Spermidin ublažava oštećenje mitohondrija miokarda novorođenčeta kod potomaka izazvano intrauterinom hipoksijom kod pacova tako što inhibira oksidativni stres i reguliše kontrolu kvaliteta mitohondrija, 1. dio

Abstract

Pozadina: Intrauterina hipoksija (IUH) povećava rizik od kardiovaskularnih bolesti kod potomaka. Kao hvatač reaktivnih vrsta kiseonika (ROS), poliamin spermidin (SPD) je neophodan za preživljavanje i rast embriona i fetusa. Međutim, potrebne su daljnje studije o zaštiti od SPD i mehanizmima za oštećenje srca uzrokovano IUH kod potomaka.

Glikozid cistanche takođe može povećati aktivnost SOD u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, efikasno hvatajući različite reaktivne radikale kisika (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNK uzrokovanih od strane OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju snažnu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala, veću redukcijsku sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji sperme, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju membrane sperme. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i plućnim tkivima eksperimentalno starenja miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina. dobar učinak čišćenja na DPPH, produžava vrijeme hipoksije kod starijih miševa, poboljšava aktivnost SOD u serumu i odlaže fiziološku degeneraciju pluća kod eksperimentalno starenja miševa. i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH i sposobnost uklanjanja reaktivnih vrsta kisika i sprječavanja degradacije kolagena izazvane slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravljanja oštećenja anjona slobodnih radikala timina.

Kliknite na Cistanches Herba For Anti-aging

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ciljevi: Ova studija je imala za cilj da istraži preventivne efekte prenatalnog tretmana SPD na oštećenje srca izazvano IUH kod novorođenih potomaka pacova i njegov osnovni mehanizam vezan za mitohondrije.

Metode: Pacovski model IUH ustanovljen je izlaganjem 10 posto O2 sedam dana prije termina. U međuvremenu, tokom sedam dana, trudnim pacovima je davan SPD (5 mg.kg-1.d-1; ip). Jednodnevni potomci štakora su žrtvovani da bi se procijenilo nekoliko parametara, uključujući razvoj rasta, oštećenje srca, proliferaciju kardiomiocita, oksidativni stres miokarda, apoptozu stanica i funkciju mitohondrija, te imali kontrolu kvalitete mitohondrija (MQC), uključujući mitofagiju, mitohondrijalnu biogenezu i mitohondrijalna fuzija/fisija. U in vitro eksperimentima, primarni kardiomiociti su bili podvrgnuti hipoksiji sa ili bez SPD tokom 24 sata.

Rezultati: IUH je smanjio tjelesnu težinu, težinu srca, srčanu ekspresiju Ki67, aktivnost SOD, te nivoe CAT i adenozin 5'-trifosfata (ATP) i povećao ekspresiju BAX/BCL2 i TUNEL-pozitivne brojeve jezgara. Nadalje, IUH je također uzrokovao abnormalnost mitohondrijalne strukture, disfunkciju i smanjenu mitofagiju (smanjen broj mitofagosoma), smanjenu mitohondrijalnu biogenezu (smanjena ekspresija SIRT-1, PGC-1, NRF-2 i TFAM), i doveo je do neravnoteže fisije/fuzije (povećan procenat mitohondrijalnih fragmenata, povećana ekspresija DRP1 i smanjena ekspresija MFN2) u miokardu. Iznenađujuće, SPD tretman je normalizirao varijacije u parametrima izazvanim IUH. Nadalje, SPD je također spriječio akumulaciju ROS izazvanu hipoksijom, propadanje potencijala mitohondrijske membrane i smanjenje mitofagije u kardiomiocitima.

Zaključak: Liječenje SPD kod majke izazvalo je oštećenje srca izazvano IUH kod novorođenih potomaka pacova poboljšanjem mitohondrijalne funkcije miokarda putem antioksidacije i anti-apoptoze, te regulacijom MQC.

1. Pozadina

Epidemiološke studije i studije na životinjama pokazuju da je adv se intrauterino okruženje povezano sa povećanim rizikom od kardiovaskularnih bolesti u odrasloj dobi (1). Prenatalna hipoksija, najčešća štetna intrauterina sredina, može učiniti fetus nesposobnim da realizuje svoj genetski determinisani potencijal rasta, što se manifestuje kao zaostajanje u rastu i povreda funkcije organa u proleće (2). Hronična fetalna hipoksija često je rezultat trudnoće sa povećanim vaskularnim otporom placente, kao što je preklampsija, međutrudnoća na velikoj nadmorskoj visini ili respiratorne bolesti majke. Što je još značajnije, na jednu trećinu njih utiče sindrom opstruktivne apneje u snu (OSAHS) u kasnoj trudnoći, a povezan je i sa razvojem sindroma gestacijske hipertenzije. Najkritičnija patofiziološka promjena SAHS je kronična intermitentna hipoksija (3, 4). U nekoliko životinjskih modela, intrauterina hipoksija (IUH) dovodi do smanjenja srčane efikasnosti, dijastoličke i sistoličke disfunkcije, hipertrofičnog rasta, smanjene proliferacije kardiomiocita i odgođenog sazrijevanja kardiomiocita u fetalnom i novorođenačkom srcu, čime se povećava rizik od srčanih poremećaja kod odraslih potomaka ( 5). Programski efekat hronične hipoksije uglavnom može objasniti mehanizam u kritičnim fazama razvoja srca, koji dovodi do pojačavanja srčanog oksidativnog stresa i povećanja apoptoze ćelija u potomstvu (6-9). Kon pt razvojnog programiranja ima smisla jer je naša fiziologija mnogo savitljivija i plastičnija tokom ranog života. Intrauterino stanje određuje i programira koncepte fiziologije i metabolizma našeg života. Shodno tome, adaptivni odgovor fetusa na IUH dovodi do razvoja kardiovaskularnih bolesti odraslih (10). Mitohondrije su složene organele koje igraju ključnu ulogu u generiranju ćelijske energije i bezbroj signalnih događaja u podrumu. Strukturni i funkcionalni integritet mitohondrija je kritičan za opstanak kardiomiocita, a kada je ugrožen, poremećaj mit-hondrijalne homeostaze rezultira razvojem karakoloških bolesti. Nedavno je nekoliko studija fokusirano na ulogu mitohondrijalne disfunkcije koja izaziva kroničnu prenatalnu hipoksiju u posredovanju oštećenja srca kod potomaka. Prijavljeno je da je ta mitohondrijalatorna funkcija bila poremećena, a ekspresija nekoliko pravila mitohondrijalnog mola promijenila je perinatalno srce izloženo IUH (11). Štaviše, IUH dovodi do smanjene enze aktivnosti mitohondrijalnog kompleksa i disfunkcije srca kod potomaka nakon ishemije miokarda (12). U skladu s tim, ova studija je imala za cilj otkriti molekularnu vezu između prenatalne hipoksije, oksidativnog stresa, mitohondrijalnog poremećaja i srčanih ozljeda kod novog potomstva (13).

Razvoj i sazrijevanje ovog mitohondrijalnog sistema velikog volumena u miokardu se uglavnom dešavaju u perinatalnim i postnatalnim fazama razvoja, prvenstveno zbog srčanog metaboličkog pomaka od upotrebe glukoze ili masnih kiselina za stvaranje adenozin 5'-trifosfata (ATP) nakon rođenja. (14). Novi dokazi ukazuju na to da su mehanizmi kontrole kvaliteta mitohondrija (MQC) kritične determinante za sazrijevanje kardiomiocita (15). Kontrola kvaliteta mitohondrija, uglavnom uključujući mitohondrijalnu biogenezu, mitofagiju zajedno sa dinamikom, fino podešenu regulatornu mrežu, orkestrira količinu i kvalitet mitohondrija i poboljšava funkciju mitohondrija i preživljavanje kardiomiocita u uslovima stresa (16). Peroksizomski proliferatori-aktiviraju receptore (PPAR) koaktivator 1 (PGC-1) ​​igra ključnu ulogu u pokretanju mitohondrijalne biogeneze i funkcije u srcu (17). Peroksizomski proliferatori-aktiviraju receptore koaktivator 1 / (-/-) srca miševa pokazuju znakove defekta sazrevanja i ozbiljne abnormalnosti u mitohondrijskoj funkciji i gustini (18). Nadalje, brisanje mitofagijskog medijatora Parkina sprječava morfološko i funkcionalno sazrijevanje mitohondrija u neonatalnom stadiju (19). Mitohondrije su vrlo dinamične organele, koje prolaze kroz stalne događaje fisije i fuzije povezane s njihovom funkcijom. U kasnom embrionalnom periodu, genetska ablacija mitohondrijalne fuzije pro u MFN1 i MFN2 kod miševa, specifična za auto ac, pokazuje tešku mitohondrijalnu disfunkciju nakon rođenja i razvija kardiomiopatiju (20). Zapanjujuće je da je nedavna studija otkrila da je kronična hipija poremetila mitohondrijalnu dinamiku u prednjem mozgu fetusa gui i svinje (21). Shodno tome, MQC može djelovati kao žarište u razvoju ozljede miokarda kod IUH neonatalnog potomstva. Međutim, malo se zna o efektima prenatalne hipoksije na neonatalni srčani MQC sistem i efektu MQC disfunkcije na zdravlje srca novorođenčeta. Ova studija je preuzela ovu misiju istraživanja mitohondrijalnog mehanizma oštećenja miokarda izazvanog IUH kod novih potomaka i daljeg istraživanja preventivnih strategija za smanjenje srčane ozljede IUH.

Poliamini (PA), uključujući putrescin (PU), spermidin (SPD) i spermin (SP), prisutni su u gotovo svim živim organizmima i neophodni su za embrionalni i fetalni opstanak, rast i razvoj (22-24) . Studije su otkrile da ovce izložene IUH mogu poboljšati embrionalnu displaziju dodavanjem egzogenih poliamina (25, 26). Nadalje, sve veći broj literature ukazuje na ulogu poliamina u uklanjanju slobodnih radikala i zaštiti DNK, proteina i lipida od štetnog oštećenja oksidativnog stresa. Također je otkriveno da suplementacija poliaminom produžava životni vijek u modelnim organizmima putem antioksidativnih, protuupalnih i pro-trija koji induciraju mitofagiju (27-29). Nedavne studije su dokumentirale da je suplementacija SPD-om u ishrani kardioprotektivna i produžava životni vijek i kod miševa i kod ljudi stimulirajući mitofagiju i mitohondrijsko disanje i poboljšavajući funkciju srca (30, 31). Što je još važnije, ranije smo izvijestili da je izloženost majke hipoksiji u kasnim fazama fetalnog razvoja rezultirala iscrtanom analistom i povećanim katabolizmom poliamina u karak tkivu novorođenih pacova. SPD je spriječio ozljedu srca kod potomaka pacova koji su bili izloženi IUH tako što je inhibirao mitohondrijalnu mentaciju (32).

2. Ciljevi

U ovoj studiji se pretpostavlja da IUH indukuje mitohondrijalnu strukturu i funkcionalne deficite povećanjem oksidativnog stresa i uništavanjem MQC mehanizma u srcu novorođenčeta, a pretpostavlja se da SPD liječenje majke in utero smanjuje ozljedu miokarda smanjenjem programa razvoja mitohondrija. Ova studija može doprinijeti razvoju preventivnih ili terapijskih strategija za IUH potomke za prevenciju kardiovaskularnih bolesti odraslih.

3. Metode

3.1. Životinje

Mužjaci i ženke Wistar štakora (stari 3 mjeseca) kupljeni su od Odjela za laboratorijske životinje na Harbinskom medicinskom univerzitetu. Sve procedure je odobrila Etička komisija Medicinskog univerziteta u Harbinu (Kina), a svi eksperimenti su sprovedeni prema smjernicama Nacionalnog instituta za zdravlje. Pacovi sa omjerom mužjaka i ženke 2:1 nasumično su stavljeni u kavez za parenje. Sljedećeg dana rađeni su vaginalni brisevi kako bi se otkrilo prisustvo sperme u vaginalnim čepovima ili vaginalnim brisevima, što je potvrđeno kao nulti dan trudnoće. Gravidne pacove su držane u prostoriji sa kontrolisanom vlažnošću (60 odsto) i kontrolisanom temperaturom (21 stepen), a ciklus svetlo-mrak je bio 12:12 sati.

3.2. Model intrauterine hipoksije

Od 15. do 21. dana trudnoće pacovi u grupi hipoksije (n=10) su stavljeni u zatvorenu komoru od pleksiglasa, ubrizgane zrakom i dušikom, te praćene analizatorom kiseonika (Pro OX12{{13 }}; BioSpherix, New York, SAD) i inhaliran sa sadržajem kiseonika od 10 posto četiri sata dnevno. Uzorci arterijske krvi uzeti su iz desne femoralne arterije, izmjereni su plinovi u krvi i pH vrijednosti kako bi se održao parcijalni pritisak arterijskog kiseonika od 50 - 55 mmHg, zasićenost krvi kiseonikom je održavana na 80 - 85 procenata, i specifične procedure su izvedene kao što je prethodno opisano (32). Eksperimentalne ženke štakora su nasumično podijeljene u četiri grupe: kontrolna grupa (kontrolna), grupa intrauterine hipoksije (Hpx), grupa intrauterine hipoksije plus spermidin (Hpx-Spd) i grupa intrauterine hipoksije plus spermidin plus inhibitor (Hpx-Spd-DFMO). ). Šest pacova po grupi je intraperitonealno ubrizgano 15. - 21 dana trudnoće. Pacovima je davan 0,9-postotni fiziološki rastvor (1 mL/kg/d) u kontrolnoj i Hpx grupama, SPD (5 mg/kg/d) u Hpx-Spd grupi i SPD (5 mg/kg/d) i difuorometija -L-ornitin (DFMO, inhibitor ključnog enzima sinteze poliamina ODC) (5 mg/kg/d) u Hpx-Spd-DFMO grupi, respektivno. Nakon porođaja, 1-dnevna novorođenčad su žrtvovana, a njihova srca su izvađena za naknadne eksperimentalne studije.

3.3. Histološka analiza

Tkivo lijeve komore pacova je izrezano na debljinu od < 1 cm, fiksirano sa 4 posto paraformaldehida, dehidrirano alkoholom i stavljeno u parafin. Ugrađeni parafin je isečen na kriške debljine 5 mm, zatim osušen na konstantnoj temperaturi peći od 60 stepeni, devoskaran ksilenom, a zatim bojenje hematoksilin-eozinom (HE). Rezovi tkiva su posmatrani da bi se procenile promene u srčanoj morfologiji i strukturama pomoću optičkog mikroskopa (Eclipse E200; Nikon, Tokio, Japan).

3.4. Imunofluorescentna analiza

Ki67 imunofluorescentno bojenje izvedeno je kao što je prethodno opisano (33). Ukratko, tkivo lijeve komore pacova je fiksirano u 4 posto formalina, ugrađenog u parafin; deparatizacija, hidratacija i popravak antigena prvo su završeni. Ta tkiva su blokirana sa 0.5 posto goveđeg serumskog albumina tokom 2 sata, a zatim su inkubirana sa Ki67 zečjim monoklonskim antitelom (1:100, AF1738, Beyotime, Kina) na 4 stepena preko noći. Nakon ispiranja sa PBS, tkivo je inkubirano sa Alexa fluorom označenim kozjim anti-zečjim IgG (1:500, A 0468, Beyotime, Kina) i obojeno DAPI za jezgra. Slike su pregledane i skenirane pod laserskom konfokalnom mikroskopijom (OLYMPUS, FV1000, Japan). Softver je korišten za analizu kolokalizacije spojenih slika.

3.5. Kvantifikacija fibroze

Srčana fibroza je procijenjena Massonovim trihromskim bojenjem. Kao što je gore opisano, preseci srčanog tkiva novorođenih pacova su devoskani i hidrirani standardnim metodama, a zatim obojeni Massonovim trihromom u skladu sa protokolima. Za svako srce korišćena su dva nesusedna preseka. Procenat fibroznog područja u ukupnom području miokarda lijeve komore analiziran je korištenjem softvera ImageJ, vl.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.6. TdT posredovano dUTP Nick End označavanje i mjerenja apoptotičkih ćelija

TdT-posredovani dUTP nick end labeling test (TUNEL) korišćen je za određivanje broja apoptotičkih ćelija u jednodnevnim neonatalnim srcima pacova. Srčana tkiva su tretirana prema našoj prethodno opisanoj proceduri korištenjem kompleta za otkrivanje smrti ćelije (Roche, Njemačka) prema uputama proizvođača. Procenat apoptotičkih ćelija je procenjen na tri dijapozitiva iz svakog bloka. Četiri polja slajdova su nasumično ispitana uz povećanje od 200×. Ukupno je izbrojano 100 ćelija u svakom polju.

3.7. Mjerenje aktivnosti antioksidativnih enzima

Aktivnost superoksid dismutaze (SOD) i katalaze (CAT) mjerene su korištenjem komercijalnih kompleta (SOD: A001-3- 1 i CAT: A007-1-1; Jiancheng Bio. Institut, Nanjing, Kina) sa spektrofotometrom (Perkin- Elmer, Norwalk, CT, Sjedinjene Američke Države). Prema uputama proizvođača, operacija je završena, a koncentracija proteina je mjerena metodom bicinhoninske kiseline (Pierce, Rockford, Sjedinjene Američke Države) sa goveđim serumskim albuminom (BSA) kao standardom (34).

3.8. Mjerenje sadržaja adenozin 5'-trifosfata

Sadržaj ATP-a u srčanom tkivu mjeren je pomoću kompleta za analizu ATP-a (S0026B, Beyotime, Bio. Institute, Kina). Prema uputstvu proizvođača, lizat je dodat u proporciji prema težini tkiva, homogenizovan staklenim homogenizatorom, a zatim centrifugiran na 4 stepena 12000 g. Supernatant je uzet, a sadržaj ATP-a u svakom uzorku detektovan je luminometrom (NanoDrop, Nanodrop2000, Thermo, USA) BCA kompletom (P0012s, Beyotime, Bio. Institute, Kina). Metoda bicinhoninske kiseline je korištena za određivanje koncentracije proteina, a zatim pretvaranje koncentracije ATP-a u nmol/g proteina.

3.9. Transmisiona elektronska mikroskopija

Srčano apikalno tkivo je secirano na otprilike 1 mm × 1 mm × 1 mm male komadiće i zatim fiksirano u glutaraldehid fosfatnom puferu na 4 stepena. Nakon rutinske dehidracije, namakanja, ugradnje i bojenja, napravljeni su ultratanki rezovi od 50 - 70 nm. Ultrastruktura srčanog tkiva posmatrana je transmisijskim elektronskim mikroskopom (TEM) i fotografisana (H600 Hitachi, Tokio, Japan). Pojedinačne mitohondrije i miofilamenti su mapirani pod uslovom povećanja od 10000 puta pomoću softvera Image J verzije 1.80 (National Institutes of Health), a njihove površine su izmjerene iz svakog srca (35). U međuvremenu, identificirani su mitohondrijski fragmenti < 1 µm3, koji nisu podijeljeni (obično okrugli), a prosječan postotak mitohondrijalnih fragmenata u vidnom polju je prebrojan korištenjem Mitochondrial Fragmentation Index (MFI).

3.10. Mitochondrial Isolation

Mitohondrije su izolovane na 4 stepena korišćenjem diferencijalnog centrifugiranja sa kompletom za izolaciju mitohondrija (Beyotime Biotechnology, Šangaj, Kina). Ukratko, svježe srčano tkivo je izrezano na komade tkiva i centrifugirano sa 10 volumena prethodno ohlađenog PBS-a, supernatant je odbačen, talog je digestiran tripsinom 20 minuta, dodani izolacijski pufer A je centrifugiran, supernatant je prebačen u drugi epruveta, ponovo centrifugirana, a precipitirana frakcija je izolovana mitohondrija. Konačna srčana mitohondrijska peleta je resuspendirana u puferu za homogenizaciju, pohranjena na ledu i korištena za eksperimente s funkcijom disanja mitohondrija unutar 4 sata.

3.11. Mjerenje potrošnje mitohondrijalnog kisika

Potrošnja kisika u mitohondriji mjerena je kisikovom elektrodom tipa Clark (Hansatech Instruments, Norfolk, UK) u puferu za disanje mitohondrija. Piruvat (5 mM) i malat (5 mM) korišteni su kao supstrat za mitohondrije koje sadrže kompleks I u konačnoj koncentraciji od 500 µg proteina/mL. ADP-stimulirana potrošnja kisika (stanje 3 disanje) mjerena je u prisustvu 200 µM ADP-a, a praćena je potrošnja kisika nezavisna od ADP-a (stanje 4 disanje). Omjer kontrole disanja (RCR, stanje 3 podijeljeno sa stanjem 4) odražava potrošnju kisika fosforilacijom (spojom). Postupci su nastavljeni, kao što je prethodno opisano (36).

3.12. Western blot analiza

Uzorak srčanog tkiva je sakupljen i pohranjen na -80 stepenu. Zamrznuta srčana tkiva leve komore su homogenizovana u ledeno hladnom RIPA puferu za lizu (Beyotime Inc., Šangaj, Kina P0013B). Koncentracije proteina su kvantificirane korištenjem kompleta za analizu proteina BCA (Beyotime Inc., Šangaj, Kina P0006C). Uzorci koji sadrže ukupni protein razdvojeni su sa 10 posto (w/v) SDS-PAGE i prebačeni na PVDF membranu (Millipore, Bedford, MA, Sjedinjene Države). Korištena su sljedeća antitijela: Antitijela za GAPDH (1:2000,10494-1-AP), MFN2 (1:1000,12186-1- AP), SIRT-1 (1:1000,{{16 }}AP), NRF-2 (1:600,16396-1-AP), TFAM (1:1000,19998-1-AP) i BAX (1.1000,509599-2-Ig) kupljeni su od Proteintech (WuHan, Kina), BCL2 (1: 2000, sc-7382) i DRP1 (1:1000, sc-271583) kupljeni su od Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) i PGC -1 (1:1000, ab106814, Abcam, Cambridge, MA, UK). Sekundarno antitijelo (kozji anti-zečji IgG označen peroksidazom hrena) je iz Beyotime Corporation (Šangaj, Kina). Intenzitet proteinskih traka je kvantifikovan korišćenjem Fluor Chem Chemiluminescence gel sistema za snimanje (Protein Simple, SAD). Optička gustina proteinskih traka analizirana je softverom Image J verzija l.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.13. Model hipoksičnog kardiomiocita

Kardiomiociti novorođenčadi štakora (NRMC) su izolovani i kultivisani standardnim metodama, kao što je prethodno opisano (32). Ukratko, srca trodnevnih novorođenih pacova su ekstrahirana, mljevena, kultivirana, a zatim digestirana u 0.25 posto tripsina i 0.02 posto EDTA (Beyotime Biotechnology, Šangaj, Kina). Nakon centrifugiranja, precipitati su prebačeni u DMEM sa dodatkom 10% fetalnog telećeg seruma (Biolot, Rusija) i inkubirani u vlažnom vazduhu koji sadrži 5% 2. Tri dana nakon zasijavanja, ćelije su stavljene u staklenu hipoksičnu komoru (Biospherix OxyCycler C42 , Redfield, NY) i punjena dušikom 8 minuta da bi se oslobodio preostali kisik. Ovi kardiomiociti su nasumično podijeljeni u sljedeće grupe: (1) Kontrolna grupa (kontrola), ćelije uzgajane u normalnim uslovima inkubacije; (2) grupa hipoksije (Hpx), ćelije smeštene u hipoksičnu komoru na 24 h, a zatim normalno kultivisane 24 h; (3) Hpx-Spd grupa, ćelije smeštene u hipoksičnu komoru i inkubirane sa 10 µmol/L SPD tokom 24 h; (4) Hpx-SpdDFMO grupa, ćelije smeštene u hipoksičnu komoru i inkubirane sa 10 µmol/L SPD plus 2 mmol/L DFMO tokom 24 sata.

3.14. Mjerenje vrsta reaktivnog kisika

Generacija ROS-a je izmjerena testom bojenja dihidroetidijem (DHE) (kat. br. S0063, Beyotime, Kina). Ukratko, primarni kardiomiociti su inkubirani sa 5 µmol/L DHE na 37 stepeni tokom 30 minuta, isprani PBS-om, a zatim premešteni pod mikroskopom da se posmatraju promene u intenzitetu fluorescencije. Slike su snimljene fluorescentnim mikroskopom Olympus FluoView FV1000 (Olympus Optical Co., Ltd., Takachiho, Japan) na talasnoj dužini ekscitacije od 535 nm, a maksimalna talasna dužina emisije bila je 610 nm, n > 20 ćelija po grupi.

3.15. Određivanje potencijala mitohondrijske membrane

Boja tetrametilrodamin etil ester (TMRE) je pozitivno nabijena i može se selektivno locirati u mitohondrijima. Široko se koristi za određivanje potencijala mitohondrijske membrane (∆Ψm). Ukratko, radna otopina za bojenje TMRE u koncentraciji od 200 µmol/L dodana je grupisanim tretiranim kardiomiocitima, temeljito promiješana i stavljena u ćelijski inkubator na 37 stepeni na 20 minuta. Supernatant je aspiriran, a ćelije su isprane PBS-om i prebačene u invertirani mikroskop kako bi se uočila promjena intenziteta fluorescencije. Talasna dužina ekscitacije bila je 549 nm, a emisiona svjetlost je bila 579 nm. Intenzitet crvene fluorescencije je ukazivao na promjenu ∆Ψm, n > 20 ćelija po grupi.

3.16. Eksperiment mitohondrijske i lizozomalne lokalizacije

Prema uputstvu, Mito-Tracker Green (NO.C1048, Beyotime, Kina) i Lyso-Tracker Red (NO.C1046, Beyotime, Kina) koristili su analizu mitohondrijalne i lizozomalne kolokalizacije. NRCM su napunjeni sa 200 nM MitoTracker Green FM i 50 nM LysoTracker Red u HBSS 30 minuta prije eksperimenata, ćelije su isprane PBS-om, a zatim su slike ćelija dobijene pomoću Olympus FluoView FV1000 fluorescentnog mikroskopa. Laserska linija od 488 nm korištena je za pobuđivanje MitoTracker Green fluorescencije, mjerene između 505 i 515 nm. Za LysoTracker Red, korišćena je laserska linija od 577 nm sa merenjem od 590 nm. Preklapanje intenziteta crvenog i zelenog piksela određen je korišćenjem softvera za kvantifikaciju na Nikon Eclipse mikroskopu, n > 20 ćelija po grupi.

3.17. Statistička analiza

Svi podaci iz eksperimentalnih grupa upoređeni su korištenjem jednosmjerne ANOVA praćene Bonferronijevim post hoc testom sa softverom GraphPad Prism verzije 8 (GraphPad Software Inc., La, Jolla.CA) i SPSS softverom verzije 17.1 (SPSS, Chicago, IL, United države). Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM, a nivo značajnosti je postavljen na P < 0.05.

4. Rezultati

4.1. Potomstvo i karakteristike srca

Izmjerene su tjelesna težina (TW) i težina srca (HW), a izračunat je i odnos HW prema BW (HW/TW) (Slika 1). Rezultati su pokazali da je kod novorođenih pacova došlo do smanjenja tjelesne težine i tjelesne težine, a povećanja tjelesne težine/TW zbog intrauterine hipoksije. U poređenju sa IUH grupom, BW i HW novorođenih pacova u SPD grupi su se povećali (P < 0.05), a HW/BW se smanjio (P < 0. 05); U poređenju sa SPD grupom, i BW i HW grupe na tretmanu DFMO su se smanjile (P < 0,05), a HW/BW značajno porasle (P < 0,05).

4.2. Učinci SPD-a na morfološku strukturu miokarda, proliferaciju stanica i fibrozinu novorođenčad izloženu

Rezultati srčanog HE bojenja pokazali su da su srca jednodnevnih potomaka izloženih IUH pokazala otok i labavo raspoređena miokardna vlakna. Međutim, IUH srca tretirana SPD-om zadržala su prihvatljivu strukturu tkiva miokarda (Slika 2A). Zatim smo procijenili broj binuklearnih kardiomiocita sa HE obojenim kriškom tkiva; broj binuklearnih kardiomiocita bio je veći u IUH grupi nego u kontrolnoj grupi (P < 0.05). U poređenju sa IUH grupom, udio binuklearnih kardiomiocita u SPD liječenoj grupi se značajno smanjio (P < 0.05); DFMO je umanjio efekat SPD (P < 0.05) (Slika 2C). Dalje smo detektovali ekspresiju Ki67 (marker ćelijske proliferacije) u miokardu pacova metodom imunofluorescencije. Što je veća ekspresija Ki67, to je jača ružičasta fluorescencija spajanjem crvene i plave (slika 2E). Rezultati su pokazali da je u poređenju sa kontrolnom grupom ekspresija Ki67 u IUH grupi značajno smanjena (P < 0.05), ekspresija Ki67 značajno povećana nakon davanja SPD (P < { {28}}.05), a efekat SPD je ukinuo DFMO (P < 0,05) (Slika 2F). Ovi rezultati pokazuju da SPD može inhibirati prerano povlačenje kardiomiocita iz ćelijskog ciklusa izazvano IUH i promovirati proliferaciju kardiomiocita u novom potomstvu izloženom IUH. Zatim smo koristili Massonovo bojenje da bismo otkrili promjene u sadržaju kolagena u miokardu i procijenili fibrozu miokarda mjerenjem površine kolagena (Slika 2BandD). Ustanovili smo da je taloženje kolagena u miokardu u srcima novorođenih pacova izloženih IUH povećano (P < 0,05), čiji je nivo viši u odnosu na kontrolnu grupu. Naprotiv, područje fibroze miokarda nakon tretmana SPD značajno je smanjeno (P < 0,05). Međutim, u poređenju sa grupom koja je primala SPD, područje fibroze se značajno povećalo u HpxSpd-DFMO grupi (P < 0,05).

4.3. Učinci spermidina na miokardijalnu mitohondrijalnu strukturu, respiratornu funkciju i sadržaj adenozin 5'-trifosfata u novorođenčadi izloženoj intrauterinoj hipoksiji

Promjene ultrastrukturne strukture srčanog tkiva i karakteristike mitohondrija analizirane su TEM (slika 3A). Image J softver je korišten za kvantifikaciju procenta mitohondrijalnog sadržaja (mitohondrijalnog područja u cijeloj ćelijskoj oblasti) i mitohondrijalnog područja (slike 3B i C). Rezultati su pokazali da su u kontrolnoj grupi miofilamenti miokarda uredno raspoređeni, struktura sarkomera jasna, mitohondrije kompaktne, matriks gušći, a mitohondrijalne kriste uredno raspoređene. Međutim, mitohondrije su nabubrile, a labavljenje matriksa i smanjena gustoća uočeni su u nekim kardiomiocitima IUH grupe. U poređenju sa kontrolnom grupom, smanjen je udio mitohondrija u kardiomiocitima i površina mitohondrija (P < 0.05). Međutim, u srcima štakora na SPD tretmanu, miofilamenti miokarda su bili uredni, struktura sarkomera je bila jasna, mitohondrijski matriks je bio kompaktan, a oticanje mitohondrija je smanjeno. U poređenju sa IUH grupom, povećan je udio mitohondrija u kardiomiocitima (P < 0.05), a povećana površina mitohondrija (P < 0,05). DFMO je inhibirao ove efekte izazvane SPD (P < 0,05).

Koristili smo piruvat/malat kao supstrat za procjenu respiratorne funkcije mitohondrija, uključujući stanja 3 i 4 respiratorne stope i RCR (Slika 3D - F). Primijetili smo da su u poređenju sa kontrolnom grupom, stopa disanja u stanjima 3 i 4 i RCR grupe IUH bili značajno niži (P < 0.{{10}}}5). Zanimljivo je da se RCR stanja 3 i 4 oporavio nakon SPD tretmana (P < 0.05). Nasuprot tome, ovi SPD efekti su značajno inhibirani u grupi koja je primala DFMO (P < 0.05). Slično, u poređenju sa kontrolnom grupom, sadržaj ATP u miokardu u IUH grupi je značajno smanjen (P < 0,05). U poređenju sa IUH grupom, sadržaj ATP je značajno povećan u grupi koja je tretirana SPD (P < 0,05), a DFMO je umanjio efekte SPD (P < 0,05) (Slika 3G). Ovi nalazi sugeriraju da SPD može zaštititi miokardijalnu mitohondrijalnu strukturu i oštećenje funkcije i spriječiti pad nivoa ATP-a kod neonatalnih potomaka pacova izloženih IUH.

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】