Abstract

Akutna povreda bubrega (AKI)je kritično stanje koje karakteriše brz padbubrežna funkcijazbog više faktora kao što su nefrotoksičnost, sepsa i ishemija.Povreda bubregaje dugotrajan, složen proces, sa početnom štetom koja potencijalno napredujehronična bolest bubregai čakzavršni stadijum zatajenja bubrega. AKI se manifestira oštećenjem bubrežnog parenhima, tubularnom nekrozom i smanjenom brzinom glomerularne filtracije, što dovodi do smanjenog izlučivanja urina, neravnoteže elektrolita, nakupljanja metaboličkog otpada i povišenih nivoa azota uree u krvi (BUN), serumskog kreatinina (Scr) i mokraćne kiseline. AKI se često pojavljuje kao dio kliničkih sindroma kao što su zatajenje srca ili zatajenje jetre, pogađajući 10-15% hospitaliziranih pacijenata i do 50% onih u jedinicama intenzivne njege (ICU). Brz početak i loša prognoza AKI-a učinili su ga globalnim javnozdravstvenim izazovom. Trenutni zapadni medicinski tretmani uglavnom se oslanjaju na potporne i zamjenske terapije, koje su skupe i često daju suboptimalne rezultate. Tradicionalna kineska i mongolska medicina, ukorijenjena u hiljadama godina holističke prakse, nudi višeciljani, višestruki i višestruki pristup s visokom djelotvornošću i sigurnošću. Posljednjih godina tradicionalna medicina je postala vruća tema istraživanja za liječenje AKI. Stoga, istraživanje mehanizma mongolske medicine koja sadrži Cistanche u liječenju AKI ima značajnu vrijednost.

Mongolski složeni lijek na bazi Cistanche je klasični recept koji se sastoji odCistanche, šipak, cimet, duga paprika (Piper longum), Alpinia officinarum, Amomum villosum, iBorneol. Prema tradicionalnoj mongolskoj medicinskoj teoriji, bubreg se nalazi u položaju "Badagan" među pet iznutrica, a bolesti bubrega su često tipa Badagan, izazvane hladnoćom. Vjeruje se da formule koje sadrže Cistanche, jer su tople po prirodi, tjeraju bubreg na hladnoću i imaju zaštitne efekte na bubrežnu funkciju, u skladu s mongolskim principom "liječenja hladnoće toplinom". Prethodne studije su pokazale da takve formule, kada se koriste u kombinaciji s drugim mongolskim lijekovima, pružaju zaštitu bubrega u modelima AKI. Na osnovu ovoga, ova studija ima za cilj korištenje mrežne farmakologije i eksperimentalne validacije za istraživanje bioaktivnih komponenti, terapeutskih ciljeva i ključnih putevaMongolski lijek koji sadrži Cistanche u poboljšanju AKI, postavljajući teorijske temelje za njegovu kliničku primjenu i daljnji razvoj.

 

 

 

cistanche dodaci zaPacijenti s akutnom ozljedom bubrega (AKI).

Kliknite na sliku da biste dobili više detalja o dodatku herb cistanche

 

 

1. Materijali i metode

1.1 Mrežna farmakološka analiza

1.1.1 Identifikacija aktivnih jedinjenja i ciljeva

Koristeći ključne riječi "Cistanche, Piper longum, Alpinia officinarum, cimet, šipak, Amomum villosum, Borneol" pretražili smoFarmakološka baza podataka sistema tradicionalne kineske medicine (TCMSP)[http://tcmsp-e.com] za pronalaženje bioaktivnih jedinjenja i njihovih ciljeva. Kriterijumi skrininga su bili:oralna bioraspoloživost (OB) veća ili jednaka 30%isličnost sa drogom (DL) Veća ili jednaka 0,18. Za Cistanche i cimet, kojima nedostaju komponente koje zadovoljavaju ove pragove, dopunili smo podatke o spojevima/ciljama koristeći pregled literature iSwissTargetPrediction[https://www.swisstargetprediction.ch/]. Budući da je glavna komponenta borneola amonijum hlorid, isključen je iz dalje analize. Svi prikupljeni proteinski ciljevi su standardizovaniImena gena Homo sapiensakoristećiUniProtbaza podataka [https://www.uniprot.org].

1.1.2 Izgradnja složene ciljne mreže

Prikupljeni podaci su organizirani u NETWORK i TYPE fajlove i analizirani korištenjemCytoscape 3.9.1da se izgradi mreža interakcija spoj-meta za mongolsku medicinu baziranu na Cistancheu.

1.1.3 Provjera ciljeva vezanih za AKI

Ciljevi povezani sa AKI su dobijeni pomoću ključnih riječi "akutna ozljeda bubrega" i "akutno zatajenje bubrega" od:

GeneCards[https://www.genecards.org/]

OMIM[https://omim.org/]

Baza podataka o terapeutskim ciljevima (TTD)[https://db.idrblab.net/ttd/]

DrugBank[https://www.drugbank.com/]

PharmGKB[https://www.pharmgkb.org/]

Vennovi dijagrami su kreirani pomoću online alata [https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/] za identifikaciju ciljeva koji se preklapaju između baza podataka.

1.1.4 Identifikacija osnovnih spojeva i ciljeva, izgradnja PPI mreže

KoristećiNetwork Analyzerfunkciju u Cytoscapeu, analizirali smo složenu-ciljnu mrežu. Čvorovi sastepen centralnosti, centralnost između centralnosti, icentralnost bliskostiiznad medijane, iprosečna najkraća dužina putaispod medijane, odabrani su kroz četiri kruga kako bi se identifikovala jezgra jedinjenja. Zajednički ciljevi između jedinjenja i ciljeva povezanih sa bolešću su uneseni uSTRINGbaza podataka [https://cn.string-db.org/], vrste postavljene na Homo sapiens, za konstruiranjeinterakcija protein-protein (PPI)mreže. Mreža je izvezena u TSV formatu za dalju analizu u Cytoscapeu. Tri runde skrininga su dala rezultatepotencijalne mete, i šest rundi daloosnovne mete. Thejezgra ciljno-potencijalna ciljna mrežaje takođe konstruisan u Cytoscapeu.

1.1.5 GO i KEGG analiza obogaćivanja

Analiza obogaćenja je izvršena uRStudio 4.3.1koristećiBioconductor i ClusterProfilerpaketi. Bilješke o ontologiji gena (GO) uključivale su biološki proces (BP), ćelijsku komponentu (CC) i molekularnu funkciju (MF).Obogaćivanje KEGG putaje takođe sprovedeno. Vizuelizacija je završena putemBioinformatics.com.cn[https://www.bioinformatics.com.cn/].

1.1.6 Izgradnja mreže jezgro spoj–cilja–bolest–putevi

Identificirana jezgra jedinjenja, potencijalne mete, pridružene bolesti i signalni putevi su integrirani da se konstruira amreža jezgro spoj–cilja–bolest–putevikoristeći Cytoscape 3.9.1.

1.1.7 Molekularno spajanje

Strukture jezgra su preuzete saPubChem[https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/] u SDF formatu i konvertovan u MOL2 pomoćuOtvorite Babel 2.4.1. Strukture proteina jezgre su preuzete izPDB[https://www.rcsb.org/], odabrano na osnovu porijekla Homo sapiensa, visoke rezolucije i po mogućnosti pojedinačnih lanaca. Molekularno spajanje je izvedeno pomoćuAutoDockTools 1.5.7, sa 50 pokretanja koristeći metodu genetskog algoritma. Odabrana je najbolja konformacija vezivanja s najvećim afinitetom vezivanja i najviše vodikovih veza. Rezultati su vizualizirani uPyMOL 2.5.7.

1.2 Eksperimentalna validacija

1.2.1 Eksperimentalne životinje

SPF-klasa 4-nedjeljni mužjaci KM miševa (22 ± 2 g) kupljeni su od SPF (Peking) Biotechnology Co., Ltd. (licenca br. SCXK (Jing) 2024-0001). Miševi su smješteni u laboratoriju za životinje Medicinskog fakulteta Baotou, Univerziteta nauke i tehnologije Unutrašnje Mongolije. Uslovi: 12 h ciklusa svjetlo/mrak, 24 ± 2 stepena, 55 ± 5% vlažnosti, hranjenje ad libitum. Eksperimente na životinjama odobrio je Institucionalni etički komitet (odobrenje br. BYDY-DL2023-36).

1.2.2 Priprema lijeka

Mongolski lijek baziran na Cistancheu (serija br.. 907031) samljeven je kroz sito od 100 mesh i suspendiran u 0,5% CMC-Na.

1.2.3 Reagensi i instrumenti

Ključni reagensi:

CMC-Na (Solarbio, Peking)

Lipopolisaharid (Sigma-Aldrich, Šangaj)

Kompleti za ekstrakciju RNK i reverznu transkripciju (Sevier Biotech, Wuhan)

qPCR master mix, RIPA pufer za lizu, BCA komplet, antitijela: PI3K, Akt, p-Akt, -actin (Proteintech, Wuhan)

ECL komplet za detekciju (Sevier Biotech, Wuhan)

Ključni instrumenti:

Čitač mikroploča (Thermo Fisher)

Centrifuga (JIDI-16R)

PCR sistem u realnom vremenu (Thermo Fisher)

Sistem za snimanje gelom (Tanon, Šangaj)

1.2.4 Grupiranje, modeliranje i administracija

32 miša su nasumično podijeljena u 4 grupe (n=8):

Kontrola

Model

Cistanche grupa sa niskim dozama (450 mg/kg)

Cistanche grupa visokih doza (900 mg/kg)

Cistanche grupe su primale dnevnu oralnu gavažu tokom 7 dana. Sedmog dana, 2 sata nakon doziranja, svim grupama osim kontrolne intraperitonealno je ubrizganLPS (10 mg/kg)da izazove AKI. Kontrolna grupa je primila fiziološku otopinu.

1.2.5 Morfologija bubrega, tjelesna težina i indeks bubrega

24 h nakon modeliranja, zabilježena je tjelesna težina i težina bubrega. Indeks bubrega=ukupna težina bubrega (g) / tjelesna težina (kg).

1.2.6 Biohemijski testovi

Nivoi BUN, Scr i mokraćne kiseline u serumu su mjereni korištenjem komercijalnih kompleta.

1.2.7 Histopatološka analiza

Bubrežno tkivo je fiksirano u 4% paraformaldehida, dehidrirano, ugrađeno u parafin, isječeno i obojeno pomoćuHE bojenje. Oštećenje tkiva je procenjeno pod svetlosnim mikroskopom.

1.2.8 qRT-PCR za TNF- , IL-6, IL-1

Ukupna RNK iz tkiva bubrega je ekstrahirana, reverzno transkribirana i amplificirana korištenjem SYBR Green qPCR. GAPDH je korišten kao interna kontrola. Relativna ekspresija mRNA izračunata je korištenjem2^-ΔΔCt metoda.

1.2.9 Western blotting za PI3K/Akt put

Proteini su ekstrahovani iz tkiva bubrega pomoću RIPA pufera. Koncentracija proteina je mjerena BCA testom. Proteini su odvojeni putem SDS-PAGE, prebačeni na PVDF membrane, blokirani i ispitani primarnim i sekundarnim antitelima. Signali su razvijeni korištenjem ECL-a i kvantificirani korištenjemImageJsoftver.

1.3 Statistička analiza

Podaci su analizirani korišćenjemGraphPad Prism 9.5. Rezultati su izraženi kaosrednja vrijednost ± SD. Za normalno raspoređene podatke sa jednakom varijansom,jednosmjerna ANOVApraćenoLSD-t testje korišteno. Za nenormalne ili nejednake podatke o varijansi,Kruskal-Wallis H testje primijenjen. AP-vrijednost < 0,05smatralo se statistički značajnom.