsorpcionim linijama koje se pojavljuju u ukupnom spektru uzorka, a dinamika koncentracija u smeši može se pratiti poređenjem nekoliko datoteka sa podacima. Supstance su identifikovane pretragom u otvorenim bazama podataka MW, mmw i THz.15,16
3 Analiza para krvne plazme i para bubrega pomoću terahertnog spektrometra visoke rezolucije
Sa našim THz-TDS sistemima mjerili smo prijenos peleta u spektralnom opsegu od 0.2 do 1.4 THz,17 ali znamo da biomolekule, a posebno produkti njihovog raspadanja u plinovitom stanju, imaju informativni odgovor (rotacijska apsorpcija spektri) na ovim frekvencijama i nižim, tako da smo izvršili dodatnu studiju na THz gasnom spektrometru visoke rezolucije. Otkrivene linije apsorpcije supstanci kod ljudi sa dijabetesomkrvna plazmapoklapaju sa supstancama ljudi koji nemaju dijabeteskrvna plazma, osim acetona. Postoji mnogo apsorpcionih linija acetona koje leže u opsegu radne frekvencije spektrometra (118 do 178 GHz). Obično je više nego dovoljno detektovati neku apsorpcionu liniju jedne supstance za nedvosmisleno određivanje prisustva supstance u višekomponentnoj gasnoj mešavini. Primjer snimanja dijelova apsorpcionih spektra sa apsorpcionom linijom acetona prikazan je na slici 1. Aceton se može pojaviti u krvi kod poremećaja metabolizma ugljikohidrata. Kao što se u literaturi navodi, krv pacijenata sa dijabetesom je sadržavala -OH-butirat i acetoacetat, ali su se kasnije te supstance razložile na aceton i ugljični dioksid.18 Ugljični dioksid nema dipolni moment; dakle, nema rotacionih prelaza. Njegov povećani sadržaj može se otkriti samo proučavanjem vibracionog spektra uzorka u IC opsegu.
Pare plazme, kao što su karbonil sulfid (OCS), sumpor dioksid (SO2), mravlja kiselina (HCOOH), izocijanska kiselina (HNCO) i amonijak (NH3), otkrivene su i u uzorcima dijabetičara i ljudi bez dijabetesa. U nekim slučajevima postoji jedna eksperimentalna linija otkrivena u spektrima uzorka koja odgovara više linija od jedne za jednu supstancu (npr. izocijansku kiselinu) u kataloškim podacima (vidi tabelu 2).15,16
To se objašnjava činjenicom da katalozi sadrže podatke o hiperfinim strukturama supstanci koje nisu razriješene u ovom eksperimentu jer linije imaju konačnu širinu reda nekoliko stotina kHz. Dobijene apsorpcione linije ispitivanih supstanci poklapaju se sa spektrom apsorpcije para kapilarne krvi ikrvna plazmapacijenata sa dijabetesom i uslovno zdravih učesnika koji su objavljeni u našem prethodnom radu.19 Otkrivene gasovite supstance mogle su da nastanu tokom pripreme uzorka kao produkti hemijske transformacije aminokiselina. Pitanje da li su ova jedinjenja od dijagnostičke vrednosti zahteva istraživanje. U kliničkoj praksi u dijabetologiji analiza sadržaja ovih supstanci još se ne koristi.
Isparenjakrvna plazmazdravih pacova su sadržavali karbonil sulfid (OCS), metanetiol (CH3SH), butironitril (C3H7CN), acetaldehid (CH3CHO) i mravlju kiselinu (HCOOH). Uzorak odkrvna plazmadijabetičkih pacova se razlikovala po prisustvu acetona. Pored apsorpcionih linija propionitrila (C2H5CN), detektovan je i metil format (CH3OCHO).
Uzorci para osušenih peleta zdravih i dijabetičkih štakoratkiva bubregasu proučavani. Isparenja odbubrežnog tkivazdravih pacova sadrže karbonil sulfid (OCS), sumpor dioksid (SO2), mravlju kiselinu (HCOOH), izocijansku kiselinu (HNCO), etil format (C2H5OCHO) i propilen glikol (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). Sadržaj pare dijabetičkog štakorabubrežnog tkivarazlikovao od zdravog štakora prisustvom ne samo karbonil sulfida (OCS) već i njegovog izotopola OCS-34. Acetaldehid (CH3CHO), metanetiol (CH3SH), etilen sulfid (C2H4S), metanol (CH3OH) i glikolaldehid (CH2ðOHÞCHO) takođe su otkriveni u parama peleta dijabetičnog štakorabubrežnog tkiva(vidi sl. 2 i sl. 3).
Prisustvo sumpornih jedinjenja, kao što je metanetiol, može se odrediti termičkom razgradnjom sumpornih aminokiselina (metionin, cistein i cistin) u sastavu proteina krvi. Metionin je esencijalna aminokiselina koja se ne sintetiše u ljudskim organizmima. Dobija se iz hrane i izvor je sumpora za biosintezu cisteina. Kada su sumporne aminokiseline zagrijane do temperature od oko 240 stepeni, u masenom spektru ovih supstanci otkriveni su metanetiol i etilen sulfid (razgradnja metionina).20
4 Zaključak
Molekularni sadržaj ljudi i pacovakrvna plazmai pacovabubrežnog tkivatokom termičke dekompozicije uzoraka proučavana je pomoću THz spektrometra visoke rezolucije. Prikazan je način pripreme bioloških uzoraka u obliku peleta. Ova metoda daje mogućnost skladištenja i transporta uzoraka. Gasna spektroskopija visoke rezolucije omogućava određivanje sadržaja višekomponentnih mešavina gasa bilo kog porekla, uključujući biološke sa koncentracijama u tragovima gasnih komponenti. Aceton je otkriven kod dijabetičarakrvna plazmauzorci. Informacije o razlici sadržaja dijabetičara i zdravihkrvna plazmamuškaraca i pacova i dijabetičara i zdravih štakoratkiva bubregaje dobiven iz apsorpcionih rotacijskih spektra para. Upotreba THz spektroskopije visoke rezolucije omogućava kvalitativnu analizu sadržaja komponenti uzoraka para krvi itkiva bubregapelet. Mogućnost izvođenja kvantitativne procjene koncentracija važnih gasnih markera dijabetesa u zavisnosti od stanja bolesnikatreba proučiti u daljim istraživanjima.
