Studija o metodi određivanja sadržaja glikozida epifize i ergosterol glikozida u Cistanche Tubulosa

Cistanche tubulosa je suva mesnata stabljika sa ljuskavim listovima koja pripada rodu Cistanche iz porodice Ledaceae. Tople je prirode, slatkog i slanog ukusa, a pripada meridijanima bubrega i debelog creva. Ima tradicionalne efekte kao što su toniziranje janga bubrega, hranjiva esencija i krv, vlaženje crijeva i podsticanje pražnjenja crijeva i odgađanje starenja. Poznat je kao "pustinjski ginseng". Počevši od izdanja Farmakopeje Narodne Republike Kine iz 2010. godine, Cistanche tubulosa (Schrenk) R. Wight je dodana kao jedna od statutarnih bazalnih biljaka Cistanche i navedena uz C. deserticola.

Cistanche tubulosa se uglavnom proizvodi duž južnog ruba Tarimskog basena u autonomnoj regiji Xinjiang Uygur, raste parazitski na korijenu biljaka Tamarix. To je trenutno primarni izvor ljekovitog materijala Cistanche tubulosa na kineskom tržištu, sa godišnjim učinkom od više od 60%. Zbog sve veće oskudice divljih resursa, navedena je kao zaštićena biljka druge klase na Nacionalnoj ključnoj listi zaštićenih divljih biljaka (izdanje 2021.).

Savremena farmakološka istraživanja su pokazala da je osnovna farmakološka supstanca Cistanche tubulosa zasnovana na feniletanoidnim glikozidima (PhGs), među kojima ehinakozid (C35H46O20) i akteozid/verbaskozid (C29H36O15) imaju najveći sadržaj i najjače djelovanje za kvalitetne medicinske komponente tubulosa, te su karakteristične kontrolne komponente tubulosa. prema kineskoj farmakopeji. Prema izdanju Kineske farmakopeje iz 2020., ukupna količina ehinakrozida i verbaskozida u sušenom proizvodu Cistanche tubulosa ne bi trebala biti manja od 1,5%, što je mnogo više od standarda od 0,30% za pustinjski Cistanche tubulosa. Stoga je uspostavljanje tačnih, efikasnih i ponovljivih metoda određivanja sadržaja od velikog značaja za kontrolu kvaliteta, ocjenu porijekla, optimizaciju sadnje i razvoj proizvoda ljekovitog materijala Cistanche tubulosa.

Ehinozid, glavna hemijska komponenta Cistanche tubulosa

Akteozid, glavna hemijska komponenta Cistanche tubulosa

Hemijske karakteristike glikozida krizanteme šišarke i glikozida ergotamina

hemijska struktura

Pinecone glikozid i ergosterol glikozid su oboje feniletanoidni glikozidi, čiji se osnovni skelet sastoji od feniletanoidnog jezgra povezanog glikozidnim vezama sa šećernim grupama (obično glukozom i ramnozom), a supstituirane grupe kao što su kafeoilne grupe su uvedene na hidroksilnoj poziciji. Molekularna formula ehinakozida je C35H46O20, sa relativnom molekulskom težinom od 786,72. Njegova struktura sadrži jednu kofeoilnu grupu, jednu glukoznu grupu i jednu ramnoznu grupu. Molekularna formula ergosterol glikozida (verbaskozida) je C29H36O15, sa relativnom molekulskom težinom od 624,59. Njegova struktura je slična pinealozidu, ali mu nedostaje ramnoza i neke zamjene kafeoila. Oba su lako rastvorljiva u polarnim rastvaračima kao što su metanol, etanol i voda, i imaju karakterističnu apsorpciju u ultraljubičastom području (maksimalna talasna dužina apsorpcije oko 330 nm), što predstavlja teorijsku osnovu za HPLC-UV detekciju.

Farmakološka aktivnost

Glikozid krizanteme šišarke i glikozid ergosterol imaju širok spektar farmakoloških aktivnosti: (1) antioksidativno dejstvo - čišćenjem superoksidnih anjona (O2 · -), hidroksilnih radikala (· OH) i vodikovog peroksida (H2O2), aktiviranjem Nrf2/ARE signalnog puta kao što je GOD i regulacija signalnog puta antioksidanata, Px; (2) Neuroprotektivni efekat – promoviše ekspresiju neurotrofnih faktora kao što je GDNF, koji ima bolji efekat na modele Alchajmerove i Parkinsonove bolesti; (3) Efekti slični hormonima - promoviraju ekspresiju enzima povezanih sa sintezom testosterona i poboljšavaju reproduktivnu funkciju; (4) Hepatoprotektivni efekat – smanjenje alkoholnog oštećenja jetre i oksidativnog stresa; (5) Antitumorski efekat - inducira apoptozu ćelija raka jednjaka kroz mitohondrijalno zavisne puteve. Gore navedene aktivnosti čine ih nezamjenjivim indikatorskim komponentama za ocjenu kvaliteta Cistanche tubulosa.

Efekti cistanche-antitumor

Pregled metoda određivanja sadržaja

Trenutno, metode za određivanje sadržaja glikozida epifize i glikozida ergosterola u Cistanche tubulosa uglavnom uključuju tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC), tečnu hromatografiju ultra visokih performansi (UPLC), digitalizaciju slike tankoslojnom hromatografijom (TLC ImageJ) i tečnu masenu hromatografiju/MSLC/MSLC-mettan. Među njima, HPLC metoda je usvojena kao zakonska metoda određivanja od strane Kineske farmakopeje zbog svoje velike popularnosti opreme, jednostavnog rada i dobre ponovljivosti, i trenutno je metoda koja je najčešće prijavljivana u literaturi. Sledeće se fokusira na uspostavljanje sistema i proces optimizacije HPLC metode.

Utjecaj različitih porijekla i domaćina na sadržaj

Razlike u poreklu

Više studija je dosledno pokazalo da postoje značajne razlike u sadržaju ehinakrozida i ergosterola u Cistanche tubulosa iz različitih regiona. Uzimajući Xinjiang kao primjer, razlika u sadržaju dvije komponente u uzorcima iz mjesta kao što su Hetian Moyu County, Kashgar Jiashi County i Alar City može doseći 2-5 puta. Općenito govoreći, ukupna količina feniletanoidnih glikozida u Cistanche tubulosa proizvedenih u području Hotan (posebno okrug Moyu, Minfeng i Yutian) je relativno visoka, a sadržaj feniletanoidnih glikozida u nekim visokokvalitetnim uzorcima može doseći 2,5% do 5,0%, harcopoe 1,0% od standarda harco1.5%.

Različiti utjecaji domaćina

Cistanche tubulosa parazitira na korijenu različitih biljaka iz roda Tamarix, a vrste domaćini imaju značajan utjecaj na kvalitetu ljekovitog materijala. Chen et al. (2005) izvještavaju da je sadržaj feniletanolne kiseline u uzorcima parazitiranim na T. talama kanensis općenito veći od sadržaja parazitiranih na T. ramosissima. Osim toga, postoje razlike između divljih i uzgojenih proizvoda. Općenito, sadržaj dvije komponente u divljim proizvodima je veći nego u uzgojenim proizvodima, ali visokokvalitetni uzgojeni proizvodi mogu postići i viši nivo optimizacijom uslova sadnje.

Razlike u specifikacijama i dijelovima

Specifikacije (prečnik, dužina) i lekoviti delovi Cistanche tubulosa takođe imaju uticaj na njen sadržaj. Istraživanja su pokazala da je sadržaj ehinakozida i ergosterola u tanjim mesnatim stabljikama često veći nego u debljim stabljikama; Sadržaj u gornjem dijelu stabljike (blizu kraja cvasti) je obično veći od sadržaja u bazi. Ovo pravilo daje referencu za odabir dijelova tokom berbe i prerade ljekovitog bilja.

Uvod u druge metode mjerenja

Tečna hromatografija ultra visokih performansi (UPLC)

Cistanche tubulosa eksperiment

Kliknite ovdje da vidite prirodni dodatak u prahu ekstrakta Cistanche Tubulosa

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / WhatsApp: 0086 18599088692 / WeChat: 18599088692

UPLC metoda koristi hromatografsku kolonu s manjom veličinom čestica (kao što je Waters HSS T3, 1,8 μm, 100 × 2,1 mm), brzinom protoka od 0,3 mL/min, volumenom ubrizgavanja od samo 1 μL, a vrijeme analize može se skratiti na 10-15 min. odvojenost i osjetljivost. Liang Jiansong i dr. (2021) uspostavili su UPLC metodu za istovremeno određivanje šest feniletanolnih glikozida, koja ima širok linearni raspon i visoku stopu oporavka, te je pogodna za brzi pregled velikih količina uzoraka.

LC-MS/MS metoda

Metoda tandemske masene spektrometrije tečnom hromatografijom ima izuzetno visoku osjetljivost i može istovremeno odrediti desetine komponenti u Cistanche tubulosa, uključujući ehinakozid, ergosterol glikozid, izoergosterol glikozid i gvanozin A. Pogodan je za metabolomska istraživanja i sveobuhvatnu procjenu kvaliteta. Kombinovana tehnologija RPLC-HILIC može čak izmjeriti 23 polarne i nepolarne komponente odjednom, pokrivajući raspon sadržaja od 5 redova veličine.

Mrežna hromatografija sa rastvaračem pod pritiskom, mikroekstrakciona vrtložna struja HPLC metoda

Ova metoda spaja ekstrakciju uzoraka, prečišćavanje i hromatografsko odvajanje na mreži, značajno smanjujući potrošnju organskih rastvarača i upotrebu uzorka. LOQ tri feniletanolna glikozida su 0,50 mg/L (ehinakozid), 0,25 mg/L (ergosterol glikozid), odnosno 0,38 mg/L (izoergosterol glikozid), koji su pogodni za brzu analizu dragocjenih uzoraka.

TLC metoda digitalizacije slike

cistanche ekstrakt u prahu

Na osnovu softvera ImageJ izvršena je kvantitativna analiza sivih vrijednosti mrlja tankoslojne hromatografije. Koeficijenti korelacije r glikozida pinealne krizanteme, gvanozina A, ergosterol glikozida i izoergosterol glikozida bili su 0,9974, 0,9931, 0,9923 i 0,9890, respektivno, što je bilo u skladu sa HPLC metodom. Ova metoda je jeftina, laka za rukovanje i pogodna za brzu provjeru u osnovnim jedinicama i na terenu.

diskusiju

Ključna pitanja u optimizaciji hromatografskih uslova

Odabir mobilne faze je ključan u razvoju HPLC metoda. Poređenje literature pokazuje da: (1) sistem vodenog acetonitrila je sklon da izazove zadržavanje pika feniletanolnog glikozida, a dodavanje 0,1% mravlje kiseline ili 1% sirćetne kiseline može značajno poboljšati oblik vrha; (2) Efikasnost odvajanja trojnog sistema metanol acetonitril sirćetne kiseline je superiornija od one binarnog sistema čistog metanola ili čistog acetonitrila; (3) Odabir talasne dužine detekcije od 330-334 nm može uravnotežiti intenzitet apsorpcije obje komponente, sa nešto većim odgovorom na 334 nm i manje interferencije od ergosterola na 330 nm. Temperatura kolone ima uticaj na vreme zadržavanja, ali ne menja značajno stepen razdvajanja, sa razumnim opsegom od 30-35 stepeni.

Optimizacija metoda ekstrakcije

Koncentracija rastvarača, odnos čvrsta i tečnost, ultrazvučna temperatura i vreme utiču na efikasnost ekstrakcije. Istraživanja su pokazala da: (1) 50%~80% metanola ili etanola mogu efikasno ekstrahovati obe komponente glikozida, sa nešto većom stopom ekstrakcije od 60%~80% etanola; (2) Odnos čvrsta i tečnost od 1:30~1:50 (g/mL) je dovoljan za temeljnu ekstrakciju; (3) Optimalna kombinacija je ultrazvučna temperatura od 50-60 stepeni i vreme od 40 min; (4) Ultrazvučna ekstrakcija je superiornija od refluks ekstrakcije, jer potonja može lako dovesti do razgradnje termosenzitivnih feniletanolnih glikozida.

Diskusija o racionalnosti standarda farmakopeje

Sadašnja farmakopeja propisuje da ukupna količina glikozida paeoniflorina i ergosterola u Cistanche tubulosa treba da bude veća ili jednaka 1,5%. Ovaj standard je relativno labav - visokokvalitetni uzorci iz Xinjianga obično dosežu 3% do 5%, a samo nekoliko uzoraka niske kvalitete približava se donjoj granici. Neki istraživači predlažu podizanje standarda na 2,0% do 2,5% kako bi se bolje osigurala kvaliteta medicinskih materijala. Osim toga, farmakopeja koristi samo dvije komponente kao indikatore, dok Cistanche tubulosa također sadrži različite aktivne feniletanolne glikozide kao što su gvanozin A, izoergosterol glikozidi i hesperidin. Višeindikatorska sveobuhvatna evaluacija je budući pravac razvoja.

Prijedlozi za odabir metode

Za kontrolu kvaliteta opštih medicinskih materijala i svakodnevnu kontrolu kvaliteta proizvodnje preporučuje se upotreba farmakopejske HPLC metode. Metoda je zrela, zahtjevi za opremom su niski, a rezultati su vrlo uporedivi. Za pregled velikih uzoraka ili analizu dragocjenih uzoraka, UPLC ili online PLME-TFC-HPLC metode su efikasnije. Metoda LC-MS/MS klasifikacije je poželjna metoda za dubinsku evaluaciju kvaliteta i identifikaciju sorte. Metoda TLC slike je pogodna za brzi početni skrining na osnovnom nivou. Istraživači bi trebali donijeti razumne izbore na osnovu stvarnih potreba.

cistanche ekstrakt u prahu

Zaključak

Ovaj članak sistematski razrađuje HPLC metodu za određivanje sadržaja ehinakozida i ergosterola u Cistanche tubulosa. Ova metoda je validirana multidimenzionalnom metodologijom i ima karakteristike širokog linearnog raspona (r veće od ili jednako 0,999), dobre preciznosti (RSD<3%), high accuracy (recovery rate 95.7%~100.7%), and easy operation, fully meeting the quality control requirements of the Chinese Pharmacopoeia for Cistanche tubulosa.

Sveobuhvatna analiza pokazuje da: (1) sadržaj glikozida epifize u Cistanche tubulosa je obično 3-8 puta veći od ergosterol glikozida, a ukupna količina njih varira u zavisnosti od mjesta porijekla, domaćina, veličine i lokacije; (2) Ukupna količina feniletanolne kiseline u visokokvalitetnim uzorcima iz Hotana, Xinjiang može dostići 2-3 puta ili više od standarda farmakopeje; (3) Nove tehnologije kao što su UPLC i LC-MS/MS pružaju moćne alate za višekomponentno sinhrono određivanje i duboku evaluaciju kvaliteta.

Buduća istraživanja bi se trebala fokusirati na: (1) uspostavljanje sistema evaluacije kvaliteta sa više indeksa koji pokriva više feniletanoidnih glikozida; (2) temeljno istraživanje sveobuhvatnog uticaja sredine za sadnju, perioda berbe domaćina i metode obrade na sadržaj; (3) promoviranje standardizacije cjelokupnog industrijskog lanca Guanhua Cistanchea od ljekovitog bilja do zdrave hrane i kozmetičkih sirovina.

Reference

[1] HPLC metoda juhe mahovine za određivanje sadržaja ehinakozida i ergotamina u Guanhua Roucong Kui [J]. Kineski farmaceut, 2009, 12 (8): 1061-1063

[2] Chen M, Xiao SP, Cui GH, et al. Određivanje ehinakozida i akteozida u biljkama Cistanche tubulosa[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2005, 30(11): 839-841.

[3] Baoshan, Ju Aihua, Xiao Zhibin. Određivanje sadržaja ehinakozida i ergotamina u Guanhua Roucong Kui [J]. Pregled kineske medicine, 2017, 23 (19): 39-40, 44

[4] Liang Jiansong, Xue Cuili, Wu Menghua, itd. Određivanje sadržaja UPLC-a i kemometrijska procjena šest feniletanoidnih glikozida u Roucong Kui i Shacong Kui [J]. Journal of Pharmaceutical Analysis, 2021, 41 (2): 226-235

[5] Komitet za farmakopeju Narodne Republike Kine Farmakopeja Narodne Republike Kine (izdanje 2020., tom 1) [S]. Peking: China Medical Science and Technology Press, 2020: 148-149

[6] Zhang Leihong, Du Niansheng, Wang Qing, itd. Određivanje sadržaja ehinohlorina u kapsulama Roucongkui ukupnih glikozida pomoću HPLC [J]. Northwest Pharmaceutical Journal, 2002, 17 (1): 3-4

[7] Ju Aihua, Ao Geriletu, Zhou Kai Određivanje sadržaja ehinakozida i ergotamina u slanom mesu i suncokretu iz Unutrašnje Mongolije [J]. Kineski časopis tradicionalne kineske medicine, 2011, 26 (1): 178-180

[8] Song Peng, Tu Pengfei. Napredak istraživanja o kontroli kvaliteta i evaluaciji tradicionalne kineske medicine Roucongkui [J]. Sjeverna ljekarna, 2011, 8 (2): 45-47

[9] Guo Dingyu, Xiao Jinglei. Napredak u kontroli kvaliteta i istraživanju biološke aktivnosti funkcionalnih komponenti u Roucongkui [J]. Jilin Traditional Chinese Medicine, 2023, 43 (7): 856-860

[10] Lu Yinghui, Pi Wenmin, Zhang Yue, itd. Komparativna studija i analiza stanja tržišta Roucong Kuija i Guanhua Roucong Kuija [J]. Moderna kineska medicina, 2019, 21 (8): 1105-1110

[11] Standard Nacionalnog komiteta za farmakopeju za granule formule Roucongkui (Guanhua Roucongkui) [S]. Peking: China Medical Science and Technology Press, 2021

[12] Fu C, Li J, Aipire A, et al. Cistanche tubulosa feniletanoidni glikozidi induciraju apoptozu u Eca-109 ćelijama putem mitohondrijski zavisnog puta[J]. Onkološka pisma, 2019, 17(2): 1883-1892.

[13] Xu Mingjun, Analiza kvaliteta čekanja i sveobuhvatna procjena pustinjskog mesnog suncokreta iz različitih regija u Kini [J]. Nauka i tehnologija prehrambene industrije, 2022, 43 (15): 312-320

[14] Sestra Hao, Chen Sumei, Yan Donghai, itd. Napredak istraživanja o primjeni Roucongkuija u kozmetici [J]. Journal of Daily Chemical Science, 2021, 44 (9): 28-33

[15] Hou Ji, Wang Bo, Li Guanghui, itd. Napredak istraživanja i status industrijalizacije Roucongkuija [J]. Shandong Agricultural Science, 2020, 52 (12): 147-154