Studija o efektu acteozida (aktivni sastojak u Cistanche Deserticola) na naFLD-u izazivanjem autofagija

Sažetak:

 

Cilj:Za istraživanje funkcije aktivnog sastojke za aktivni sastojak Acredient (Zakon) u CISTENCHE Deserticola i njen učinak na bezalkoholnu bolest masnog jetre (NAFLD).

MetodeDa biste preuzeli echinakozid i ponašajte se kao istraživački objekti, 1 0 0 "0 0 {0 0 {0 {0 {0 0 {0 0 {0 0 {0 0 {0 0 {{15} {0 {{{15} {0 {{{15} {0 {{15} {0 {{{15} {0 {{15} {0 {{{15} {0" Ehinacoside (ECHINACOSID (ECHINACOSID (ECHINACOSID (ECHINACOSID (ECHINAkoside u kombinaciji su sa autofagijskim inhibitorom Bleomicin A1 za lečenje intervencije. Protein ImmunoBlotting korišten je za otkrivanje relativnog nivoa izražavanja autofagy marker proteina MicroTubule pridruženog proteina 1 lagani lanac 3 (LC 3- ii). HEPG2 ćelije su intervenirane s različitim koncentracijama djela u vitro, a održivost ćelije je otkrivena metodom tetrazolium soli. Vitro intervencija HEPG2 ćelija u kombinaciji s balofloksacinom A1 i otkrivanjem nivoa ekspresije proteina pomoću proteinskih imuno tehnologije. Model NAFLD-a izgrađen in vitro sa intervencijom droga korišten je za mrlje od kapljica lipida pomoću ulja crvene metode bojenja i otkrivanje intracelularnih nivoa triglicerida. Pridržavajte se lokalizacije kapljica proteina i lipida LC3 putem imunofluorescentne tehnologije. Zakon o rezultatima može značajno izazvati autofagiju u HEPG2 ćelijama, a ekspresioni nivo LC-a znatno se povećao u usporedbi sa kontrolnom grupom (tretirano sa akt) (1,36 ± 0 2. {0} 2, respektivno), sa statističkim značajem (P0.05). 50 μmol / L Djelovanje značajno izazvane autofagije u HEPG2 ćelijama, a izraz LC-a {3- II proteina značajno je povećan (1,83 ± 0,53, odnosno 0,35 ± 0,18, respektivno). Razina TG HEPG2 u akcijskoj interventnoj grupi (19.11 ± 1,68) bila je značajno niža od one u naFLD in vitro Model Model Grupa (34,15 ± 1,90), a razlike su bile statistički značajne (p<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Ključne riječi:Bezalkoholna bolest masnog jetre;Cistanche Deserticola;ACTEOSIDE; Autofagy

 

TCM biljna cistanche za liječenje bezalkoholnih masnih jetrenih bolesti (NAFLD)

Kliknite na sliku da biste dobili više detalja

 

U posljednjih nekoliko decenija, bezalkoholna masnabolest jetre(NAFLD) je postao najčešćeHronična bolest jetre, sa globalnom prevalencijom od oko 25% odrasle populacije, a smatra se da je usko povezano sa metaboličkim sindromom [1]. Iako je verovatnoća komplikacija u vezi sa jetrom u pacijentima na NaFLD manjim od 10%, NAFLD je faktor rizika za bolesti jetre kao što su ciroze i primarni rak jetre, koji nameće ogroman ekonomski teret na pacijentima [2-5]. Uprkos sve većoj pažnji posvećenoj NAFLD-u, NAFLD kao važna hronična bolest nije dobila dovoljno pažnje. Stoga, daljnje dubinsko razumijevanje patogeneze NAFLD-a i potraga za efikasnim strategijama liječenja postale su hitne probleme koje treba riješiti [6-7].

Nedavne studije su pokazale da ćelijski autofagy igra važnu ulogu u fiziologiji jetre i patologiji [8]. Autofagy disfunkcija ili disfunkcija povezana je s raznim bolestima jetre poputBolest jetre povezane sa alkoholom[9], NAFLD [10], bezalkoholni steatohepatitis [11] i hepatocelularni karcinom [12]. Patološke karakteristike NAFLD-a su prekomjerno taloženje triglicerida (TG) i drugih neutralnih kapljica lipida (LD) u hepatocitima pod bezalkoholnim stimulacijom. Za jetru, dva glavna staza koja reguliraju katabolizam ovih LDS-a su lipoliza i autofagija.
Put lipolize regulirani su citoplazmatskim neutralnim lipasama, poput hormonskog lipaze i adipoze TG Lipase. U odgovarajućem lipoautofagy putu, LDS se može bilektivno preuzeti izravnim zapošljavanjem proteina koji se odnose na autofagy da bi se formirali autofagosomi, a tada se LDS inkapsulira autofagosomima dodatno dostavljaju lizosomima i razgrađuju kiseline lipaze u lizosomima. Stoga je aktiviranje lipoautofagy u Hepatocitima postalo efikasna strategija za prevenciju i liječenje NAFLD-a.
Cistanche Deserticola je dragocjena kineska biljna medicina koja se široko koristila u kliničkoj praksi u tradicionalnoj formulama kineske medicine. Istovremeno, dugo se koristi kao dodatak zdravlja. Cistanche Deserticola sadrži razne bioaktivne sastojke, od kojih je najvažnije čiji je cistanche deserticola feniletanol glikozide. Kao što su predstavnici feniletanoičnih glikozida, ehinacOside (ECH) i verbaskoside (ACT) imaju mnogo važnih bioloških aktivnosti, poput antioksidansa, neuroprotektivnog, imunomodulacijskog i zaštite jetre [13]. U pogledu zaštite jetre, ustanovile su da Ech može zaštititi jetru smanjenjem upalnih medijatora, inhibirajući faktor za transformaciju rasta - i smanjenje nivoa izraza u vezi sa genima koji se odnose na jetre. Akt ima značajan zaštitni učinak na hemijsku i natkrivenu štetu natkrivenoj jetri, kao što su alkohol, ugljični tetraklorid i lipopolisaharide. Zakon smanjuje oksidativni stres uzrokovan toksičnim hemikalijama, uklanja reaktivni kisik nakupljeni u jetri i smanjuje koncentraciju malondialdehide. Istovremeno, značajno povećava aktivnost superoksida jetre Superoxide i smanjeni sadržaj glutationa i značajno poboljšava histopatološku štetu i apoptozu jetre. Međutim, ne postoji relevantna izvješća o literaturi o tome da li su feniletanoidni glikozidi Cistanche Deserticola uključeni u proces autofagije u vršenju zaštite jetre. Na osnovu toga, ova studija koristila je konvencionalne metode biologije ćelija i model in vitro ćeliji da preliminarno istražuju funkciju autofagijskog indužljivosti Feniletanoida i istražuje njegove moguće farmakološke funkcije, čiji je cilj pružiti naučnu osnovu za budući razvoj droga.

 

1 Materijali i metode

1.1 Materijali

1.1.1 Istraživački subjekti ECH i čin korišteni su kao subjekti za istraživanje.

1.1.2 Materijali HEPG2 ćelije kupljene su iz Wuhan Punosai Life Science Co. Kupljeno iz kompanije Hyclone, SAD, Fetal Bovine Serum (Batch broj: 04-002-1 A) je kupljen iz kompanije BICLONSIn / streptomicin (BATCH broj: Sv30010.01) je kupljen iz kompanije SOLEBAO, KINA, TG (BATCH broj: BC0625) Komplet za otkrivanje kupljeno je iz kompanije Solebao, Peking, Kina, ulje Crvena O (broj lota: o 0625-100 g), dimetil sulfoksid (broj lota: BCBZ1685) kupljeni su iz Sigma-Aldricha, SAD-a; Autofagy-Lysosome inhibitor Bafilomycin A1 (BAFA1, broj lota: TLRL-BAF1) kupljen je iz inviznog, SAD-a; Autofagy aktivator Rapamycin (broj lota: S17098) kupljen je iz Šangaj Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Kina; MicroTubule-Stilted Protein 1 lagan lanac 3 (LC3, broj lota: l7543, omjer razblaživanja: 1: 1 000) i -actin (broj partije: ZRB1312, vrsta: 1: {33}}) Antitela su kupljena iz Sigma-Aldricha, SAD-a; Sekundarna antitijela s reoksidazom (broj lota: 4010-05, vrsta: koz od zeca za razrjeđivanje: 1: 1 000) Kupljeno je sa južne biotehnike, alexa fluotske antitijelo (546, omjer razrjeđivanja: 1: 1000) kupljeno je iz kompanije Sigma-Aldrich, SAD, SAD i Bodipy 493/501 (broj lota: D3922) kupljen je iz Invitrogen kompanije, SAD.

 

1.2 Metode

1.2.1 Kultura ćelije

HEPG2 ćelije su kultivirane u Dulbecco-ovom modificiranom orlovu visokoj glukoznim srednjem svjetlu koji sadrži 10% nosionski serum, 100 u / ml penicilin i 100 ugljen-ml streptomicina u 37 stepeni, 5% inkubatora ugljičnog dioksida. Kada se ušće ćelije dostigne 85%, izvedena su subkultura, oblaganje, intervencija i druge operacije.

 

1.2.2 Proteinska detekcija imunoBoot

1.2.2.1 Zakon i obrada ECH-a

Lc 3- ⅱ nivo ekspresije u HEPG2 BAFA1, kao inhibitor protona pumpe, može prouzrokovati da LC 3- ⅱ proteina agregira u velikim količinama u ćelijama, čime se pojačaju indukcijske sposobnosti za autofagiju. Stoga se kombinirana upotreba BAFA1 može koristiti kao sistem za nadgledanje autofagije za procjenu indukcijske sposobnosti za autofagiju. HEPG2 ćelije u logaritamskoj fazi rasta prenose se na 3,5 cm subila za kulturu za preko noći. Zahtjev za intervenciju za 12 h Stanice su isprane unaprijed hlađenim fosfatnim pufernim rešetkom (PBS) i odmah se bave tampon RIPA proteinom za 10 min. Supernatant je bio centrifugiran, a ukupna koncentracija proteina utvrđena je korištenjem bicinkroninske azualnog kompleta koncentracije proteina. Nakon kvantifikacije sa natrijum-dodecil sulfateu, uzorak se zagrijao u 95 stepeni 10 min za denaciju proteina. Zatim je 30 μl uzorka uzeto sa mikropipetom i elektrofored na poliakrilamidnom gelu.
Nakon elektroforeze, protein je prenio iz gela u nitrocelulozno membranu, blokiran sa 1 0% mlijekom preko noći, inkubiran sa specifičnim primarnim antitijelom na sobnoj temperaturi za 1 h, a postepeno je sa specifičnim sekundarnim antitijelom na sobnoj temperaturi za sobnu temperaturu za 1 h. ECL metoda korištena je za razvoj boja. Oni su postavljeni kao prazna kontrolna grupa, Rapamycin Group, Ech Group, Act Group, Grupa Rapamycin + Bafa1, ECH + BAFA1 Grupa i ACT + BAFA1 Grupa.

 

1.2.2.2 Različite koncentracije Zakona intervenirale su nivo ekspresije LC-a 3- ⅱ proteina u HEPG2 ćelijama

Logaritamske faze rasta HEPG2 prenesene su na 3,5 cm kulturu za kulturu preko noći, a 25, 50 i 100 μmol / l djeluju u kombinaciji sa BAFA1 korišteni su za intervencijski nivo za 12 h, a izraz LC-a 3- ⅱ otkrio je proteinom. Kontrolna grupa (Con Group, prazna kontrola), postavljena su Grupa za gladovanje Grupe HEPG2.

1.2.3 MTT metoda za otkrivanje stope preživljavanja HEPG2 ćelija tretirana različitim koncentracijama akata za 24 i 48 h
HEPG2 ćelije u logaritamskoj fazi rasta bili su inokulirane u dobrobit 96- sa umjerenom inokulacijom gustoće i kultivirane u inkubatoru za 12 h. 0, 40, 60, 80, a 100 μmol / L deluju dodani su za 24 i 48 h. 0,5 mg / ml MTT rješenje dodano je u tamnom okruženju i inkubirano u inkubatoru. Nakon 4 sata, supernatant je odbačen, u svakom bi se dodao 100 μl dimetil sulfoksida, a ćelije su se uzdrmale u stalnom temperaturnom šejku u 37 stepeni 10 min. Vrijednost optičke gustoće (OD) na talasnoj dužini od 490 NM otkrivena je enzimnim markerom, a izračunata je stopa preživljavanja ćelije.

 

1.2.4 In vitro Izgradnja Nafld Model modela

Određena težina palmititne kiseline (PA) bila je izvačena i potpuno rastvarala u određenom zapreminu izopropanola za pripremu 100 mmol / l pa stolinske otopine, koji je zatim podijeljen i pohranjen u hladnjaku -20 za kasniju upotrebu. PA zaliha otopina razblažena je na 100 μmol / l koristeći kompletnu kulturni medij, a 1% masnog kiselinskog goveđeg serumskog vojnika je dodan. Stanice su inkubirane u 37 stepeni za 3 sata za pripremu indukcijskog rješenja. HEPG2 ćelije u logaritamskoj fazi rasta prebačene su na 3,5 cm Kulturnu posudu u odgovarajućoj gustini za preko noći kulturu, a zatim je pripremljena indukcijska otopina korištena za intervenciju.

 

1.2.5 Zakon Intervencija naFLD in vitro Model ćelije TG otkrivanje i ulje crveno o bojama

 

1.2.5.1 Otkrivanje TG

HEPG2 ćelije u logaritamskoj fazi rasta prebačene su u jelo od 3,5 cm ćelije za kulturu prema praznoj kontrolnoj grupi, grupi modela i action intervencije. Grupa modela izazvana je s indukcijom od 100 μmol / L PA, a interventna grupa za čin izazvana je sa 100 μmol / l PA indukcijskom otopinom i 50 μmol / L djelu. Vrijeme intervencije bilo je 24 sata. Lagano uklonite staru kulturu, polako operite ćelijnu površinu unaprijed hlađenim PBS-om, dodajte 100 μl prehlađenog RIZ-a, u potpunosti za 10 min, uzmite 10 minuta za enzimsko otkrivanje razine TG, uzmite još 10 μL za otkrivanje sadržaja proteina, otkrijte TG u skladu s TG Upute za komplet i konačno ispravljaju nivo TG po mg proteina.

1.2.5.2 Ulje crveno o bojama

HEPG2 ćelije u logaritamskoj fazi rasta prebačene su na kulturu od 3,5 cm prekrivena sterilnim pokrivačem za preko noći. 100 μmol / l PA izazvao je ćelije da formiraju kapljice lipida. Istovremeno, dodano je 50 μMol / L za 9. intervenciju za 24 sata.
Kombinirani tobogani su prikupljeni, oprati 3 puta s unaprijed hlađenim PBS-om, učvršćenim na sobnoj temperaturi za 10 min, dodao je na sobnoj temperaturi u mraku, ispljujući višak otopine za bojenje s dvostrukom destiliranom vodom, ispran s dvostrukom destilirane vode i zapečaćene, i fotografiran pod mikroskopom.

 

1.2.6 Immunofluorescentno promatranje autofagosoma i kapljica lipida nakon tretmana djela

HEPG2 ćelije u logaritamskoj fazi rasta prebačene su na kulturu od 3,5 cm prekrivena sterilnim pokrivačem za preko noći. 0 0 μMol / L PA je korišten za indukaciju formiranja kapljica lipida u ćelijama. Istovremeno, Zakon je dodan za intervencijski tretman za 24 sata. Komplet ćeliji su prikupljeni, oprati 3 puta sa unaprijed hlađenim PBS, učvršćenim na sobnoj temperaturi za 4% kombiliranog pufera za 1 h sa sobnoj temperaturu za 1 h sa LC-om sa LC-om sa specifičnim primarnim antitijelom, a opterećen 3 puta sa PBS-om i doda se sa specifičnim Fluorescentna sekundarna antitijela, inkubirana na sobnoj temperaturi i dalje od svjetlosti za 1 h. Nakon inkubacije antitijela, tobojnice su opterenuli 3 puta s ispitnim sondom za kapljica lipida na sobnoj temperaturi na sobnoj temperaturi za 10 min, zaprjenjena sa klizačem i zapečaćenim zaptivenim za brtvljenje, zrak su osušene u mraku, promatrano sa laserskim konfokalnim mikroskopom i snimljeno. Postavljeni su prazna kontrolna grupa, postavljeni su rapamycin Grupe za liječenje i intervencija djela.

 

1.3 Statistička analiza

SPSS25. 0 Statistički softver korišten je za analizu podataka. Kvantitativni podaci izraženi su kao x ± s. Korišćene su jednosmjerne analize varijance i LSD-T testa. Str<0.05 was considered statistically significant.