[18F]-natrijum fluorid Autoradiografija Snimanje nefrokalcinoze u donorovim bubrezima i eksplantiranim bubrežnim alograftama

ali.ma@wecistanche.com

Stan Benjamens 1,2*, Ines F.Antunes2, Jan‑Luuk Hillebrands3, Melani Reijrink4, Marian LC Bulthuis3, Stefan P. Berger5, Cyril Moers1, Martin H. de Borst5, Riemer HJA Slart2,6 i RobertA. Pol1

Nefrokalcinozaprisutan je u čak 43 postobubregbiopsija alografta godinu dana nakon transplantacije i povezana je sa inferiornom funkcijom grafta i lošim preživljavanjem grafta. Proučavali smo [18F]-natrijum fluorid ([18F]-NaF) snimanje mikrokalcifikacija u bubrezima donora (n= 7) i eksplantiranebubregalografti (n= 13). Tri µm serijski preseci ugrađeni u parafin korišćeni su za histološku evaluaciju kalcifikacije (Alizarin Red; Von Kossa bojenje) i ex-vivo [18F]-NaF autoradiografiju. Slike su spojene kako bi se procijenilo da li područja mikrokalcifikacije odgovaraju područjima za unos [18F]-NaF. Na osnovu histoloških analiza, tubulointersticijalne i glomerularne mikrokalcifikacije bile su prisutne u 19/20 i 7/20 uzoraka, respektivno. Koristeći autoradiografiju, unos [18F]-NaF je pronađen u 19/20 uzoraka, sa značajno većom aktivnošću tragača ububregalograft u poređenju sa uzorcima bubrega umrlog donora (p {{0}}.019). Bojenje aktivnih mikrokalcifikacija Alizarinom crvenom pokazalo je dobru korelaciju (Spearmanov rho od 0.81, p < 0.001),="" a="" von="" kossa="" bojenje="" konsolidiranih="" kalcifikacija="" pokazalo="" je="" značajnu,="" ali="" slabu="" korelaciju="" (0.62,="" p="0.003)" sa="" aktivnošću="" [18f]-naf.="" ova="" korelacija="" između="" ex-vivo="" unosa="" [18f]-naf="" i="" histološki="" dokazanih="" mikrokalcifikacija,="" prvi="" je="" korak="" ka="" metodi="" snimanja="" za="" identifikaciju="" mikrokalcifikacija="" u="">nefrokalcinoza. Ovo može dovesti do boljeg razumijevanja etiologije mikrokalcifikacija i njihovog utjecaja na funkciju transplantacije bubrega.

Click to cistanche ekstrakt koristi kod bolesti bubrega

Nefrokalcinoza, definiran kao parenhimsko i tubularno taloženje kalcijum-oksalata (CaOx) ili kalcijum-fosfata (CaPhos), važan je faktor u opadanju funkcije grafta nakonbubregtransplantacija1–3. Taloženje CaOx i CaPhos se pripisuje visokim razinama serumskog oksalata, serumskog kalcija i serum fosfata kod pacijenata s kroničnimbubregbolest i/ili hiperparatireoza4,5. Incidencanefrokalcinoza, na osnovu biopsije alografta bubrega, iznosi 6 posto nakon 6 mjeseci, 25-43 posto u jednoj godini i do 79 posto nakon 10- godina nakonbubregtransplantacija5–7. Studije koje su se fokusirale na biopsije alografta bubrega u roku od godinu dana nakon transplantacije pokazale su povezanost između ranog prisustva taloženja kalcija i inferiorne funkcije grafa i lošeg preživljavanja grafa4,8,9. Međutim, ostaje nejasno da li ovi mikrokalcifikacije igraju aktivnu ulogu u disfunkciji alografta ili su samo pokazatelji dereguliranog mineralnog metabolizma.

Izlaziti s,bubregBiopsije alografta je jedina dijagnostička metoda za procjenu mikrokalcifikacija nakon transplantacije. Neinvazivan i pouzdan dijagnostički pristup omogućio bi ponovljena mjerenja, olakšavajući praćenje kalcifikacija tokom vremena i interventne studije s potencijalnim poboljšanjem ishoda za funkciju grafta i preživljavanje grafta nakon transplantacije bubrega10.

Pozitronska emisiona tomografija/kompjuterska tomografija (PET/CT) sa [18F]-natrijum fluoridom ([18F]-NaF) koristi se u kliničkoj praksi i eksperimentalnim studijama kao modalitet snimanja skeleta i krvnih sudova11–15. Dok je pouzdana vizualizacija vaskularnih mikrokalcifikacija otežana CT snimanjem, rezultati ex-vivo [18F]-NaF mikroPET snimanja dobro su korelirali sa histološki dokazanim mikrokalcifikacijama u ljudskim i životinjskim vaskularnim uzorcima16,17. Štaviše, rezultati nekoliko prospektivnih kliničkih studija pokazali su da se rana vaskularna aktivnost [18F]-NaF dobro odnosi na mikrokalcifikacije, otkrivene CT snimanjem, i što je još zanimljivije, povećanje veličine ovih kalcifikacija18-20.

Ovdje predstavljamo rezultate studije o dokazu koncepta autoradiografije za ex-vivo korištenje [18F]-NaF snimanjanefrokalcinozakod donatorabubrezii transplantirani alotransplantati bubrega kao dijagnostički pristup za vizualizaciju mikrokalcifikacija.

Tabela 1.Bubregkarakteristike primaoca transplantata. Nema slučajeva hiperkalcemije u ovoj kohorti; *klasifikacija Banfove klasifikacije patologije alografta—201828; FSGS=Fokalna segmentalna glomeruloskleroza; IFTA=Intersticijska fbroza i tubularna atrofija; odgovarajući autoradiografski i histološki rezultati predstavljeni su u Dodatku S1.

Tabela 2. Pokojnicibubregkarakteristike donatora. *Kardiovaskularna bolest definisana kao cerebrovaskularni događaj, infarkt miokarda, vaskularna bolest koja zahteva invazivnu intervenciju; **kako je primetio tim za nabavku; Odgovarajući rezultati autoradiografije i histologije predstavljeni su u Dodatku S2; nema donora sa dijabetes melitusom.

Rezultati

Uzorak kohorte.

Trinaestbubreguzorci su dobijeni nakon transplantektomije, u proseku od 33 [IQR 9–66] meseca nakon transplantacije, od primaoca transplantacije sa srednjom starošću od 51 [IQR 30–64] godina. Transplantektomija je urađena za odbacivanje alografta (Banf IIA i IIB) kod sedam pacijenata, hroničnu arteriopatiju alografta kod dva pacijenta, infekciju alograftom kod dva pacijenta, primarnu nefunkcionalnost kod jednog pacijenta i intersticijsku fbrozu i tubulnu atrofiju III stepena kod jednog pacijenta. Osam od 13 (61,5 posto) pacijenata je imalo hiperparatireozu, sedam (53,8 posto) hiperfosfatemiju, pet (38,5 posto) dijabetes melitus i nijedan od ovih pacijenata nije imao znakovenefrokalcinozana kliničkom ultrazvuku ili anamnezi kamena u bubregu (Tabela 1). Dobijeno je sedam uzoraka bubrega umrlih donora, od donora srednje starosti od 65 [IQR 64–71] godina. Četiri od sedam (57,1 posto) davalaca je imalo anamnezu kardiovaskularnih bolesti, nijedan nije imao dijabetes melitus, a šest od sedam (85,7 posto) je imalo aterosklerozu vaskularnih organa bubrega vizualnom inspekcijom, što su potencijalni faktori za smanjenje broja donora.bubrezi(Tabela 2).

Slika 1. Autoradiografska slika unosa [18F]-natrijum fluorida ([18F]-NaF) (A), sa preklopnom slikom unosa [18F]-NaF sa Alizarinskim crvenim bojenjem mikrokalcifikacija (B) i von Kossa bojenjem kalcifikacija (C).

Autoradiografija i histologija.

With autoradiography, [ 18F]-NaF uptake was identified in 19 out of 20 samples, with a median tracer surface area of 0.81% [IQR 0.27–5.19%]. A tracer surface area of≤5% was seen in 15 (75%) and of>5 posto u 5 (25 posto) od 20 uzoraka (sl. 1 i slika 2A) (dopunski S1 i dopunski S2, koji prikazuje autoradiografiju i slike preklapanja za sve uzorke). Broj [18F]-NaF područja bio je značajno veći ububreguzorci alografta u poređenju sa umrlim donorombubreguzoraka, sa medijanom od 7.0 [IQR 4.0–15,5] i 2.0 [IQR 1.0–6.0 ], odnosno (p=0.019) (Dopunski S3).

Tubulointersticijske mikrokalcifikacije, vizualizirane bojenjem Alizarinom crvenom, bile su prisutne u 19 od 20 uzoraka, sa medijanom od 5,5 [IQR 2–10}.3] po uzorku, a glomerularne mikrokalcifikacije su uočene u sedam od 20 uzorka, sa medijanom od 1 [IQR 1–3] po uzorku (slika 2B). Značajno veći broj mikrokalcifikacija uočen je u uzorcima alografta bubrega u poređenju sa uzorcima bubrega umrlih donora, sa medijanom od 9.0 [IQR 5.0–20.5] i 4.0 [IQR 1.0–4.0], respektivno (p=0.046) (Dopunski S3). Sa Von Kossa bojenjem, tubulointersticijske kalcifikacije su uočene u 18 od 20 uzoraka, sa medijanom od 2,5 [IQR 1–5] po uzorku, a glomerularne kalcifikacije su uočene u sedam od 20 uzoraka, sa medijanom od 1 [IQR 0–3 ] po uzorku (slika 2C). Broj kalcifikacija nije se značajno razlikovao izmeđububreguzorci alografta i uzorci bubrega umrlog donora, sa medijanom od 4.0 [IQR 2.0–6.0] i 2.0 [IQR 2.{101} {9}}–7.0], respektivno (p=0.311) (Dopunski S3). Reproducibilnost među posmatračima identificirana je između vizuelnog i poluautomatskog otkrivanja kalcifikacija, s ICC od 0,94 (95 posto CI 0,85–0,98) za bojanje Alizarinom crvenom i od 0.77 (95 posto CI 0.42–0.91) za Fon Kossa bojenje.

Prekrivene slike autoradiografije i histološki rezultati pokazali su ko-lokalizaciju unosa [18F]-NaF sa bojanjem Alizarin crvenom za mikrokalcifikacije (slika 1B). Poređenja radi, preklapajuće slike unosa [18F]-NaF i Von Kossa bojenje kalcifikacija pokazali su unos u područjima bez histološki dokazanih kalcifikacija (slika 1C). Lažno negativan unos [18F]-NaF, kao postotak histološki dokazanih (mikro)kalcifikacija područja izvan preklapanja, bio je medijan 0 posto [IQR 0–25 posto ] za Alizarin crvena područja i medijan 100 posto [65–100 posto ] za Von Kossa područja. Bojenje mikrokalcifikacija alizarinom crvenom je pokazalo dobru korelaciju sa unosom [18F]-NaF (Spearmanov rho od 0,81 (95 posto CI 0,57–0,92), p< 0.001),="" whereas="" von="" kossa="" staining="" demonstrated="" weak="" correlation="" with="" [="" 18f]-naf="" uptake="" (0.62="" (95%="" ci="" 0.24–0.84),="" p="0.003)" (fig.="" 3).="" significant="" differences="" in="" the="" number="" of="" (micro)="" calcifications,="" by="" alizarin="" red="" (median="" 4.0="" [iqr="" 3.0–8.0]="" versus="" 34.0="" [iqr="" 19.0–41.0],=""><0.001) and="" von="" kossa="" (median="" 2.0="" [iqr="" 2.0–4.0]="" versus="" 6.0="" [5.5–9.5],="" p="0.004)" staining,="" were="" observed="" between="" samples="" with="" ≤5%="" and="">5 posto unosa [18F]-NaF (slika 4).

Slika 2. Slika preklapanja [18F]-natrijum fluorida ([18F]-NaF) i mikrokalcifikacija (Alizarin crveno) (A), sa bojanjem Alizarinom crvenom za mikrokalcifikacije (B) i bojenjem von Kossa za kalcifikacije (C).

Karakteristike primaoca u vrijeme transplantektomije.

Nisu uočene razlike izmeđububregalografski uzorci pacijenata sa (n{{0}}) ili bez hiperfosfatemije (n=6), za broj [18F]-NaF područja (medijan 5.0 [IQR 2.0–11.8] naspram 7.0 [7.0–23.0], p=0.170) , Alizarin crvena (medijan 7,5 [IQR 5.0–14.0] naspram 12.0 [3.0–34.0], p{{30}}.390), i Von Kossa (srednja vrijednost 5.0 [IQR 3,5–6,3] naspram 3.0 [2.{101} {59}–5.0], p=0.247). Poređenje uzoraka alografa bubrega pacijenata sa (n=8) ili bez (n=5) hiperparatireoidizmom nije pokazalo razlike za broj [18F]-NaF područja (medijan 7.0 [IQR 4.0–7,5] naspram 7,5 [4.0–23.0], p=0.459), Alizarin crvena (medijan 9.{{ 79}} [IQR 6.0–11.0] naspram 1{{103}}.0 [3.5–32.8], p{{76 }}.769), i Von Kossa (medijan 4.0 [IQR 1,5–5.0] naspram 4,5 [2.0–6,8], p{{9{{ 131}}}}.505). Nisu utvrđene značajne razlike između alografskih uzoraka bubrega pacijenata sa (n=5) ili bez (n=8) dijabetes melitusa, za broj [18F]-NaF područja (medijan 5,5 [IQR 2,5– 19,3] naspram 7,0 [6,5–15,5], p=0.524), alizarin crvena (medijan 10,0 [IQR 5,5–24,8] naspram 9,0 [4,0–8,5], p=0.833) i Von Kossa (medijan 3,0 [IQR 2,0–5,8] naspram 4,0 [3,5–8,5], p=0.284). Za vrijeme između transplantacije i transplantektomije (mjeseci) nisu uočene značajne korelacije sa brojem [18F]-NaF područja (p=0.586), Alizarin crvenog (p=0.667) i Von Kosa (p=0.459). Za dob u vrijeme transplantacije nisu uočene značajne korelacije sa brojem [18F]-NaF područja (p=0.902), Alizarin crvenog (p=0.798) i Von Kossa (p =0.334). Slično, nisu uočene značajne korelacije između trajanja dijalize (mjeseci) nakonbubregNeuspjeh alografa i broj [18F]-NaF područja (p=0.481), Alizarin crvena (p=0.565) i Von Kossa (p=0.174).

Slika 3. Korelacija broja [18F]-natrijum fluorida ([18F]-NaF) područja sa mikrokalcifikacijama obojenim Alizarinom crvenom (A) i von Kossa obojenim kalcifikacijama (B).

Figure 4. Differences between two groups,≤5% and>5 posto [18F]-natrijum fluorida ([18F]-NaF) površine traga, za broj mikrokalcifikacija obojenih Alizarinom crvenom (A) i von Kossa, obojenih kalcifikacija (B) (medijan, interkvartilni raspon).

Diskusija

U ovoj dokaznoj studiji koncepta, ex-vivo unos [18F]-NaF kod ljudibubreguzorci parenhima pokazali su dobru korelaciju sa histološki dokazanim mikrokalcifikacijama. Unos [18F]-NaF jače je korelirao sa bojenjem Alizarinom crvenom za aktivne mikrokalcifikacije u poređenju sa Von Kossa bojenjem konsolidovanih kalcifikacija, što ukazuje na ulogu snimanja [18F]-NaF u identifikaciji ranih stadijuma područja nefrokalcinoze.

Prikazani uzorci predstavljaju mješavinu slučajeva bubrega donora i eksplantiranih alotransplantata bubrega. Ova dva tipa uzorka razlikovala su se u pogledu vezivanja tragača, pri čemu je uočeno više unosa [18F]-NaF u eksplantiranim uzorcima alografta bubrega. Ovo je u skladu s prethodnim publikacijama, koje izvještavaju o povećanju mikrokalcifikacija nakon transplantacije bubrega5–7. Udruženjenefrokalcinozasa inferiornom funkcijom grafta u vrijeme biopsije i godinu dana nakon transplantacije prijavljeno je u dvije studije biopsije alografta bubrega, sa 258 i 149bubregprimaoci transplantacije 8,9. Štaviše, u longitudinalnoj kohorti sa 97 primalaca transplantiranog bubrega, značajno lošije preživljavanje grafta 1- i 12- godine pokazuje se kod pacijenata sa taloženjem kalcijum-oksalata (tj. preživljavanje grafa od 98,6 posto naspram 72,5 posto i 79,3 posto naspram 49,7 posto, respektivno). U multivarijantnoj logističkoj regresionoj analizi, prisustvo taloženja kalcijum-oksalata nezavisno je povezano sa gubitkom grafa, u modelu koji je između ostalog uključivao kreatinin u vreme biopsije i tip donora4. Specifična uloga mikrokalcifikacija u ovoj kaskadibubregpad funkcije alografta ostaje nejasan. U kliničkom okruženju prije transplantacije, taloženje CaOx se pripisuje visokim nivoima serumskog oksalata, molekula koji nije efikasno uklonjen tokom dijalize4. Dok se naslage CaPhosa najčešće viđaju kod pacijenata sa hiperparatireoidizmom i visokim nivoom serumskog kalcija, zbog poremećenog mineralnog metabolizma prije i nakon transplantacije5. Nismo pronašli razlike u rezultatima histologije i autoradiografije za hiperfosfatemiju, hiperparatireozu, dijabetes melitus, vrijeme između transplantacije i transplantektomije i trajanje dijalize nakon otkazivanja alografta bubrega.

Za razvoj novih strategija liječenja aktivnih mikrokalcifikacija unefrokalcinoza, njegov klinički značaj u odnosu na (hronični) neuspjeh transplantacije treba razumjeti sveobuhvatnije. Uz identifikaciju ciljne populacije visokog rizikabubregprimaocima transplantacije, kliničke studije mogu biti osmišljene da istraže strategije liječenja21. Mogući fokus se može naći u povećanju regulacije endogenih inhibitora kalcifikacije, sa posebnim naglaskom na osteopontin3.

S obzirom na visoku učestalostnefrokalcinozai njegove povezanosti s funkcijom alografta bubrega, potrebno je bolje razumijevanje etiologije mikrokalcifikacija. Neinvazivan i pouzdan dijagnostički pristup za identifikaciju i kvantifikaciju mikrokalcifikacija u ranoj nefrokalcinozi mogao bi omogućiti studije o utjecaju nefrokalcinoze na funkciju transplantacije bubrega. Snimanje [18F]-NaF je od interesa, budući da je unos [18F]-NaF u vaskularne uzorke ljudi i životinja povećan u biološki aktivnim područjima kalcifikacije prije nego što se ova područja mogu vizualizirati mikro-kompjuterskom tomografijom16,17,22. U nedavnim kliničkim PET/CT studijama, pokazalo se da je unos [18F]-NaF povezan sa progresijom vaskularne kalcifikacije, pružajući kliničke dokaze za upotrebu [18F]-NaF za otkrivanje područja sa biološki aktivnom kalcifikacijama18-20. Opažanja u ovoj studiji su u skladu sa ovim prethodnim nalazima u oblasti vaskularnog snimanja. Pokazana je dobra korelacija između unosa [18F]-NaF i histološki dokazanih mikrokalcifikacija, dok je korelacija sa konsolidovanim kalcifikacijama bila očito slabija.

Kao što je navedeno, identifikovana je ko-lokalizacija između unosa [18F]-NaF i pozitivnih mikrokalcifikacija Alizarin crvenom, dok područja apsorpcije [18F]-NaF nisu bila ko-lokalizirana sa Von Kossa bojenjem konsolidiranih kalcifikacija. Ova kalcifikovana područja, sa konsolidovanim kalcifikacijama i bez odgovarajućeg unosa [18F]-NaF, mogu se smatrati područjima neaktivne kalcifikacije, gdje nema tekućeg procesa mineralizacije, kao što su ranije opisali Irkle et al. u ex vivo studiji kalcifikacije karotida16. Iako je potvrđen samo za vaskularne kalcifikacije, a ne zabubregkalcifikacije parenhima, podržavaju ga svojstva vezivanja [18F]-NaF za vanjsku površinu kalcifikacija i ograničena penetracija u čvrste kalcifikacije. Stoga će unos [18F]-NaF biti veći u mikrokalcifikacijama, sa velikom površinom, u poređenju sa mikrokalcifikacijama, sa velikim volumenom, ali relativno malom površinom13,16.

Ovaj dokaz studije koncepta također ima neka ograničenja. Prvo, inherentno dizajnu studije, rezultati predstavljaju jednu vremensku tačku, bez kliničkog praćenja progresije kalcifikacije. Drugo, ova studija dokaza koncepta sastoji se od relativno malog broja uzoraka bubrega, jer se transplantektomija nakon neuspjeha kasne transplantacije izvodi samo na osnovu kliničkih indikacija i dostupnosti odbijenog donora.bubreziza istraživanje je upotreba ograničena23. Stoga, sveobuhvatnu analizu etiologije taloženja kalcijuma treba razmotriti izvan okvira ovog projekta. Treće, kliničko prevođenje rezultata je otežano nedostatkom znanja o in-vivo [18F]-NaF distribuciji u bubrezima i efektom klirensa bubrežnih tragova, tj. niska aktivnost od cilja do pozadine mogla bi ograničiti vizualizaciju kalcifikacija. Da bi se riješio ovaj problem, treba procijeniti optimalni trenutak [18F]-NaF PET snimanja, tj. u kojem se [18F]-NaF zaista izlučuje, a preostala aktivnost dolazi od vezivanja za kalcificirana područja. Moguće je da se to može postići odloženim snimanjem većim od tri sata, kao što se radi za procjenu koronarnih kalcifikacija24. Smanjena brzina glomerularne filtracije pronađena kod primatelja transplantata mogla bi rezultirati produženom fazom izlučivanja, zahtijevajući duži period između injekcije tragača i PET snimanja, ali trenutne smjernice ne ukazuju na potencijalnu nefrotoksičnost [18F]-NaF tragača11,25. Potencijalni korak između ovdje predstavljenog dokaza konceptualne studije i in vivo snimanja može biti ex-vivo [18F]-NaF PET snimanje normotermno perfuziranih bubrega ili in-vivo [18F]-NaF mikroPET studije na životinjama26,27. Četvrto, klinička primjena ove tehnike mogla bi biti otežana troškovima izvođenja [18F]-NaF PET/CT procedure i inherentnom izloženošću zračenju. Međutim, novi sistemi digitalnih PET kamera s višom osjetljivošću mogu smanjiti i jedno i drugo, zbog kraćeg vremena skeniranja i niže doze ubrizgane aktivnosti.

Snaga ove studije dokaza o konceptu leži u detaljnom pojedinačnom poređenju mikrokalcifikacija identifikovanih [18F]-NaF autoradiografijom i histologijom. Potrošnja Te [18F]-NaF u različitim uzorcima se mogla porediti bez potrebe za daljim prilagođavanjem, pošto su svi uzorci inkubirani u istom rastvoru [18F]-NaF. Štaviše, ova studija pruža prve podatke koji pokazuju vizuelnu i statističku podudarnost između unosa [18F]-NaF i histološki dokazanih mikrokalcifikacija u uzorcima bubrega.

Cistanche-funkcija bubrega

Da zaključimo, dajemo prve podatke za upotrebu [18F]-NaF u autoradiografskoj studiji za identifikaciju mikrokalcifikacija u aktivnimnefrokalcinozaposlijebubregtransplantacija. Ova ex-vivo [18F]-NaF studija dokaza o konceptu je prvi korak ka potencijalnoj primjeni kliničkog [18F]-NaF PET/CT kod primalaca transplantiranih bubrega.

Metode

Čovjekbubreguzorci.

Bubrežno tkivo je dobijeno nakon transplantektomije (n=13) i iz odbačenih bubrega od preminulih donora (n=7) u slučaju propadanja bubrega donora od strane povezanih transplantacijskih centara. Klinički podaci o primateljima i donatorima transplantiranih bubrega uzeti su iz medicinske dokumentacije pacijenata, uključujući prisustvo hiperparatireoze, hiperfosfatemije i dijabetes melitusa prije transplantektomije, te kliničku procjenu patologije uzoraka bubrežnih alografta prijavljenih korištenjem Banfove klasifikacije patologije bubrežnog alografta28. Istraživačke aktivnosti su obavljene u skladu sa deklaracijom Helsinških etičkih principa za medicinska istraživanja koja uključuju ljudske subjekte, a Institucionalni odbor za reviziju dao je odobrenje za ovu studiju (Medical Ethical Committee University Medical Center Groningen 2015/501). Dobijen je informirani pristanak od svih transplantiranih primatelja i dato je odobrenje prije doniranja za korištenje odbačenih bubrega od preminulih donora u istraživačke svrhe. Kliničke i istraživačke aktivnosti bile su u skladu sa principima Istanbulske deklaracije kako je navedeno u „Istanbulskoj deklaraciji o trgovini organima i transplantacijskom turizmu.

Standardna operativna procedura (SOP) za uzimanje uzoraka tkiva bila je sljedeća: Uzorci su uzeti u hirurškoj sali, odmah nakon ekstrakcije bubrega (za transplantektomiju), ili po dolasku odbačenog donorabubregu našem transplantacijskom centru. Uzorci korišteni za ovaj eksperiment uzeti su u poprečnoj ravni gornjeg pola, uključujući kortikalno i medularno tkivo bubrega, veličine između 25 mm × 15 mm i 20 mm × 40 mm. Ovi uzorci su fiksirani formalinom i parafin. Korištenjem mikrotomskog preciznog instrumenta za rezanje napravljeni su preseci od tri µm u parafin. Ove sekcije su montirane na adheziono staklo mikroskopa (TOMO, Matsunami Glass, SAD). Serijski dijelovi, odnosno susjedni dijelovi koji otkrivaju sekvencijalne slojevebubreguzorci tkiva, korišteni su za autoradiografiju i histološku analizu. Prije inkubacije tragača i histološkog bojenja, sekcije su deparafnizirane, rehidrirane u demineraliziranoj vodi i privremeno pohranjene u fiziološkom rastvoru puferiranom fosfatom (PBS).

[18F]-NaF inkubacija i autoradiografija.

Eks-vivo eksperiment je baziran na protokolu koji su koristili u prethodnim studijama Hop et al. i Reijrink et al.22,29. Prva studija je autoradiografska studija o unosu [18F]-NaF u karotidne plakove kod pacijenata sa moždanim udarom koji su podvrgnuti operaciji, sa indikacijom kalcifikacije zasnovanom na CT-u kao poređenjem. Druga studija je autoradiografska studija o unosu [18F]-FDG u uzorke masnog tkiva, sa imunohistohemijom serijskih rezova kao poređenjem. Jedna od tri serijske sekcije je kupana u rastvoru [18F]-NaF, u koncentraciji od 618 milibekerela (MBq) u 300 mL PBS, na sobnoj temperaturi, tokom 30 minuta. Pranje je obavljeno tri puta ispiranjem hladnom PBS i dva puta hladnom vodom. Uzorci su sušeni na otvorenom, a preko njih je postavljeno slijepo fosforno sito. Ekspozicija je vršena preko noći, u trajanju od 24 h i 30 min. Određivanje distribucije i intenziteta aktivnosti tkiva izvršeno je na fosfornom ekranu pomoću Amersham Typhoon Biomolecular Imager (GE Healthcare, Marlborough, SAD).

Bojenje Alizarinom crvenom i von Kossa.

Bojenje alizarinom crvenom bojom izvedeno je kako bi se vizualizirala akumulacija kalcija u ranoj fazi kalcifikacije. Uzorci su inkubirani u 2% w/v rastvoru Alizarin crvenog (otopljenog u demineralizovanoj vodi), pH 4,2 tokom 5 minuta30. Pranje je obavljeno 20 puta ispiranjem u 1:1 aceton/ksilenu i 20 puta ispiranjem u 100 posto ksilenu. Von Kossa bojenje je izvedeno kako bi se vizualiziralo prisustvo neorganskih molekula fosfata u konsolidovanim kalcifikacijama. Ukratko, uzorci su inkubirani u 1 procentnom rastvoru srebrnog nitrata (AgNO3) tokom 1 h, dok su bili izloženi sunčevoj svetlosti30. Naizmjenično s tri puta ispiranja u demineraliziranoj vodi, inkubacija je izvedena s natrijum tiosulfatom u trajanju od 5 minuta, nakon čega je uslijedila inkubacija u nuklearnom brzom crvenom tijekom 3 minute.

Obrada i analiza slike.

Presjeci obojenog tkiva digitalizirani su Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan), a slike su pregledane korištenjem softvera Aperio ImageScope verzije 12.1.0.5029 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Njemačka). Autoradiografija i kvantitativne kompjuterizovane analize slike obavljene su sa softverom ImageJ, verzija 1.51 (NIH, Bethesda, Maryland, http://fji.sc).

Oduzimanje pozadine je primijenjeno za sve histološke slike, umetanjem obrisa na ivicu histološkog uzorka. Poluautomatsko otkrivanje kalcifikacija u Alizarin crvenom i Von Kossa bojenju izvedeno je sa ImageJ—BioVoxxel Toolbox31. Pragovi su primijenjeni za sve uzorke i otkrivena područja kalcifikacije su proširena sa 6 iteracija, kako bi se optimizirala vizualizacija. Za autoradiografske slike, rotacija i promjena veličine su izvedeni na osnovu originalnih histoloških uzoraka. Pragovi su primijenjeni za sve uzorke, što je rezultiralo područjima upijanja traga, slijedeći pristup koji su opisali Irkle et al.: slike su postavljene na prag korištenjem Otsu metode, nakon čega je uslijedilo Gausovo zamućenje i postavljanje praga Li metodom16. Prekrivne slike su dobijene poklapanjem obrisa sa susjednih histoloških slika, uz naknadno uparivanje rezultata histologije i autoradiografije (slika 1). Kvantifikacija kalcifikacije i površine traga (kao procenat površine uzorka) zasnovana na pikselima izvedena je pomoću alata ImageJ—Analyze Particles.

Cistanche - simptomi bolesti bubrega

Statističke analize.

Statistika je rađena pomoću Statističkog paketa za društvene nauke verzije 23 (IBM Corporation, Armonk NY, SAD), grafikoni su napravljeni sa GraphPad Prism 7.02 za Windows (Graph Pad Sofware, San Diego, SAD), a brojke su napravljene pomoću Adobe Illustrator CS6 (Adobe Systems, San Jose, SAD). Rezultati su predstavljeni kao medijan i interkvartilni raspon (IQR) za iskrivljene podatke, te kao učestalost i postotak kada su podaci bili kategorični. Uporedili smo grupe koristeći Mann-Whitney U test (dvostrana pvalue<0.05=signifcant) and="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" spearman="" rank="" test="" (two-tailed="" p-value="" and="" spearman's="" rho).="" true="" and="" false-positive="" rates="" were="" based="" on="" the="" pixel-based="" quantification="" of="" tracer="" and="" histology="" findings.="" to="" assess="" the="" interobserver="" reproducibility="" for="" semi-automated="" detection="" of="" calcifications,="" the="" intraclass="" correlation="" coefficient="" (icc)="" with="" 95%="" confidence="" intervals="" (ci)="" were="">

Dostupnost podataka

Pokojni donor bubreg ibubregAutoriografske slike primaoca transplantacije unosa [18F]-natrijum fluorida ([18F]-NaF), sa preklopnim slikama unosa [18F]-NaF sa Alizarin crvenom bojenjem mikrokalcifikacija i Von Kossa bojenjem kalcifikacija, dostupne su na mreži kao dodatne informacije. Svi dodatni podaci biće dostupni na zahtjev, u skladu sa IRB propisima Univerzitetskog medicinskog centra Groningen.

Reference

1. Gwinner, W. et al. Rana kalcifikacija bubrežnih alografta otkrivena protokolarnim biopsijama: uzroci i kliničke implikacije. Am. J. Transplant. 5, 1934–1941 (2005).

2. Shavit, L., Jaeger, P. & Unwin, RJ What isnefrokalcinoza?. Kidney Int. 88, 35–43 (2015).

3. Paloian, NJ, Leaf, EM & Giachelli, CM Osteopontin štiti od visokog sadržaja fosfatanefrokalcinozai vaskularna kalcifikacija. Kidney Int. 89, 1027–1036 (2016).

4. Pinheiro, HS, Camara, NOS, Osaki, KS, De Moura, LAR & Pacheco-Silva, A. Rano prisustvo taloženja kalcijum oksalata ububreggraf biopsija je povezana sa lošim dugoročnim preživljavanjem grafta. Am. J. Transplant. 5, 323–329 (2005).

5. Evenepoel, P. et al. Lokalizacija, etiologija i uticaj naslaga kalcijum fosfata u bubrežnim alograftima. Am. J. Transplant. 9, 2470–2478 (2009).

6. Nankivell, BJ et al. Prirodna istorija hronične nefropatije alografta. N. Engl. J. Med. 349, 2326–2333 (2003).

7. Schwarz, A. et al. Faktori rizika za kroničnu nefropatiju alografta nakon transplantacije bubrega: studija biopsije protokola. Kidney Int.67, 341–348 (2005).

8. Bagnasco, SM et al. Naslage oksalata u biopsijama nativnih i transplantiranih bubrega i utjecaj na funkciju grafta. Nefrol. Dial. Transplant. 24, 1319–1325 (2009).

9. Snijders, MLH, Hesselink, DA, Clahsen-Van Groningen, MC & Roodnat, JI Depozicija oksalata u biopsijama bubrežnog alografta unutar 3 mjeseca nakon transplantacije povezana je s disfunkcijom alografta. PLOS ONE 14, e0214940 (2019).

10. Benjamins, S., Glaudemans, AWJM, Berger, SP, Start, RHJA & Pol, RA Jesmo li zaboravili snimanje prije i nakon transplantacije bubrega?. EUR. Radiol. 28, 3263–3267 (2018).

11. Beheshti, M. et al. 18F-NaF PET/CT: Smjernice za EANM procedure za snimanje kostiju. EUR. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 42, 1767–1777 (2015).

12. Dweck, MR et al. Koronarna arterijska apsorpcija 18F-natrijum fluorida. J. Am. Coll. Cardiol. 59, 1539–1548 (2012).

13. Dweck, MR et al. Unos 18F-natrijum fluorida je marker aktivne kalcifikacije i progresije bolesti kod pacijenata sa aortalnom stenozom. Circ. Cardiovasc. Imaging 7, 371–378 (2014).

14. Derlin, T. et al. Izvodljivost 18F-natrijum fluorida PET/CT za snimanje aterosklerotskog plaka. J. Nucl. Med. 51, 862–865 (2010).

15. Bucerius, J., Dijkgraaf, I., Mottaghy, FM & Schurgers, LJ Identifikacija cilja za dijagnozu i intervenciju ranjivih aterosklerotskih plakova izvan 18F-fluorodeoksiglukoze pozitronske emisione tomografije: obećavajući tragovi na horizontu. EUR. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 46, 251–265 (2019).

16. Irkle, A. et al. Identifikacija aktivne vaskularne mikrokalcifikacije pozitronskom emisionom tomografijom 18F-natrijum fluorida. Nat. Commun.6, 7495 (2015).

17. Creager, MD et al. 18 Pojačavanje signala F-fluorida identifikuje mikrokalcifikacije povezane sa nestabilnošću aterosklerotskog plaka na snimcima pozitronske emisione tomografije/kompjuterske tomografije. Circ. Cardiovasc. Imaging 12, e007835 (2019).18. den Harder, AM et al. Vaskularni unos na pozitron emisionoj tomografiji 18F-natrijum fluorida: prekursor vaskularne kalcifikacije? J. Nucl. Cardiol. (2020).

19. Derlin, T. et al. Korelacija upale procijenjene pomoću 18F-FDG PET, aktivnog mineralnog taloženja procijenjenog pomoću 18F-fluorida PET, i vaskularne kalcifikacije u aterosklerotskom plaku: PET/CT studija sa dvostrukim tragom. J. Nucl. Med. 52, 1020–1027 (2011).

20. Kitagawa, T. et al. Prediktivna vrijednost pozitronske emisione tomografije 18F-natrijum fluorida u otkrivanju visokorizične koronarne arterijske bolesti u kombinaciji sa kompjuterizovanom tomografijom. J. Am. Heart Assoc. 7, e010224 (2018).

21. Bäck, M. et al. Endogeni inhibitori kalcifikacije u prevenciji vaskularne kalcifikacije: konsenzusna izjava COST akcije EuroSofCalcNet. Front. Cardiovasc. Med. 5, (2019).

22. Hop, H. et al. 18F-natrijum fluorid pozitronska emisiona tomografija procijenila je mikrokalcifikacije u karotidnim plakovima krivaca i onih koji nisu krivci. J. Nucl. Cardiol. 26, 1064–1075 (2019).

23. Johnston, O., Rose, C., Landsberg, D., Gourlay, WA & Gill, JS Nefrektomija nakon neuspjeha transplantacije: trenutna praksa i rezultati. Am. J. Transplant. 7, 1961–1967 (2007).

24. Kwiecinski, J. et al. Tri sata odloženo snimanje poboljšava procjenu koronarnog 18F-natrijum fluorida PET. J. Nucl. Med. 60, 530–535 (2019).

25. Bucerius, J. et al. Stav Kardiovaskularnog komiteta Evropskog udruženja za nuklearnu medicinu (EANM) o PET snimanju ateroskleroze. EUR. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 43, 780–792 (2016).

26. Buchs, J.-B. et al. DCD svinjski bubrezi analizirani MR da bi se procijenila njihova održivost ex vivo. Transplantacija 97, 148–153 (2014).

27. Pool, M. et al. Infuzija mezenhimskih stromalnih stanica u svinjebubrezitokom normotermne mašinske perfuzije: intaktni MSC se mogu pratiti i lokalizirati na glomerule. Int. J. Mol. Sci. 20, 3607 (2019).

28. Roufosse, C. et al. Referentni vodič za Banfovu klasifikaciju patologije bubrežnog alografta iz 2018. Transplantacija 102, 1795–1814 (2018).

29. Reijrink, M. et al. [18F]Usvajanje FDG u masno tkivo nije povezano s upalom kod dijabetes melitusa tipa 2. Mol. Imaging Biol.23, 117–126 (2020).

30. Shao, J.-S. et al. Vaskularna kalcifikacija i aortna fbroza bifunkcionalna uloga osteopontina u dijabetičkoj arteriosklerozi. Arter. TrombVascBiol 31, 1821–1833 (2011).

31. Brocher, J. Kvalitativna i kvantitativna evaluacija dva nova histogramska ograničavajuća binarizacijski algoritama. Int. J. Proces slike. 8, 30–48 (2014).

Priznanja

Ovaj istraživački projekat je podržan grantom De Cock-Hadders fondacije (šifra projekta 2018-03).

Doprinosi autora

SB je dao doprinos dizajnu, nabavci i analizi i izradio rukopis. IFA, MR i MLCB dali su doprinos dizajnu, nabavci i analizi i suštinski revidirali rukopis. SPB, CM i MHdB su doprinijeli koncepciji i suštinski revidirali rukopis. JLH, RHJAS i RAP su doprinijeli koncepciji, dizajnu i analizi i suštinski revidirali rukopis.

Konkurentni interesi

Autori izjavljuju da nema suprotstavljenih interesa.