Sinergistički protuupalni efekti Laminaria Japonica Fucoidan i ekstrakta Cistanche Tubulosa

Kao imuni odgovor protiv stranih antigena, makrofagi oslobađaju proinflamatorne citokine kao što su faktor nekroze tumora- (TNF-), interleukin-1 (IL- 1), IL-6 i drugi. Takvi citokini induciraju hemotaktički priliv granulocita, monocita, limfocita i mastocita u oštećeno tkivo što potiče uklanjanje antigena i oporavak tkiva. Međutim, prekomjerna infiltracija i aktivacija stanica pogoršava ozljede tkiva, što dovodi do edema (vaskularne eksudacije) i bola koji su dobro poznati fenomen upale.

TNF- je važan faktor za indukciju ekspresije gena sintaze dušikovog oksida (iNOS) u nekoliko ćelijskih linija. Aktivacija iNOS-a dovodi do proizvodnje dušikovog oksida (NO) koji ne samo da modulira nekoliko fizioloških funkcija kao što su baktericidna i vazodilatacija, već također uzrokuje upalu. Nakon ozljede tkiva, degradacijom fosfolipaza fosfolipida stanične membrane nastaje arahidonska kiselina. Arahidonsku kiselinu dalje razlaže ciklooksigenaza (COX) do prostaglandina (PG). Prekomjerna količina PGE2 koju formira COX-II inducira nekoliko citokina za upalu. Budući da i NO i PGE2 djeluju kao glavni faktori za upalu i indukciju bola, TNF--NO i COX-II-PGE2 putevi su glavni tokovi upalnog procesa, koji su inhibirani kortikosteroidima i nesteroidnimantiinflamatorni lekovi(NSAID), respektivno.

Iako postoji nekoliko steroida i NSAIL zaterapiji upalnih bolesti, ovi lijekovi mogu izazvati štetne efekte na imuni sistem, gastrointestinalni trakt, bubrege, jetru, centralni nervni sistem, krvni pritisak i kardiovaskularni sistem. Stoga je potrebno minimizirati štetne učinke kemijskih terapeutika zamjenom ili korištenjem u kombinaciji s prirodnim proizvodima.

Fukoidan, kompleks sulfatnih polisaharida iz morskih algi kao što su Laminaria japonica i Cladosiphon okamuranus široko rasprostranjen u mnogim zemljama, dugo se koristio kao terapeutik u orijentalnoj medicini. U prethodnim studijama je pokazano da fukoidan ima antioksidativno, antikoagulativno, antikancerogeno iantiinflamatorne aktivnosti. U skladu s tim, blagotvorno djelovanje fukoidana na upalne bolesti, ishemiju, imunološku disfunkciju i tumore privlače pažnju istraživača. s druge strane,Cistanche tubulosa(CT) se također naširoko koristi kao tradicionalni lijek u Kini. Prijavljeno je da CT ekstrakti smanjuju proizvodnju TNF-á i IL- 4 koji su glavni faktori za proizvodnju NO u inflamatornim putevima [19].

Takvi prethodni nalazi naveli su nas da istražimo kombiniranu efikasnost fukoidana i CT ekstrakta na 2 glavna puta upale. Da bismo razjasnili mehanizam djelovanja, analizirali smo NO i PGE2 u eksudatu od upale zračnih vrećica izazvanih karagenanom.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PREVENCIJUZAPALJNE AKTIVNOSTIPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materijali i metode

Materijali

Polupročišćeni fukoidan i vodeni ekstrakt CT dobijeni su od Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Koreja). Fukoidan i CT ekstrakt su držani na 4 stepena, pomešani (1:3) rastvoreni u prečišćenoj vodi pre upotrebe i oralno davani u zapremini od 5 mL/kg.

Ćelijska kultura i kvantifikacija NO

Ćelijska linija mišjih makrofaga RAW 264.7 kupljena je od American Type Culture Collection (Manassas, SAD) i uzgajana u Dulbecco-ovom modificiranom Eagleovom mediju (Sigma, St. Louis, SAD) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma i antibiotika [100 U/mL penicilin (Sigma) i 100 µg/mL streptomicina (Sigma)]. Ćelije su inkubirane u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2 na 37 stepeni.

Da bi se procijenili efekti fukoidana i CT ekstrakta na lučenje NO, RAW 264,7 ćelija (1×106 ćelija/mL) je inkubirano sa fukoidanom ili CT ekstraktom (1-320 µg/mL) 5 minuta. , a zatim interferon- (IFN-, 10 U/mL) i lipopolisaharid (LPS, 10 µg/mL) tokom 24 sata. U našim preliminarnim studijama potvrđeno je da tretman sa IFN- plus LPS za aktivaciju ćelija RAW 264,7 nije uticao na vitalnost ćelija do 24 sata i da fukoidan i CT ekstrakt nisu bili citotoksični do 1 mg/mL. Kao indikator NO izmjerena je koncentracija nitrita (NO2 – ), oksidiranog produkta NO. Podloga za kulturu je pomešana sa jednakom zapreminom Griessovog reagensa (1% sulfanilamid, 0,1% naftil etilendiamin u 2,5% fosfornoj kiselini) [21] i inkubirana na sobnoj temperaturi 10 minuta. Koncentracija nitrita je analizirana na 540 nm, gdje je NaNO2 korišten za generiranje standardne krive.

Životinje i tretman

Mužjaci ICR miševa (stari 7 sedmica) su kupljeni od Daehan Biolink (Eumseong, Koreja) i smješteni u prostoriji sa konstantnim uvjetima okoline (22±2ºC; 40-70% relativne vlažnosti; 12-satnog svjetla -tamni ciklus 150-300 lux svjetlina); Hrana za pelete i pročišćena voda bili su dostupni ad libitum. Sve eksperimente na životinjama odobrio je Institucionalni komitet za brigu o životinjama (IACUC) Nacionalnog univerziteta Chungbuk (CBNU), Koreja, i sprovedeni u skladu sa Standardnim operativnim procedurama (SOP) Centra za laboratorijska istraživanja na životinjama, CBNU.

Miševi (n=8/grupa) su oralno tretirani fukoidanom (18 ili 54 mg/kg), CT ekstraktom (54 ili 162 mg/kg) ili njihovom mješavinom (18+54, {{6 }} ili 90+270 mg/kg) jednom dnevno tokom 7 dana. Niske doze fukoidana (18 mg/kg) i CT ekstrakta (54 mg/kg) su dobijene iz procijenjenih ljudskih doza od 100 mg/tjelu (70 kg) i 300 mg/tjelu nakon prevođenja tjelesne težine površine (Km{{14) }} za čovjeka/Km=3 za miša). Visoke doze fukoidana i CT ekstrakta su postavljene na 3 puta, samostalno ili u mješavini, a mješavina s najvišom dozom je fiksirana na 5 puta kako bi se procijenili maksimalni sinergistički efekti.

Prvog dana tretmana fukoidanom i CT ekstraktom, miševima je supkutano ubrizgano 10 mL sterilnog zraka u stražnju stranu kako bi se formirala vrećica [22,23]. Nakon 2 i 5 dana, u vrećicu je ponovo ubrizgano 5 mL zraka. Jedan sat nakon završnog tretmana, 1 mL karagenana (1% u fiziološkom rastvoru; Sigma) ili njegov nosač (fiziološki rastvor) je ubrizgan u vrećicu.

Analize eksudata

Vazdušna vrećica je isprana sa 1 mL hladnog fiziološkog rastvora 6 sati nakon injekcije karagenana, a neto zapremina tečnosti za ispiranje je zabeležena. Ukupni broj inflamatornih ćelija, neutrofila, monocita i limfocita određen je pomoću brojača. Koncentracije NO i PGE2 određene su Griessovim reagensom (Sigma) i enzimskim imunotestom (EIA) korištenjem Correlate-EIA kita (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA), respektivno.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA BLOKIRANJE DJELOVANJA NA HEMOTAKSISU ZAPALJENIH STANICA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Histopatološki pregled

Tkivo koje oblaže vrećicu je uklonjeno i fiksirano u neutralnom rastvoru formalina. Stavke tkiva ugrađene u parafin su obojene hematoksilin-eozinom i pregledane pod svjetlosnim mikroskopom na upalne lezije.

Statistička analiza

Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost±SE. Poređenja eksperimentalnih grupa su napravljena jednosmjernom analizom varijanse praćenom korekcijom Tukeyovog testa. AP vrijednost<0.05 was considered statistically significant.

Rezultati

In vitro, tretman ćelijske kulture RAW 264.7, IFN- i LPS uvelike je povećao proizvodnju NO (Slika 1). Predtretman fukoidanom (1-320 µg/mL) nije uticao na oslobađanje NO iz ćelijske linije makrofaga (Slika 1A). Za poređenje, CT ekstrakt (32-320 µg/mL) značajno je potisnuo proizvodnju NO, što ukazuje na antiinflamatornu aktivnost (Slika 1B).

Injekcija karagenana u vazdušnu vrećicu miša značajno je povećala volumen eksudata unutar vrećice (slika 2). Takva povećana eksudacija je oslabljena tretmanom fukoidanom (18 mg/kg) i CT ekstraktom (54 i 162 mg/kg). Primetno je da je kombinovani tretman fukoidana i CT ekstrakta dodatno smanjio zapreminu eksudata, u poređenju sa pojedinačnim efektima, iako veće kombinacije doza (54+162 mg/kg i 90+270 mg/kg) nisu pokazale dodatnu efikasnost na kombinaciju najniže doze (18+54 mg/kg) (Slika 2A). Sadržaj N stepena u vrećici se takođe drastično povećao nakon injekcije karagenana (slika 2B). U poređenju sa blagim dejstvom fukoidana, CT ekstrakt je značajno snizio koncentraciju N stepena. Kombinirano liječenje fukoidanom i CT ekstraktom dodatno je smanjilo nivo NO na način ovisan o dozi. Slično, povećani sadržaj PGE2 je sinergistički potisnut kombinovanom terapijom fukoidana i CT ekstrakta (slika 2C).

Paralelno sa inflamatornim medijatorima u vrećici, broj inflamatornih ćelija se drastično povećao injekcijom karagenana: 37,8, 4,8 i 24,1 puta kontrolnih nivoa za neutrofile, monocite i limfocite, respektivno (Tabela 1). Međutim, fukoidan i CT ekstrakt značajno su smanjili infiltraciju upalnih stanica, u kojoj je fukoidan bio nešto bolji od CT ekstrakta. Neočekivano, istovremenom primjenom fukoidana i CT ekstrakta nije postignut sinergistički učinak u infiltraciji upalnih stanica.

Kako se zaključuje iz infiltracije upalnih ćelija u eksudatu, potkožno tkivo koje okružuje vazdušne vrećice pokazalo je teške upalne lezije (Slika 3). Uočeno je enormno mnogo ćelija u zadebljanom potkožnom tkivu izloženom karagenanu (slika 3B), u poređenju sa skoro normalnim karakteristikama kod kontrolnih životinja (slika 3A). Takve upalne lezije su značajno ublažene tretmanom fukoidanom (Slike 3C i 3D) ili CT ekstraktom (Slike 3E i 3F).

Značajno je da su veći antiinflamatorni efekti postignuti kombinovanom terapijom fukoidanom i CT ekstraktom (Slike 3G-3I).

Diskusija

Koristeći model upale zračnih vrećica in viv stepena aragenanom, ubrizgavanje zraka u leđa glodara inducira proliferaciju ćelija koje se raslojavaju na površini šupljine kako bi formirale strukturu sličnu sinovija. U ovom modelu, injekcija infiltracije inflamatornih ćelija izazvana karagenanom povećala je eksudat, što ukazuje na vaskularno curenje. Vazdušna vrećica služi kao rezervoar upalnih ćelija i medijatora koji se lako mogu izmjeriti u tekućini koja se lokalno nakuplja.

Među različitim inflamatornim medijatorima koji mogu izazvati vaskularnu permeabilnost, dobro je poznato da su NO i PGE2 glavni faktori uključeni u patogenezu mnogih upalnih bolesti. Oni su također poznati kao posrednici indukcije i percepcije bola. iNOS, koji se eksprimira i aktivira u različitim tipovima ćelija stimulacijom sa TNF- i/ili LPS tokom upale, proizvodi visoke, trajne koncentracije NO. NO je važan regulatorni molekul u različitim fiziološkim funkcijama, kao što je vazodilatacija koja dovodi do vaskularnog curenja. PGE2, koji se stvara iz arahidonske kiseline putem COX-a, doprinosi razvoju mnogih upalnih bolesti, a prekomjerna proizvodnja PGE2 kao odgovor na različite upalne stimulacije povezana je s povećanjem nivoa COX-II i napredovanjem upale. Stoga se putevi TNF- - NO i COX-II-PGE2 smatraju dva glavna toka upalnih procesa, koji su blokirani inhibitorima iNOS (kortikosteroidi) i COX (NSAID), respektivno.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA SPREČAVANJE ZAPALJENIH BOLESTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

U ovoj studiji, istodobna primjena fukoidana i CT ekstrakta smanjila je volumen eksudata u vrećici, što sugerira da oni posjeduju supresivnu aktivnost protiv vaskularnog curenja (slika 2A). U poređenju sa pojedinačnim efektima svakog fukoidana i CT ekstrakta, kombinovani tretman se dodatno povećao, što implicira da dva stepena sinergijski pojačava delovanje. Takvi sinergistički efekti između fukoidana i CT ekstrakta su podržani njihovim aktivnostima na nivoima NO i PGE2 u eksudatu (Slike 3B i 2C).

Zanimljivo je, međutim, da je potvrđeno da fukoidan ne inhibira direktno aktivaciju makrofaga in vitro testom (slika 1A). Slično, inhibitorni potencijal fukoidana na testu akumulacije NO i PGE2 in vivo bio je relativno niži nego kod CT ekstrakta (Slike 2B i 2C). Takav mehanizam djelovanja fukoidana razlikuje se od direktne inaktivacije stanica CT ekstraktom (slika 1B). Poređenja radi, fukoidan je pokazao visoku efikasnost u inhibiciji infiltracije inflamatornih ćelija u vrećicama (tabela 1). Fucoidan je bio superiorniji od CT ekstrakta u blokiranju migracije neutrofila, monocita i limfocita na mjesta ozljede tkiva uzrokovanih karagenanom. Zanimljivo je da nije bilo sinergističkog antimigracionog efekta, što ukazuje na različite mehanizme delovanja između fukoidana i CT ekstrakta: tj. fukoidan blokira infiltraciju inflamatornih ćelija, dok CT ekstrakt inhibira aktivaciju ćelija.

Polimorfonuklearne ćelije, posebno neutrofili, glavne su ćelijske komponente regrutovane na akutna upalna mjesta izazvana karagenanom. Osim toga, inflamatorne stanice kao što su makrofagi i limfociti također igraju centralnu ulogu u zapaljenskom procesu tako što luče citokine. Kada su prethodno tretirani fukoidanom ili CT ekstraktom, broj bijelih krvnih zrnaca koji su migrirali u zračne vrećice ubrizgane karagenanom bio je značajno potisnut. Ovaj rezultat bio je u skladu s učinkom koji bi postigli kortikosteroidi kao što je deksametazon, ali ne i NSAIL uključujući indometacin. Stoga se pretpostavlja da fukoidan i CT ekstrakt imaju djelomično svojstvo steroida.

Osim blokirajućeg djelovanja na kemotaksu upalnih stanica, činilo se da CT ekstrakt potiskuje aktivaciju makrofaga. To je potvrđeno njegovim inhibitornim djelovanjem na NO in vitro i in vivo, koji je glavni inflamatorni medijator koji proizvode makrofagi. Dakle, efekat CT ekstrakta na makrofage može biti posledica supresije ekspresije mRNA i/ili direktne inhibicije aktivnosti iNOS u ovim ćelijama.

PGE2 je također jedan od glavnih medijatora upale. Povećava se paralelno sa edemom tkiva, koji suzbijaju NSAIL, inhibitori COX. Karagenan može povećati proizvodnju PGE2 indukcijom COX-II mRNA i COX-II proteina u eksudatu vrećice. U ovom modelu, karagenan je značajno povećao količinu PGE2 i bio je značajno potisnut CT ekstraktom. Zanimljivo je napomenuti da je ovaj rezultat bio konzistentan s učinkom koji bi postigao NSAID indometacin. Stoga se iz rezultata zaključuje da CT ekstrakt ima dodatna svojstva NSAIL. Uzeto zajedno, vjeruje se da je CT ekstrakt ispoljio i kortikosteroidne i NSAID-like efekte u modelu upale izazvane karagenanom i da je fukoidan poboljšaoprotuupalno djelovanje CT ekstraktablokiranjem infiltracije upalnih stanica.

Iako definiranje tačnog mehanizma djelovanja zahtijeva dalje proučavanje, mješavina fukoidana i CT ekstrakta je značajno ublažila upalne znakove blokiranjem TNF--NO i COX-II-PGE2 puteva u upali zračnih vrećica izazvanih karagenanom. Ovi nalazi pružaju dokaz da bi kombinovano liječenje fukoidanom i CT ekstraktom moglo biti obećavajući kandidat za ublažavanje različitih vrsta upala koje reagiraju na kortikosteroide ili NSAID.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA SPREČAVANJE ZAPALJENIH BOLESTI PHGS75% ECH 30% ACT 12%