SLC37A2, molekul vezan za fosfor povećava u glatkim mišićnim ćelijama u kalcificiranoj aormi

Vaskularna kalcifikacijaje glavni izvorkardiovaskularne bolestikod pacijenata sa hroničnom bolešću bubrega.Hiperfosfatemijadovodi do povećanog intracelularnog priliva fosfora, što dovodi do povećanja ćelija sličnih osteoblastima u glatkim mišićnim ćelijama krvnih sudova. PiT-1 tranzitira fosfat u vaskularnim glatkim mišićnim ćelijama. Međutim, mehanizam vaskularne kalcifikacije nije u potpunosti shvaćen. Ova studija je istraživala kandidate za molekule povezane s fosforom, osim PiT-1. Pretpostavili smo da molekuli povezani s fosforom pripadajunosač rastvora(SLC) superfamilija bi bila uključena u vaskularnu kalcifikacija. Kao rezultat analize DNK mikromreža, fokusirali smo se na SLC37A2 i pokazali da se ekspresija mRNA ovih ćelija povećava na kalcificiranim ćelijama glatkih mišića aorte (AoSMC). Prijavljeno je da SLC37A2 prenosi i zamjene glukoza-6-fosfata/fosfata i fosfata/fosfata. In vitro analiza je pokazala da na ekspresiju SLC37A2 nije uticala upala na AoSMC. Ekspresija mRNA SLC37A2 i proteina povećana je u kalcificiranom AoSMC. In vivo, analiza je pokazala ekspresiju mRNA SLC37A2 u aortihronična bolest bubregapacova je u korelaciji sa genima osteogenih markera. Nadalje, SLC37A2 je eksprimiran u području vaskularne kalcifikacije upacova s ​​hroničnom bubrežnom bolešću. Kao rezultat toga, pokazali smo da je SLC37A2 jedan od molekula koji se povećavaju savaskularna kalcifikacijain vitro i in vivo.

Ključne riječi: SLC37A2,vaskularna kalcifikacija, ćelije glatkih mišića aorte,hronična bolest bubrega, hiperfosfatemija

KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 25% EHINAKOZIDA I 9% AKTEOZIDA ZA FUNKCIJU BUBREGA

Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Kupite za više detalja o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Kako je broj pacijenata sahronična bolest bubrega(CKD) raste, broj pacijenatazahtijevaju dijalizuće se takođe povećati. Većina smrtnih slučajeva kod pacijenata koji su podvrgnutidijalizasu zbogkardiovaskularne bolestikao što susrčana insuficijencija, cerebrovaskularni poremećajiili infarkt miokarda. (,2) Glavni izvorkardiovaskularne bolestije ektopična kalcifikacija,() abnormalnost uzrokovana stvaranjem i taloženjem kristala kalcijum fosfata u mekim tkivima. (4 6) Razni faktori kao što je upala. oksidativni stres i povećanje nivoa kalcijuma (Ca) i fosfora (P) u plazmi su uključeni u napredovanje vaskularne kalcifikacije. Među ovim faktorima, hiperfosfatemija je najjače povezana sa vaskularnom kalcifikacijama. (7.8) Hiperfosfatemija je uzrokovana prekomjernim unosom P u prisustvu smanjene bubrežne funkcije. Stoga pacijenti koji su na dijalizi moraju ograničiti unos P. (79-12) Međutim, prijavljeno je davaskularna kalcifikacijaveć napreduje kada se dijaliza započne; također je viđena kod pacijenata sa ranom stadijumom CKD kada hiperfosfatemija nije evidentna. (3) Shodno tome, važno je spriječiti vaskularnu kalcifikacija kod pacijenata sa ranom stadijumom CKD kako bi se poboljšala životna prognoza.

što dovodi do povećanog priliva P u vaskularne glatke mišićne ćelije (VSMC). P influks se vrši preko PiT-1, transportera na površini ćelijske membrane VSMC. PiT- je član superfamilije nosača otopljenih supstanci (SLC), koja uključuje transporter natrijum fosfata kodiran SLC20A1.04 PiT- prenosi fosfat kroz ćelijske membrane zavisne od Na i posljedično mineralizaciju matriksa zbog povišenih nivoa p.s) Kao intracelularno. Nivoi P se povećavaju, VSMC počinje da eksprimira osteogene faktore transkripcije, kao što je transkripcijski faktor 2(Runx2)(16) povezan sa runt-om. Ovaj efekat je praćen povećanom ekspresijom gena specifičnih za osteoblast, kao što su osteopontin i osteokalcin. Osim toga, smanjena je ekspresija proteina specifičnih za glatke mišiće. kao što je protein glatkih mišića 22-0 (SM22-0), javlja se. Kao rezultat toga, VSMC se transformira u stanice slične osteoblastima. (1718) Nedavne kliničke studije su pokazale da je nivo kalcijuma u krvi. proteinske čestice (CPP), koje predstavljaju koloidne čestice kalcijum fosfata, povećavaju se sa smanjenjem bubrežne funkcije. (19-21) Nadalje, prijavljene su korelacije sa nivoima CPP i P u krvi.2o2i) Moguće je da CpP može izazvati progresiju vaskularne kalcifikacije.22-24)

Međutim, vaskularna kalcifikacija je uočena kod pacijenata sa ranom stadijumom CKD sa normalnim nivoom P u plazmi. (13) Osim toga.PiT-1 mRNA se eksprimira sveprisutno u svim tkivima. Tako drugi molekul može djelovati prvenstveno u području vaskularne kalcifikacije. Postoje izvještaji o tomeupalapotiče vaskularnu kalcifikacija. Inflamatorni faktori kao što su interleukin (IL)-1B, IL-6 i faktor nekroze tumora-alfa (TNF-a) inducirali su diferencijaciju VSMC u ćelije slične osteoblastu (2s26) TNF-a inducira vaskularnu kalcifikacija kroz cAMP put, koji igra ulogu u diferencijaciji osteoblasta.2728) IL-6 reguliše različite puteve koji vode do vaskularne kalcifikacije VSMC2-31) Nadalje. IllB, IL-6 i TNF-a su također faktori povezani sa povećanom vaskularnom kalcizacijom izazvanom visokim nivoima p.3233) Međutim. trenutni podaci ne objašnjavaju u potpunosti mehanizam vaskularnog

kalcifikacija izazvana ovim faktorima. Pretpostavili smo da bi mogli postojati i drugi molekuli povezani s P, kao što su oni u superfamiliji SLC, koji su uključeni u vaskularnu kalcifikacija. Fokusirali smo se na membranske proteine ​​u superfamiliji SLC i istražili potencijalne kandidate za P-srodne molekule osim PiT-1 za uključivanje u vaskularnu kalcifikacija. Nadalje, ispitali smo odnos između molekula kandidata i vaskularne kalcifikacije na video i in vivo.

Materijali i metode

Ćelijska kultura. Normalne humane ćelije glatkih mišića (AoSMC) su dobijene iz Lonze (Basel, Švicarska) AoSMC je kultiviran prema uputama proizvođača. AoSMC su održavani u mediju za rast (bazni medij glatkih mišićnih ćelija sa dodatkom 5% fetalnog goveđeg seruma (FBS), epidermalnog faktora rasta, insulina, faktora rasta fibroblasta-B i gentamicina/amfotericina-B). Mediji su se mijenjali svaki drugi dan. AoSMC su uzgajani u vlažnom 5% CO inkubatoru na 37 stepeni i održavani dok se ne postigne konfluencija, a zatim korišteni u eksperimentima.

Kalcifikovani AoSMC. Kalcifikacija AoSMC je indukovana kao što je prethodno opisano.435) AOSMC su kultivisane u Dulbecco-ovom modifikovanom Eagleovom medijumu sa dodatkom 15% FBS i penicilin-streptomicinom i kultivisane sa 2,6 mM P tokom 3, 6, 2, 9, 14 dana. Koncentracija P je podešena pomoću P pufera NaH, PO/Na i HPO. pH 7,2). Drugi AoSMC nisu kultivisani sa 2,6 mM P.

DNK mikromreža. Korištena je ukupna RNK uzoraka AoSMC kultiviranih a ne kultiviranih sa 2,6 mM P. Ukupna RNA 5.0 ug je analizirana korištenjem DNK mikromreže (Agilent Technologies, Tokio. Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray je korišten za ispitivanje oko 26,000 gena. Odnos je izračunat dijeljenjem nivoa ekspresije AoSMC kultivisane sa 2,6 mM tokom 12 dana sa nivoom ekspresije AoSMC nekultivisanog sa 2,6 mM P

DNK mikromreža

Korištena je ukupna RNK uzoraka AoSMC kultiviranih a ne kultiviranih sa 2,6 mM P. Ukupna RNA 5.0 ug je analizirana korištenjem DNK mikromreže (Agilent Technologies, Tokio. Japan). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray je korišten za ispitivanje oko 26,000 gena. Odnos je izračunat deljenjem nivoa ekspresije na AoSMC kultivisanom sa 2,6 mM tokom 12 dana sa nivoom ekspresije na AoSMC nekultivisanom sa 2,6 mM P. Ekspresija SLC37A2 u vaskularnoj upali. Da bi se inducirao inflamatorni odgovor u AoSMC, ćelije su kultivisane sa medijumom za rast dok nisu došle do konfluencije, a zatim tretirane sa 1 ugmL lipopolisaharida (LPS) (LPS iz escherichia coli O111:B4; Sigma, St. Louis, MO) tokom 24 i 72 bez 2,6 mM P. Drugi AoSMC nisu kultivisani analizom lančane reakcije polimeraze (PCR) u realnom vremenu. Ukupna RNK je ekstrahirana iz AoSMC tretiranih LPS-om 24 i 72 h i ćelija koje nisu tretirane LPS-om. Kvantitativni PCR u realnom vremenu zasnovan na SYBR zelenom je izveden korišćenjem sintetizovane cDNK i odgovarajućeg seta prajmera za svaki ciljni gen sa aStepOnePlus PCR sistemom u realnom vremenu (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Prajmer sekvence su bile sljedeće: ljudski IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' i 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; ljudski SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' i 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- i 5-CTTCTGGGIGGCAGTGATGGC-3.IL-6 i SLC37A2 mRNA nivoi ekspresije sa G SDH37A2 nivoi ekspresije mRNA su izračunati nakon normalizacije G SDH3cCA2 AoSMC. Ukupni su ekstrahovani iz AoSMC koji nisu kultivisani sa 2,6 mM P i AoSMC ćelija kultivisani sa 2,6 mM P tokom 3, 6, 9, 12 i 14 dana. PCR u realnom vremenu je izveden korišćenjem sintetizovane cDNK. Sekvence prajmera su bile kao slijedi: ljudski Runx2, 5-TGAGAGCCGCTTCTCCAACCC-3', i 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3 Nivoi ekspresije Runx2 i SLC37A2 mRNA su izračunati nakon normalizacije sa APPH.

Western blotting analiza.

Ukupni protein je sakupljen iz AoSMC uzoraka kultiviranih pod istim uvjetima korištenim za PCR analizu u realnom vremenu. Ovi uzorci su lizirani korištenjem Tris puferiranog fiziološkog rastvora (pH 75) sa dodatkom 5% NP-40 i 1% koktela inhibitora proteaze. Uzorci koncentracije proteina mjereni su korištenjem BCA Protein Assay Kit (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). a koncentracija je podešena Western blottingom, 10 ug proteina je odvojeno u 10% poliakrilamidnom gelu korištenjem elektroforeze natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela. Membrana je tretirana antitijelima SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) ili GAPDH antitijelima (GeneTex, Irvine, CA) kao primarnim antitijelima, inkubiranim sa zečjim lgG antitijelom konjugovanim s peroksidazom hrena (R&D Systems, Minneapolis) kao drugim antitijelom, MN i vizualizirano korištenjem Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Engleska) i luminiscentnog analizatora slike (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokyo, Japan). Traka je kvantificirana korištenjem lmagela.

Eksperimentalno

Sve protokole istraživanja odobrio je Etički komitet Univerziteta u Hjogu, Škole za ljudske nauke i životnu sredinu. Mužjaci Sprague-Dawley pacova stari 12 sedmica kupljeni su od Japan SLC (Shizuoka, Japan). Pacovi su održavani na ciklusu 12-svjetlo, 12-h tamno (09:00-21:00) i omogućen im je slobodan pristup hrani i izuzetno čistoj vodi.

Eksperimentalne dijete uključuju kontrolnu P dijetu (1.0% P, 0.6Ca, 20% proteina), adenin dijetu (0.75% adenin , 1.0% P, 0.6%Ca, 2.5% proteina), dijeta sa niskim sadržajem P (LP) (0.2% P,0 .6% Ca, 10% proteina) i dijeta s visokim P (HP) (1.0% P, 0.6% Ca, 10% proteina) zasnovana na AIN93-G dijeti (orijentalni kvasac, Tokio, Japan) sa kazeinom kao izvorom proteina.3637) Prijavljeno je da dijeta sa niskim sadržajem proteina potiče vaskularnu kalcifikacija kod pacova sa zatajenjem bubrega izazvanom adeninom, pa je izvršena restrikcija proteina.3738) Prije grupisanja, svi pacovi (n.=23) su hranjeni standardnom MF dijetom (orijentalni kvasac) nedelju dana da se aklimatizuju. U dobi od 13 sedmica, pacovi su podijeljeni u 2 grupe: kontrolnu grupu (n=5) i adenin-indukovanu CKD grupu (n=18). Kontrolna grupa je primala kontrolnu P dijetu 6 sedmica . Grupa za CKD izazvanu adeninom primala je adenin dijetu oko 3 sedmice, a zatim je dalje podijeljena u 2 podgrupe: CKD-LP grupu (n=8) ili CKDHP grupu (n=10). Pacovi grupe CKD-LP i CKD-HP grupe primali su LP dijetu i HP dijetu 3 sedmice, odnosno tokom eksperimentalnog perioda, unos hrane je bilježen dnevno. Tokom adeninske dijete, uzorci krvi su sakupljani iz repne vene između 10:{46}} ujutro i 11:00 jednom sedmično do druge sedmice, a nakon toga jednom u 2 dana kako bi se pratili nivoi u plazmi. Tokom LP dijete ili HP dijete, uzorci krvi su prikupljani jednom sedmično. Uzimani su uzorci urina i bilježi se volumen urina jednom sedmično. Pacovi su žrtvovani uz anestetiku koristeći izofluran (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Japan) i laparotomije. Za analizu su uzeti uzorci krvi iz donje šuplje vene i torakoabdominalne aorte.

Ekspresija SLC37A2 na aorti.

Otprilike jedna trećina prikupljene torakoabdominalne aorte korištena je za vizualizaciju kalcifikacije i provođenje imunološkog bojenja. Aorta je umetnuta u parafin i 4-um presjeci su izrezani. Sekcije su obojene pomoću Von Kossa metode za kalcijum (Polysciences. Warrington, PA) prema uputstvima proizvođača. analiza imunološkog bojenja je obavljena sa serijskim rezovima. Sekcije su inkubirane sa SLC37A2 antitelom preko noći na 4 stepena, a zatim tretirane sa Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokio, Japan) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, sekcije su tretirane kompletom DABsubstrata (Nichirei).

Ukupna RNK je ekstrahirana iz ostatka smrznute torakoabdominalne aorte. PCR u realnom vremenu je izveden korištenjem sintetizirane cDNK. Prajmerske sekvence su bile sljedeće: osteo-pontin pacova,5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' i 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' i; pacov SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' i 5'-CTGATGGGCTTTCTGGACATG-3. Nivoi ekspresije mRNA osteopontina i SLC37A2 mRNA su izračunati nakon normalizacije sa GAPDH

Statistička analiza.

Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost + SE. Razlike između grupa analizirane su pomoću t-testa. U eksperimentima kalcificiranog AoSMC izazvanog fosfatom, razlike su analizirane korištenjem jednosmjerne analize varijanse praćene Dunnettovom metodom. U eksperimentima na modelu CKD, razlike su analizirane korištenjem K ruskal-Wallis testa praćenog Steel-Dwass metodom. Koeficijenti korelacije (rs) određeni su korištenjem Spearmanovog rang testa koeficijenta korelacije. Za sve testove. dvostrane p vrijednosti<0.05 were considered statistically significant.