Spermidin ublažava oštećenje mitohondrija miokarda novorođenčeta kod potomaka izazvano intrauterinom hipoksijom kod pacova tako što inhibira oksidativni stres i reguliše kontrolu kvaliteta mitohondrija, 2. dio

4.4. Učinci spermidina na antioksidativnu aktivnost miokarda i apoptozu kod novorođenčeta izloženog intrauterinoj hipoksiji

Glikozid cistanche takođe može povećati aktivnost SOD u tkivima srca i jetre, te značajno smanjiti sadržaj lipofuscina i MDA u svakom tkivu, efikasno hvatajući različite reaktivne radikale kisika (OH-, H₂O₂, itd.) i štiteći od oštećenja DNK uzrokovanih od strane OH-radikala. Cistanche feniletanoidni glikozidi imaju snažnu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala, veću redukcijsku sposobnost od vitamina C, poboljšavaju aktivnost SOD u suspenziji sperme, smanjuju sadržaj MDA i imaju određeni zaštitni učinak na funkciju membrane sperme. Cistanche polisaharidi mogu pojačati aktivnost SOD i GSH-Px u eritrocitima i plućnim tkivima eksperimentalno starenja miševa uzrokovanih D-galaktozom, kao i smanjiti sadržaj MDA i kolagena u plućima i plazmi, te povećati sadržaj elastina. dobar učinak čišćenja na DPPH, produžava vrijeme hipoksije kod starijih miševa, poboljšava aktivnost SOD u serumu i odlaže fiziološku degeneraciju pluća kod eksperimentalno starenja miševa. i ima potencijal da bude lijek za prevenciju i liječenje bolesti starenja kože. U isto vrijeme, ehinakozid u Cistancheu ima značajnu sposobnost uklanjanja slobodnih radikala DPPH i može hvatati reaktivne vrste kisika, spriječiti razgradnju kolagena izazvanu slobodnim radikalima, a također ima dobar učinak popravljanja oštećenja anjona slobodnih radikala timina.

Kliknite na Kako koristiti Cistanche Tubulosa

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Kolorimetrijom smo mjerili aktivnosti antioksidativnih enzima SOD i CAT u miokardu (Slike 4A i B). Utvrđeno je da su aktivnosti SOD i CAT u IUH grupi bile značajno niže od onih u kontrolnoj grupi (P < 0.05); U poređenju sa IUH grupom, aktivnosti SOD i CAT u SPD grupi su značajno porasle (P < 0.05), a DFMO je ukinuo efekat SPD (P < 0. 05). Nakon toga, procijenili smo ćelijsku apoptozu otkrivanjem TUNEL-pozitivnih jezgara (Slika 4CandD) i ekspresijom pro-apoptoznog proteina BAX i anti-apoptoznog BCl-2 (Slike 4E i F). Primijetili smo da su broj TUNEL pozitivnih kardiomiocita i odnos ekspresije proteina BAX/BCL2 bili znatno veći u IUH grupi od onih u kontrolnoj grupi (P < 0,05). Nasuprot tome, odnos TUNEL-pozitivnih ćelija i odnos ekspresije proteina BAX/BCL2 bio je niži u miokardu pacova tretiranih SPD nego u IUH grupi (P < 0,05). DFMO je eliminisao efekat SPD (P < 0,05). Ukratko, SPD dat in utero može preokrenuti smanjenje aktivnosti antioksidativnih enzima i povećanje apoptoze ćelija u srcima potomaka izazvano IUH.

4.5. Učinci spermidina na proizvodnju reaktivnih vrsta kisika, potencijal mitohondrijske membrane i mitofagiju u kardiomiocitima izloženim hipoksiji

Mitohondrijska disfunkcija se uglavnom manifestuje kao povećanje proizvodnje ROS, smanjenje sinteze ATP-a i nakupljanje disfunkcionalnih mitohondrija. Potencijal mitohondrijske membrane (∆Ψm) je elektrohemijski gradijent protona (H plus koncentracijski gradijent i razlika transmembranskog potencijala) preko unutrašnje membrane mitohondrija, koji nastaje tokom prenosa elektrona mitohondrijalnog oksidativnog respiratornog lanca, u kojem je mali broj ROS-a. proizvedeno. Shodno tome, nivo ROS i promjene ∆Ψm su glavni indikatori mitohondrijalne funkcije. Prekomjerna proizvodnja ROS-a rezultira nakupljanjem disfunkcionalnih mitohondrija; oštećeni mitohondriji se uglavnom uklanjaju mitofagijom. Da bismo istražili da li egzogeni SPD može uticati na integritet mitohondrijalne funkcije u kardiomiocitima u uslovima hipoksije, prvo smo ispitali nivoe ROS koristeći DHE fluorescentnu sondu (slika 5A). Uočili smo da se proizvodnja ROS povećala nakon što su kardiomiociti bili izloženi hipoksiji 24 h (P < 0.05) i da je SPD inhibirao proizvodnju ROS-a izazvanu hipoksijom (P < 0 .05); međutim, DFMO je ukinuo smanjenje proizvodnje ROS posredovano SPD-om kada je DFMO isporučen kardiomiocitima tretiranim SPD-om (P < 0.05) (Slika 5C). Nadalje, ∆Ψm je detektovan pomoću TMRE fluorescentne sonde (slika 5B). Što je jači intenzitet crvene fluorescencije, to je veći mitohondrijski potencijal (P < 0.05). Primijetili smo da je intenzitet crvene fluorescencije bio značajno manji u IUH grupi nego u kontrolnoj grupi (P < 0.05). U poređenju sa IUH grupom, intenzitet crvene fluorescencije bio je veći u SPD tretmanu (P < 0,05), a DFMO je još jednom ukinuo efekte SPD (P < 0,05) (Slika 5D). Zatim smo procijenili kolokalizaciju mitohondrija (označenih sa MitoTracker zeleno) sa lizosomima (obilježenim Lyso-Tracker crvenom), što nam je omogućilo da izmjerimo autofagičnu degradaciju mitohondrija (slika 5E). Kao što je prikazano na slici 5F, u poređenju sa kontrolom, hipoksija je smanjila kolokalizaciju Mito-Tracker Green i Lyso-Tracker Red u kardiomiocitima (P <0,05). Međutim, u poređenju sa grupom sa hipoksijom, procenat kolokalizovanih mitohondrija i lizosoma bio je veći u grupi koja je tretirana SPD (P < 0,05), a DFMO je ukinuo efekat SPD (P < 0,05). Ovi rezultati sugeriraju da hipoksija povećava proizvodnju ROS i smanjuje ∆Ψm i mitofagiju; SPD može ublažiti oštećenje mitohondrija izazvano hipoksijom stimuliranjem mitofagije i inhibiranjem oksidativnog stresa.

4.6. Učinci SPD na MQC sistem miokarda kod novorođenih potomaka izloženih IUH

Kontrola kvaliteta mitohondrija (MQC), uključujući procese mitohondrijalne autofagije, mitohondrijalne biosinteze i mitohondrijalne fuzije i fisije, ključna je za održavanje normalne morfologije, količine i funkcije mitohondrija i osiguravanje normalne funkcije i metabolizma stanica. Mitofagija reguliše MQC i posreduje u ekstenzivnoj autofagnoj degradaciji mitohondrija kao odgovor na put i fiziološke promjene. Prvo smo procijenili mitofagiju promatranjem formiranja mitofagosoma pomoću TEM (Slika 6A - C). Prema rezultatima, neke abnormalne strukture ili fragmentirane mitohondrije bile su zatvorene unutar autofagne membrane sa dvostrukom membranom, koje su bili mitofagosomi, što je pokazalo da je mitofagija bila aktivna u kontrolnoj grupi. Međutim, broj mitofagosoma se jako smanjio u miokardu IUH grupe. Zanimljivo je da je miokard SDP grupe pokazao gotovo identične fenotipove mitofagije kao i kontrolne grupe, dok je DFMO ukinuo efekte izazvane SPD. Mitohondrije su vrlo dinamične organele, koje prolaze kroz stalne događaje fisije i fuzije povezane s njihovom funkcijom. Zatim smo ispitali fragmentaciju mitohondrija koristeći TEM (slika 6A). Otkrili smo da je broj malih i fragmentiranih mitohondrija značajno povećan za IUH, u poređenju sa kontrolom (P < 0.05), što ukazuje da je fisija mitohondrija u velikoj mjeri povećana. Ovu promjenu je obuzdao SPD tretman, a DFMO je također još jednom ukinuo ulogu SPD-a (Slika 6D). Nadalje, otkriveni su DRP1 i MFN2 (regulirajući proteini mitohondrijalne dinamike) (Slika 6E - G). MFN2 je značajno smanjen, dok se DRP1 povećao i uočen je u IUH grupi u poređenju sa kontrolnom grupom (P < 0.05). Dok je DRP1 bio sniženo reguliran, a MFN2 pojačan tretmanom egzogenog SPD-a (P < 0.05), DFMO je ukinuo efekte izazvane SPD-om. Biosinteza mitohondrija koordinira se s mitofagijom kako bi se uklonile oštećene ili suvišne mitohondrije, stvorile nove mitohondrije i održala homeostaza MQC-a u uslovima stresa. Konačno, procijenili smo ekspresiju proteina povezanih s mitohondrijskom biosintezom, uključujući SIRT-1, PGC-1, NRF-2 i TFAM, imunoblot analizom (Slika 6H - L). U poređenju sa kontrolnom grupom, ekspresija SIRT-1, PGC-1, NRF-2 i TFAM značajno je smanjena u miokardu grupe IHU (P < 0,05). U poređenju sa IUH grupom, ekspresija proteina SIRT-1, PGC-1, NRF-2 i TFAM u SPD grupi značajno je povećana (P <0,05). DFMO je ukinuo efekat SPD (P < 0,05). Ukratko, ovi rezultati pokazuju da IUH dovodi do MQC disfunkcije u miokardu jednodnevnog potomstva i da SPD tretman značajno inhibira neravnotežu MQC sistema kod neonatalnog potomstva izloženog IUH.

5. Diskusija

Bolest srca je veliki zdravstveni izazov širom svijeta. Dokazano je da kronična fetalna hipoksija može izazvati fetalno porijeklo srčane disfunkcije i programirati povećani rizik od srčanih bolesti kod odraslih potomaka. Srce ima visoku brzinu metabolizma, a njegovo oslanjanje na mitohondrijalnu funkciju za proizvodnju energije je kritično za normalnu srčanu funkciju. Međutim, učinak IUH na srčanu mitohondrijalnu funkciju i s tim povezan mehanizam i fokus preventivne strategije kardio-protekcije na mitohondrije kod novorođenčeta još uvijek su nepoznati. U ovoj smo studiji otkrili da štakori koji su jednodnevni potomci izloženi IUH pokazuju značajne abnormalnosti u rastu i razvoju, sazrijevanju kardiomiocita, posebno u strukturi i funkciji mitohondrija miokarda, i egzogeni SPD dodatak in utero može ublažiti ovaj IUH izazvan mijenjaju inhibiranjem oksidativnog stresa miokarda i smanjenjem apoptoze. Važno je da smo primijetili da prenatalni tretman SPD može značajno preokrenuti abnormalnosti mitofagije i biogeneze, te fragmentaciju mitohondrija u miokardu novorođenih potomaka pacova izazvanu IUH. Koliko nam je poznato, ovo istraživanje je bilo prvo izvješće o zaštitnom učinku SPD-a na oštećenje srca novorođenčeta izazvano IUH regulacijom MQC mehanizma i zatim poboljšanjem mitohondrijalne funkcije.

Dovoljni dokazi sugeriraju da intrauterina restrikcija rasta ometa razvojnu putanju fetalnih sistema, što može oštetiti funkciju srca kasnije u životu (5, 7, 37). U našoj studiji, IUH je uzrokovao zastoj u rastu i oštećenje srca kod novorođenih pacova potomaka, jer su jednodnevna novorođenčad pacova izložena IUH pokazala značajno smanjenje BW i HW i povećanje omjera HW/BW. Osim toga, poremećen je raspored vlakana miokarda, polomljeni su miofilamenti, uočena je infiltracija upalnih ćelija među miofilamentima, a povećano je taloženje kolagena u miokardu. Ovi nalazi su u skladu sa nalazima koje su objavili Ducsay et al. (2) i Thompson et al. (7). U nekoliko životinjskih modela, srca fetusa izložena kroničnoj hipoksiji pokazuju smanjeno sazrijevanje i proliferaciju kardiomiocita i smanjenu količinu kardiomiocita (38, 39). Slično, naše istraživanje je također pokazalo da se povećao udio binukleatnih kardiomiocita i smanjila ekspresija Ki67 u IUH grupi. Vrijeme u kojem kardiomiociti postaju bi/multi-nukleirani poklapa se s vremenom kada sisari gube svoj regenerativni potencijal (40). Sazrevanje srca fetusa je važno za zdravlje srca potomstva. Shodno tome, IUH čini da se kardiomiociti povuku iz ćelijskog ciklusa prije vremena, a poremećaj sazrijevanja kardiomiocita dovodi do narušene plastičnosti postnatalnog rasta srca.

Nepotrebno je napomenuti da su mitohondrije glavne ćelijske organele uključene u proizvodnju ROS; disfunkcionalne mitohondrije ne nastaju samo kao odgovor na smanjenu proizvodnju ATP-a, već i na povećani oksidativni stres i apoptozu (41). U ovoj studiji, IUH je značajno smanjio aktivnost antioksidativnih enzima SOD i CAT, smanjio respiratornu funkciju mitohondrija i nivoe ATP-a, povećao ekspresiju BAX/BCL2 i narušio mitohondrijalnu strukturu u miokardu jednodnevnih novorođenih štakora. Ove nalaze podržavaju i drugi istraživači (11), koji su dokumentirali da izlaganje majke hroničnoj hipoksiji tokom trudnoće može smanjiti aktivnost mitohondrijalnog kompleksa IV i inducirati apoptozu u srcima kratkoročnih fetalnih pacova. Tvrdili smo da bi mitohondrijski kompromis mogao biti temelj oksidativnog stresa i energetskog zastoja tokom fetalnog razvoja koji kulminira perinatalnim ozljedom srca. Ovo može biti glavni razlog povećanog kardiovaskularnog rizika kod potomaka trudnoća kompliciranih kroničnom fetalnom hipoksijom. Shodno tome, moguće je uzeti mitohondrije kao metu terapijske intervencije za zaštitu srčane funkcije kod potomstva. Aljunaidy et al. izvijestili su da je liječenje majke mitohondrijalnim antioksidansom MitoQ spriječilo placentni oksidativni stres, spasilo rast fetusa i poboljšalo srčanu funkciju kod potomaka izloženih IUH (42).

Spermidin je poliamin s različitim biološkim funkcijama. Kao što smo spomenuli, SPD može inhibirati akumulaciju ROS izazvanu H2O2- i spriječiti smanjenje potencijala mitohondrijalne membrane (MMP) i nivoa ATP-a u kardiomiocitima i ćelijama H9C2 neonatalnih pacova u kulturi. Štoviše, SPD može promovirati mitohondrijalnu biogenezu i poboljšati funkciju mitohondrija u srcu koji stari (43). Poliamini spermin i spermidin mogu uticati na dinamički mitohondrijski proteom, čime se sprečavaju promene u srčanim funkcijama koje su povezane sa starenjem i starenje srca (36). Druge studije su takođe pokazale da dodatak SPD odgađa starenje srca tako što poboljšava mitofagiju i promoviše mitohondrijalno disanje kod miševa (44). ODC je ključni enzim sinteze poliamina, a objavljeno je da in vivo rušenje ODC-a ili primjena DFMO, ireverzibilnog inhibitora ODC-a, dovodi do poremećenog razvoja koncepta i zastoja u rastu fetusa zbog nedovoljne dostupnosti poliamina (45, 46). Naša sadašnja studija pokazuje da tretman sa 5 mg/kg/d SPD-a kod pacova izloženih IUH sprečava usporavanje rasta i promenu srčane morfološke strukture i sazrevanja kod novorođenih potomaka. Štaviše, IUH-indukovano povećanje srčanog oksidativnog stresa, povećanje apoptoze i mitohondrijski respiratorni pad kod neonatalnog potomstva također su spriječeni SPD, dok je DFMO dat majci ukinuo SPD posredovanu zaštitu za neonatalno srce. Dobro je dokumentovano da poliamini učestvuju u placentnoj angiogenezi i embriogenezi, kao iu embrionalnom i fetalnom rastu i razvoju (47). Zhu et al. izvijestili su da su nivoi poliamina bili niži u plazmi pupčane vene zbog intrauterine restrikcije rasta (IUGR) svinjskih fetusa, a dodatni SPD za majku može spriječiti IUGR (48). Spermidin je spoj razumne sigurnosti i manje toksičnosti (49). Sve veći broj pretkliničkih i kliničkih studija je pokazao da dijetetski SPD ima zdravstvene učinke kao što su antiaging, kardiovaskularna zaštita, neuromodulacija i protuupalne funkcije, kao što je intraperitonealna injekcija SPD (50 mg/kg) kod miševa štiti od kolagena izazvanog artritis inhibicijom polarizacije M1 makrofaga u sinovijalnom tkivu (50). Suplementacija sa 10 mg/kg/d SPD-a preokrenula je pogoršanje srčane funkcije vezano za starenje kod pacova (36). Što je još važnije, majka je bila intervencija sa 5 mg/kg/d SPD tokom kasne trudnoće kako bi se poboljšalo smanjenje kognitivnih i neuralnih funkcija izazvano IU (51) i oštećenje srčanog oksidativnog stresa kod potomaka pacova (32). U skladu s tim, koristili smo istu dozu SPD (5 mg/kg/d) za trudne pacove izložene IUH kao u našoj prethodnoj studiji. Sumnjali smo da bi suplementacija SPD kod majke tokom hipoksične trudnoće mogla povećati nivoe SPD u fetalnoj cirkulaciji, što bi moglo biti povezano sa zaštitom od oksidativnog stresa koji rezultira placentom, koja će zaštititi mitohondrije u srcu u razvoju od programiranja IUH, djelovanjem SPD se može postići njegovim snažnim antioksidativnim, anti-apoptoznim i proliferacijskim mehanizmom koji potiče.

Mehanizmi kontrole kvaliteta mitohondrija neophodni su za održavanje normalne morfologije, broja i funkcije mitohondrija i osiguravanje normalne funkcije i metabolizma ćelija (16). Nedavni dokazi su otkrili da MQC mehanizmi igraju odlučujuću ulogu u perinatalnom sazrijevanju mitohondrija miokarda i razvoju srca (14). Gong et al. prvi je objavio da se nezrele fetalne mitohondrije direktno razgrađuju mitofagijom posredovanom Parkinom tokom ranog postnatalnog perioda (19). U međuvremenu, mitohondrijalna biogeneza se dramatično povećava (52), a faktori mitohondrijske fuzije i fisije se transkripcijski povećavaju u srcu nakon rođenja (20, 21). Međutim, mnogo se manje zna o učinku IUH na MCQ u miokardu neonatalnog potomstva. U ovoj studiji prvo smo primijetili da se broj mitofagosoma značajno smanjio u miokardu IUH grupe, što ukazuje da je IUH narušio mitofagiju miokarda novorođenih štakora. Zatim smo primijetili značajno smanjenu ekspresiju PGC-1 (ključnog regulatora mitohondrijalne biogeneze) i ekspresiju njegovih uzvodnih i nizvodnih signalnih molekula, uključujući SIRT-1, TFAM i NRF{{10} } u miokardu IUH grupe. Štaviše, otkrili smo da je izloženost IUH smanjila ili fragmentisala mitohondrije i povećala se ekspresija DRP1; međutim, ekspresija MFN2 je smanjena u miokardu novorođenih potomaka pacova, što sugerira da je fisija mitohondrija bila pojačana, a fuzija smanjena. Ovi nalazi odražavaju uzročno-posledičnu vezu između neravnoteže MQC mehanizma i oštećenja miokarda izazvanog IUH kod novorođenih potomaka. Ovi složeni MQC procesi funkcionišu zajedno jedni s drugima kako bi eliminirali disfunkcionalne mitohondrije na specifičan i ciljan način i koordinirali biogenezu novih organela, što je bitno za kardiovaskularnu homeostazu. Mnogi intracelularni i ekstracelularni signali mogu regulirati MQC događaje, uključujući oksidativni stres, potencijalni kolaps membrane, apoptozu i druge. Ovdje se neravnoteža mitohondrijske MQC može pripisati pojačanom oksidativnom stresu i povećanoj apoptozi u srcu potomaka pacova izloženih IUH. U skladu s tim, bitno je održavati odgovarajući MQC mehanizam kako bi se osigurala zdrava mitohondrijalna mreža u srcu novorođenih potomaka izloženih IUH.

S obzirom da su nivoi SPD u placenti snažno povezani sa ograničenjem rasta fetusa (53), SPD može regulisati MQC u drugom životinjskom modelu. Na primjer, SPD je moćan i specifičan induktor autofagije za produženje životnog vijeka, koji može zaštititi proces starenja nekoliko tkiva, uključujući srce, mozak i skeletne mišiće (44, 54, 55). Spermidin može ublažiti starenje srca poboljšanjem biogeneze mitohondrija (43). U ovoj studiji, primenili smo SPD na majčinim miševima i otkrili da SPD može normalizovati neravnotežu MQC miokarda kod potomaka izloženih IUH. Međutim, tretman majke ODC inhibitorom DFMO uklonio je efekte SPD, što ukazuje da bi SPD intervencija mogla spriječiti abnormalni MQC u miokardu jednodnevnih potomaka pacova izloženih IUH. Ukratko, odličan rad MQC u miokardiju novorođenih potomaka mogao bi poboljšati strukturu, funkciju i sazrijevanje mitohondrija, čime bi se ostvarila transformacija od intrauterinog kapaciteta glikolize do postnatalnog opskrbe energijom oksidacije masnih kiselina i ispunjavanja povećanog opterećenja srca nakon rođenja. . Nadalje, naš eksperiment na kardiomiocitima sugerira da SPD može inhibirati povećanje proizvodnje ROS izazvane hipoksijom, smanjenje ∆Ψm i poremećenu autofagičnu degradaciju mitohondrija. Zaključili smo da se korisni efekti SPD-a mogu pripisati povećanim nivoima SPD-a u placenti i cirkulaciji primjenom SPD-a majke, čime se štite mitohondrijalni mitohondrij potomaka od programiranja razvoja od strane IUH.

5.1. Zaključak

Ova studija naglašava da SPD terapija in utero može zaštititi miokard jednog dana – srce potomstva od štetnih efekata prenatalne hipoksije. Ove postnatalne promjene uzrokovane SPD-om mogu se postići antioksidacijom i anti-apoptozom i regulacijom MQC puteva, čime se smanjuje programirani razvoj mitohondrija u srcu izloženom IUH. Postoje neka ograničenja za ovu studiju. Nismo radili farmakokinetičke eksperimente na SPD-u, pa stoga ne možemo odrediti tačne nivoe SPD-a u fetalnoj cirkulaciji kada je majka primala SPD. U našim budućim studijama dalje ćemo istraživati ​​efektivnu koncentraciju SPD u krvi koristeći placentu fetusa. Sadašnji nalazi pružaju novi okvir za buduća istraživanja kako bi se definirala uloga SPD-a u prevenciji miokardijalnih mitohondrija neonatalnog potomstva IUH.

【Za više informacija:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】