Strukturna karakterizacija polisaharida Cistanche Deserticola i njen zaštitni učinak na HK {-2 ozljedu ćelije izazvana glukozom

1.2.5.8 Otkrivanje potencijala mitohondrial membrane

HK -2 ćelije su inokulirane u 6- bunarske tanjire i kulturi. Nakon odgovarajuće stimulacije, medij za kulturu u 6- Pažljive i jaka pozitivna kontrolna grupa (POS) dodana je u grupu pod "1.2.5.6". Isperite jednom s PBS-om, dodajte 1 ml stanične kulture srednje i 1 ml JC {-1 radno rješenje za bojenje temeljito je mešano i postavljeno u inkubator ćelije u tami za 20 min. Stanice su se isprane dva puta sa jc -1 puferom bojenja (1 ×), a slike su prikupljene pomoću fluorescentnog mikroskopa.

 

 

 

 

Prednosti cistance

 

1.2.5.9 Hoechst33258 metoda za otkrivanje ćelijskog apoptoze

Stanični tobogani su postavljeni u opskrbu 6- i HK -2 ćelije u logaritamskoj fazi rasta zasijane su u opskrblju 6- u gustoći ćelije od 1 × 105 ćelija / bunar. Nakon odgovarajuće intervencije lijeka, za bojenje je korišten za bojenje bojenja za bojenje. Otkrivena je apoptoza ćelija i slike su prikupljene pomoću fluorescentnog mikroskopa.

 

1.2.5.10 Zapadno mrlje za otkrivanje

Izraz proteina koji se odnose na TLR4 / NF-κb signalni put analiziran je grupiranjem i liječenje ćelija prema metodi pod "1.2.5.6". Nakon toga, ukupni protein u stanicama izvučen je prema uputama kompleta ekstrakcije proteina. Kvantifikacija proteina izvedena je upotrebom kvantifikacije bicinkroninske kiseline (BCA), a protein je bio denaturan i pohranjen u hladnjaku {-20.
10% natrijum-dodecil sulfata poliakrilamidna gel elektroforeza (SDS-stranica), polivinidenski fluorid (PVDF) Membranski transfer, stavite membranu u TRIS-a koji sadrži tampon -20
Ćelije su inkubirane u tris puferiranoj slanici s Tweenom -20 (tbst) komorom i blokirane na sobnoj temperaturi. Primarna antitijela za TLR4, NF-κb P65, P-NF-κb P65 i -actin korišteni suOtkrijte bubrežno tkivo(Antitela su razblažena TBST rješenju pri omjeru glasnoće od 1: 2000) u 4 stupnju preko noći. Tbst
Membrana je razblažena sa sekundarnim antitijelom (antitijelo i otopina TBST-a razrijeđene su u odnosu na količinu od 1: 2000) i inkubira na sobnoj temperaturi za 1 h. Nakon pranja membrane 3 puta sa TBST, ECL luminescentni reagens je dodan za otkrivanje, a izraz proteina otkriven je gelima slikama. Image J softver korišten je za analizu vrijednosti sive sive za proteina, a -actin kao interna referenca.

1.3 Obrada podataka

SPSS 23. 0 i softver Graphpad Prism 6.01 korišten je za analizu podataka. Shapiro-Wilk test korišten je za testiranje normalnosti uzoraka podataka, a za ispitivanje homogenosti varijance uzoraka podataka. Mjerni podaci s normalnom distribucijom i homogenošću varijance izraženi su kao srednje ± standardno odstupanje. (x ± s) označava opis, jednosmjerna ANOVA korištena je za testiranje, a Dunnettova metoda korištena je za parov usporedbu ako je statistički značajan.
Za post hoc parovi uporedni usporedbe nejednakih varijacija koristi se Dunnettova metoda T3, sa p <0. 0 5 ukazuje na statistički značajnu razliku i p <0,01 što ukazuje na značajnu razliku između dviju grupa.

2 rezultata i analiza

2.1 Određivanje ukupne šećerne, uronične kiseline i sadržaja proteina CDP-a

Linearna regresija jednadžba polisaharidnog sadržaja bila je: y=5. 7628x - 0. 0004, r=0. 999. Eksperiment je pokazao da je između 7 i 70 μg / ml postojao dobar linearni odnos između standardne koncentracije glukoze (x) i vrijednosti apsorpcije (y). Izračunati postotak polisaharidnog sadržaja u uzorku je: 81,02%.
Linearna regresijska jednadžba standardne uronične kiseline je: y {= 1. 1571X + 0. 0015, r=0. 9968. Eksperiment je pokazao da je između 20 i 100 μg / ml postojao dobar linearni odnos između standardne koncentracije uronične kiseline (x) i vrijednosti apsorpcije (y). Sadržaj uronizne kiseline u uzorku je: 4,43%.
Standardna proteinska linearna regresija jednačina je: y=1. 2671x + 0 2145, r=0. 9969. Eksperiment je pokazao da je između 20 i 1 00 μg / ml postojao dobar linearni odnos između standardne koncentracije proteina (x) i vrijednosti apsorpcije (Y). Sadržaj proteina u uzorku je: 4,00%.

 

2.2 Distribucija molekularne težine CDP-a

Molekularna težina CD-ova određena je gelom za dizanje kromatografije u tandemu visokog performansi. S RT-om kao (x) i LGMP-om kao (y), jednadžba krivulje kalibracije LGMP-RT izračunata je kao: y=-0. 1951x + 11 661, r²=0. 9956; RT je (X), LGMW je (Y), LGMW-RT jednadžba krivulje je: y=-0. 1973x + 11 738, r²=0. 9956; RT je (X), LGMN je (Y), LGMN-RT krivulja kalibracije jednadžba je: y=-0. 1964x + 11. 7, r² {19}}. 9955; Na osnovu standardne krivulje dobiva se formula izračuna za izračunavanje molekularne težine svakog uzorka. Molekularni spektar uzorka je sljedeći, a rezultati izračuna prikazani su u tablici 2. Rezultati su pokazali da je CDP imao višestrukih vrhova elucija, a molekularna težina polisaharida uglavnom je raspoređena između 3 i 8 kda, koja je bila heterogena mala molekularna težina heteropolisahaharida. Kao što je prikazano na slici 1.

 

 

2.3 CDPS monosaharidni sastav

CDP su analizirali jom kromatografija, a kromatogram je prikazan na slici 2. Rezultati su pokazali da su u usporedbi s vremenom zadržavanja 16 monosaharidnih standarda otkriveno 5 monosaharida. Upoređivanjem spektra s onima monosaharidnih standarda, CDP su bili uglavnom sastavljeni od glukoze, galaktoze, ramna, mannoze i saharoze. , arabinose. Rator molara je 0 734 0 5: 0 5381: 0 5381: 0 53.0178. Iz molarne omjera može se vidjeti da se CDP uglavnom sastoji od glukoze, galaktoze i ramna. Među njima, glukoza čini 73.405%, galactoza čini 5,381%, a RhamnOse računi za 5,02%.

 

Napomena: MAN.MANNOSE, GLC N.GLUKOSAMINE hidroklorid, rc-ua.glukuronska kiselina, gal-ua.galacturonska kiselina, gal n.galactosamin hidroklorid, glc.Glukose, gal.galakse, xyl.xylose, ara. arabinose, fuc.fukoza.

2.4 CDP Fourierova infracrvena analiza

Vrhunac blizu 3246 cm -1 prouzrokovao je vibraciju hidroksilne grupe, a apsorpcijski vršni vibracijski vibracijski vršak od 3,95 cm -1 je c {{9} O ispruživši vrh, što ukazuje na to da CDPS prisustvo uronske kiseline, 1374,31 cm -1: ova apsorpcija peak may be related to the deformation vibration of CH bonds, especially in the methyl (-CH3) or methylene (-H2-) groups of polysaccharides. Vrhunac apsorpcije na 1018,38 cm -1 može biti povezan sa rastezanjem vibracija CO Bonda, koji se obično nalazi u etrom obveznicama ili esterima polisaharida. Tri slabe apsorpcijske vrhove u rasponu od 1200-1000 cm -1 navedu prisustvo piranoze u CDP-u. Vrhovi apsorpcije na 870 i 930 cm {{27} ukazuju na to da-tip glikozidične obveznice mogu postojati u CDP-u. Pogledajte sliku 3.

 

2.5 Toksični efekti CDP-a na normalu HK -2 ćelije

U usporedbi s CON-u, u 24 sata nakon primjene, održivost ćelije se počela značajno smanjuje nakon što je koncentracija CDP-a dosegnula 1000 ugljika (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 Rasprava i zaključak

Polisaharidisu visoke polimere molekularne težine sastavljene od više od 10 monosaharida. Zabilježeno je da polisaharidi imajuImunomodulacijsko, antioksidans, protuupalni i hipoglikemijski efekti[15]. Kao jedna od glavnih farmakološki aktivnih supstanci u CISTANCHE Desicola, CDP imaju značajnu ljekovitu vrijednost. Ova studija preliminarno je okarakterizirala strukturu CDP-a i utvrdila da mogu poboljšati štetu HK {{-2 ćelija izazvana visokim šećerom.

 

Složena struktura polisaharida usko je povezana s njihovom biološkom aktivnošću, među kojima vrsta i udio monosaharida, relativna molekularna masa polisaharida, i vrste glikozidnih obveznica ključni su faktori [16]. Umjerena relativna molekularna masa daje polisaharide aktivnije web stranice i može izložiti jaču biološku aktivnost.
Međutim, velika molekularna težina povećat će otpornost na transmembranu, ometati apsorpciju polisaharida i utjecati na aktivnost. Suprotno tome, mali molekularni polisaharidi ne može biti u mogućnosti formirati efikasne aktivne strukture, što rezultira smanjenom aktivnošću [17]. Kada istražujete biološku aktivnost polisaharida, potrebno je sveobuhvatno razmotriti kompoziciju monosaharida, relativna molekularna masa i glikozidični tip obveznice [18]. U ovoj studiji, Ion hromatografija utvrdila je da su CDP uglavnom sastavljeni od glukoze, galaktoze i ramna, što je u skladu sa izveštajem Xu et al. [19]. Težine-prosječne molekularne težine CDP-a mjerenih visokim performansama tečna gel hromatografija bila je 3444, 4198 i 8031 ​​KDA, respektivno. Molekularne težine tri cistance polisaharida iz četiri ljekovite materijale cistance mjerene Yang i sur. [20] su bili slični. CDP mogu sadržavati -tipe glikozidijske veze i mogu sadržavati -ukoza ili -manoza. Polisaharidi sastavljeni od -Glukoze ili -manoze lakše su prepoznati po receptorima nalik na naplatu 4 (TLR4) ili TLR2 [21].
DN je jedna od najozbiljnijih mikrovaskularnih komplikacija dijabetesa, a njegova patogeneza usko je povezana sa oksidativnim stresom, mitohondrijskom disfunkcijom i apoptozom ćelija [22]. Ova je studija istraživala zaštitni učinak CDP-a na visoku HK {-2 glukozu u HK {{-2 regulaciju regulacijom signalne puteve TLR4 / NF-κb i njen molekularni mehanizam.

Pod visokim uvjetima glukoze, HK -2 ćelije pokazuju značajan oksidativni stres [23]. Studije su otkrile da visoki nivoi šećera značajno povećava proizvodnju unutarćelijske ruske. Ova prevelika količina ROS-a može direktno oštetiti lipide ćelije membrane, što dovodi do povećanja sadržaja lipidnog peroksidacije MDA [24]. Istovremeno, aktivnosti SOD-a i GSH-PX-a, važni antioksidativni odbrambeni sustavi, značajno su smanjene, što ukazuje na to da je antioksidansni kapacitet ćelija teško oštećen [25]. Ova neravnoteža u sistemu oksidacije-antioksidacije dodatno promovira izraz i aktiviranje TLR4 [26]. Prethodne studije su pokazale da TLR4 može prepoznati prekomjerna ROS kao molekularni uzorci koji su povezali sa opasnim (vlaga), formiranje pozitivne petlje za povratne informacije [27]. U ovoj studiji, Cdps pretres značajno je smanjen nivo rublja, povećane aktivnosti i GSH-PX aktivnosti i smanjeni sadržaj MDA. Ovaj sveobuhvatni antioksidancijski efekat sugerira da CDP može regulirati oksidativne odgovore stresa kroz više ciljeva.
U signalnom putu TLR4 / NF-κb, aktivirano je aktiviranje IKK kompleksa regrutovanjem proteina nizvodnog adaptera, koji zauzvrat dovodi do fosforizacije i degradacije IκBa [28]. Sadašnja studija primijetila je da je visoka glukoza značajno povećala nivo fosforizacije IBB-a, što je dovelo do translacije NF-κB-a P65 iz citoplazma do jezgra. Studije su pokazale da nuklearna transponacija P65 ne samo pogoršava oksidativni stres, već utječe i na mitohondrijalnu funkciju [29].
Zapalio ga je JC -1 mrlje da je visok tretman glukoze uzrokovao značajno smanjenje mitohondrijskog membranskog potencijala, pokazujući pomak od crvene fluorescencije na zelenu fluorescenciju, što ukazuje da je poremećen gradijent protona između unutarnjih i vanjskih membrana mitohondrije. Mitohondrijska disfunkcija dodatno pogoršava proizvodnju ROS-a, formirajući začarani ciklus [30]. CDP Pretmjernost može održavati stabilnost mitohondrijskog membranskog potencijala, a ovaj zaštitni učinak može se postići inhibicijom izražavanja TLR4 i aktivacije NF-κb.
Mitohondrijalna disfunkcija i trajni oksidativni stres u konačnici dovode do apoptoze ćelije [31]. Hoechst mrlje otkrilo je da ćelije jezgre u visokoj grupi za liječenje glukoze pokazalo očigledne tipične apoptotske morfološke promjene kao što su kondenzacija, kondenzacija i fragmentacija [32]. Te su promjene usko povezane sa mitohondrijskim posredovanim ulaznim apoptozom. Gubitak mitohondrijskog membranskog potencijala dovodi do oslobađanja citokroma C, aktiviranje kaskade kaspaze i u potpunosti apoptoze ćelija [33]. Nuklearna morfologija ćelija u CDP-u pretrairaj grupi bila je u osnovi normalna, a bojenje je bilo ujednačeno, što sugerira da CDP spriječili su mobilni apoptozu održavanjem mitohondrijske funkcije i inhibiraju oksidativni stres.
Ukratko, ovaj studij je sustavno otkrio oksidativne indikatore stresa (ROS, MDA, Sod, GSH-PX), mitohondrijalna funkcija (JC -1) i mobilni apoptoza (Hoechst), u kombinaciji sa tipkama TLR4 / NF-κB signalizacije ključevima koji razvijaju mehanizam CDP-a: CDP
Prvo, poboljšanjem antioksidativnog kapaciteta ćelija, smanjujući nivo ROS-a i smanjenje aktivacije TLR4; Drugo, inhibicijom izraza TLR4 i fosforilacije IBB-a, blokirajući nuklearni translokaciju NF-κb; Konačno, poboljšanjem mitohondrijske funkcije, inhibiraju apoptozu ćelije. Smrt, tako igraju zaštitnu ulogu protiv DN-a. Ovaj multi-ciljni sinergistički učinak čini CDP-u prikazuju dobru izglede za prijavu u liječenju DN-a. U narednim studijama, polisaharidna struktura bit će dodatna određena rendgenska difrakcija, nuklearna magnetska rezonantna spektroskopija i plinska kromatografija-masovna spektrometrija. Pored toga, prosječni rezultati molekularne težine pokazuju da su CDP heterogeni polisaharidi. Zatim ćemo odvojiti i pročistiti homogene polisaharide, otkrivanje polisaharidne konstrukcije i biološke aktivnosti i razjasniti odnos strukture-aktivnosti.