Jednoćelijska transkriptomika otkriva poremećene interakcije između ćelija i ćelija filtera bubrega nakon rane i selektivne povrede podocita
Jul 01, 2024
Hronične bolesti bubrega (CKD)još uvijek pogađa 700 miliona ljudi širom svijetaspecific terapijenedostaju.1 Mnogibolesti bubrega nastaju in theglomerula, thefiltraciona jedinica bubrega. Glomerul se sastoji od (i) podocita, specijalizovanih postmitotskih ćelija sa složenim procesima stopala koji se interdigitiraju formirajući prorezane dijafragme i omotavaju oko glomerularnih kapilara; (ii) endotelne ćelije, koje leže nasuprot podocita na zajedničkoj bazalnoj membrani glomerula (GBM); (iii) mezangijalne ćelije, koje formiraju matriks koji pruža strukturnu podršku glomerulu; i (iv) parijetalne epitelne ćelije (PEC), koje oblažu Bowmanovu kapsulu.2 Povreda podocita, posebno, dovodi do mnogih visoko rasprostranjenih, progresivnih bolesti bubrega, uključujući dijabetičku bolest bubrega (DKD), fokalnu segmentnu glomerulosklerozu (FSGS) i nefrotski sindrom (idiopatski i genetski). Kanonski obrazac ozljede rezultira gubitkom interdigitalnih stopala podocita, poznatim kao brisanje procesa stopala, uzrokovano preuređenjem aktinskog citoskeleta. Ovo brisanje dovodi do prekida dijafragme s prorezom, fizičke barijere koja funkcionira kaofilter, nakon čega slijedi odvajanje podocita ili smrt.3,4 S druge strane, pored intaktnih podocita, formiranje i održavanjeglomerularnifiltraciona barijerazahtijevajuintraglomerularna komunikacija, strogo kontrolirana nizom autokrinih i parakrinih signalnih mehanizama. Na primjer, faktor rasta vaskularnog endotela A (VEGFA) je signal za preživljavanje za endotelne ćelije koje luče podociti, a faktor rasta B koji potiče od trombocita (PDGFB) je signal za preživljavanje mezangijalnih ćelija koje luče endotelne ćelije.5 Poremećaj ovih interakcija ćelija-ćelija se često uočava kod niza glomerularnih bolesti, uključujući FSGS i DKD.6 Stoga, identificiranje najranijih poremećajnih promjena na glomerulu može ponuditi nove ciljeve i priliku za optimizaciju terapijskog uspjeha zaliječenje bubrežnih bolesti.
NOVE BILJE ZALIJEČENJE BOLESTI BUBREGA
Uz podršku NIH Nacionalnog instituta za dijabetes i bolesti probave i bubrega, dodjeljuje DK103658, DK099465 i DK095045 (AG).intraglomerularnu komunikaciju, strogo kontroliranu nizom autokrinih i parakrinih signalnih mehanizama. Na primjer, faktor rasta vaskularnog endotela A (VEGFA) je signal za preživljavanje za endotelne ćelije koje luče podociti, a faktor rasta B koji potiče od trombocita (PDGFB) je signal za preživljavanje za mezangijalne ćelije koje luče endotelne ćelije.5 Poremećaj ovih ćelija- ćelijske interakcije se često primjećuju u nizu glomerularnih bolesti, uključujući FSGS i DKD.6 Stoga, identificiranje najranijih poremećajnih promjena na glomerulu može ponuditi nove ciljeve i priliku za optimizaciju terapijskog uspjeha u liječenju bolesti bubrega
Jednoćelijsko RNK sekvenciranje (scRNAseq) revolucioniralo je sposobnost proučavanja pojedinačnih tipova ćelija složenih tkiva i staničnih stanja nakon specifičnih perturbacija.7,8 Nedavne studije scRNAseq u bubrezima pružile su uvid u transkripcijske profile tipova ćelija bubrega kod zdravih miševa i ljudskim uzorcima kao iu nekim bolesnim stanjima, uključujući DKD i lupus nefritis.9e12 Međutim, detaljne studije stanja glomerularnih ćelija ograničene su malim brojem ćelija dostupnih za analizu. Nadalje, najranije promjene specifične za tip stanica koje se javljaju u svim glomerularnim stanicama nakon ozljede podocita nisu praćene i tek treba biti definirane.
Ablacija podocita putem inducibilne delecije esencijalnog endogenog proteina, CTCF-a, specifičnog za podocite, dovodi do progresivne proteinurijske bolesti bubrega i CKD-a.13 Istorijski gledano, CKD mišji modeli su generirani izazivanjem ozljede bubrega egzogenim toksinima ili hirurškim intervencijama koje su podoptimalnom rekapituliranje sekvencijalnih mehaničkih promjena. Brisanje CTCF-a, esencijalne endogene molekule, dovodi do brzog gubitka podocita, teške progresivne albuminurije, promjena u metabolizmu minerala kostiju, zatajenja bubrega i prerane smrti.13 Inducibilni podocit-specifični CTCF model (iCTCFpod / ) pruža jedinstvenu priliku za proučavanje promjene u interakcijama intraglomerularnih stanica i stanica kao posljedica inducirane ozljede podocita. Ekspresija CTCF podocita se ne može detektovati u najranijoj vremenskoj tački, na 1 sedmici indukcije Cre posredovane doksiciklinom kod iCTCFpod / miševa.13 Značajan i progresivan gubitak podocita, mjereno histološkom analizom, počinje 2 sedmice nakon indukcije Cre. U trenutnoj studiji, detaljna analiza je obavljena u 1-nedeljnoj vremenskoj tački da se identifikuju najranije promene u interakcijama intraglomerularnih ćelija-ćelija izazvanih povredom podocita koje na kraju dovode do CKD.
Materijali i metode
Briga o životinjama
Ovu studiju je odobrio Komitet za brigu o životinjama i korištenje u Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School. Sve studije na životinjama izvedene su u skladu sa smjernicama koje je uspostavio i odobrio Komitet za njegu i korištenje životinja u Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School. iCrepod-Ctcfwt/fl miševi su generirani kao što je prethodno opisano13 i inbred za generiranje iCrepod-Ctcffl/fl (iCTCFfl/fL) i iCrepod-Ctcfwt/wt [divljeg tipa (WT)] miševa. U ovom istraživanju korišteni su i mužjaci i ženke miševa. Doksiciklin (4 g/L) (Sigma D9891) je kontinuirano davan u vodi za piće koja je sadržavala saharozu (50 g/L) (VWR BDH0308) iCTCFfl/fL (generira iCTCFpod / miševe) i WT kontrolnim miševima legla (6 do 8). sedmicama starosti na početku upotrebe doksiciklina) kako bi potaknuli ekspresiju Cre posebno u podocitima.
Obogaćivanje glomerula iz cijelog bubrega
iCTCFpod / i WT miševi su žrtvovani nakon 1 sedmice tretmana doksiciklinom, a bubrezi su brzo secirani i isprani ledeno hladnim Hanksovim izbalansiranim rastvorom soli (kataloški broj 14170112, Thermo Scientific, Waltham, MA). Nakon uklanjanja bubrežnih kapsula, glomeruli su obogaćeni na 4°C tehnikom prosijavanja14 sa 180-mm, 75-mm i 53-mm sitom. Frakcije obogaćene glomerularima sakupljene iz 53-mm sita su isprane ledeno hladnim 1 Hanksovim izbalansiranim rastvorom soli i stavljene na led.
Priprema jednoćelijskih suspenzija
Priprema biblioteke i sekvenciranje jedne ćelije
Pojedinačne ćelije su obrađene preko 10 Chromium 30Single Cell Platforme koristeći Chromium Single Cell 30Library, Gel Bead i Chip komplete (10 Genomics, Pleas anton, CA), prateći protokol proizvođača. Ukratko, 10,000 ćelije su dodane u svaki kanal čipa da bi se podijelile na gel perle u emulziji u Chromium instrumentu, nakon čega je uslijedila ćelijska liza i barkodirana reverzna transkripcija RNK u kapljicama. Razbijanje emulzije praćeno je pojačavanjem, fragmentacijom i dodavanjem adaptera i indeksa uzorka. Biblioteke su objedinjene i sekvencionirane na Illumina HiSeq.
Lančana reakcija hibridizacije
Svi reagensi lančane reakcije hibridizacije (HCR) v3 (sonde, ukosnice i puferi) kupljeni su od Molecular Technologies (Pasadena, Kalifornija). Tanki dijelovi tkiva (10 m) postavljeni su u 24-done ploče od stakla bunara (kataloški broj 82050-898, VWR, Radnor, PA) premazane 1:5{{38} } razblaživanje (3-aminopropil)trietoksisilana (kataloški broj 440140, Sigma-Aldrich). U tkivo su dodani sljedeći rastvori: 10% formalin (kataloški broj 100503- 120, VWR) 15 minuta, dva pranja 1 PBS (kataloški broj AM9625, Thermo Fisher Scientific), ledeno hladan 70% EtOH na 20 C 2 sata (do noći), tri ispiranja 5 fiziološke otopine natrijum citrata sa 0,2% Tween-20 (SSCT) (kataloški broj 15557044, Thermo Fisher Scientific), hibridizacijski pufer (Molecular Technologies) 10 minuta, sonde u pufer za hibridizaciju preko noći, četiri ispiranja pufera za ispiranje (Molecular Technologies) u trajanju od 15 minuta, tri ispiranja od 5 SSCT, pufera za pojačavanje (Molecular Technologies) u trajanju od 10 minuta i tri ispiranja po 15 minuta sa 5 SSCT (1:10,{{31 }} DAPI, kataloški broj TCA2412-5MG, VWR) u drugom pranju. Ukosnice su termički denaturirane u puferu za amplifikaciju preko noći. Uzorci su pohranjeni i snimljeni u 5 SSCT. Snimanje je izvedeno na rotirajućem disku konfokalnom (Yokogawa W1 na Nikon Eclipse Ti) koji radi na NIS-elementima AR softveru. Analiza i obrada slike izvršena je na softveru ImageJ Fiji verzije 2.1.0/1.53c (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij).
Obrada podataka i kontrola kvaliteta
A Cellranger toolkit (version 2.1.1) was used to perform demultiplexing using the cellranger mkfastq command and the cellranger count command for alignment to the mouse transcriptome, cell barcode partitioning, collapsing unique molecular identifier (UMI) to transcripts, and gene-level quantification. Cells were filtered to include cells expressing a minimum of 500 genes and a maximum of 4000 genes. Furthermore, the percentage of reads mapping to mitochondrial genes was capped at 12%. DoubletFinder was used to identify potential doublets.15 Clusters with >75% ćelija klasifikovanih kao dubleti visoke pouzdanosti uklonjeno je iz dalje analize. Preostale ćelije klasifikovane kao dubleti visoke pouzdanosti takođe su uklonjene iz dalje analize. Analiza je uključivala smanjenje broja ćelija kako bi se uračunala ova razlika. Na primjer, ako je bilo manje WT ćelija u datom tipu ćelije, za analizu diferencijalne ekspresije korišten je nasumični uzorak iCTCF ćelija jednak broju WT ćelija.
Nenadzirano grupisanje i smanjenje dimenzionalnosti
Zadane postavke u Seurat R paketu16 verzija 3.0 korištene su za normalizaciju (NormalizeData) broja ekspresija gena, identifikaciju varijabilnih gena (FindVariableGenes), pronalaženje sidra integracije (FindIntegrationAnchors) i integraciju uzoraka (IntegrateData) . Do neželjenih varijacija došlo je zbog broja UMI-ova i omjera mapiranja očitavanja prema mitohondrijalnim genima (ScaleData). Smanjenje dimenzionalnosti izvršeno je pomoću analize glavnih komponenti (RunPCA) na visoko varijabilnim genima. PCElbowPlot() funkcija je korištena za razlikovanje glavnih komponenti za dalju analizu. Za grupisanje svih ćelija, prve 40 glavne komponente su dovoljno obuhvatile svu varijansu. Molekularno različiti klasteri su identificirani korištenjem zadanih parametara (FindClusters) i rezolucije 0.4 (FindNeighbors). Podaci su obrađeni i skalirani kako je gore opisano nakon podskupine glomerularnih ćelija. Ukupno 30 glavnih komponenti korišteno je za nizvodno grupiranje u rezoluciji od 0,3 (FindNeighbors).
Klasifikacija tipova ćelija
Generi obogaćeni klasterima ili markeri izračunati su korištenjem Wilcoxon testa sume ranga (FindAllMarkers) za diferencijalnu ekspresiju gena u ćelijama klastera u odnosu na sve druge ćelije i odabirom onih gena koji prolaze prilagođenu vrijednost P (stopa lažnog otkrivanja) od {{1 }}.05 kao predstavnik klastera. Identitet klastera je dodijeljen poređenjem gena zasnovanih na podacima sa listom gena za zrele tipove bubrežnih ćelija kuriranih u literaturi.
Analiza diferencijalne ekspresije gena
Analiza diferencijalne ekspresije u paru u Seuratu (FindMarkers) je korištena sa pragom promjene log puta postavljenim na {{0}}.01 i zadanim parametrima za analizu diferencijalne ekspresije između iCTCFpod / i WT ćelija u određenom klasteru. U okviru FindMarkera, ident.1 je postavljen na iCTCFpod / ćelije specifične za klaster, a ident.2 je postavljen na odgovarajuće WT ćelije specifične za klaster. Geni sa prilagođenim P < 0,05 smatrani su značajnim.
Analiza prevelike zastupljenosti
Analiza prekomjerne zastupljenosti korištena je da se utvrdi da li su neke poznate biološke funkcije ili procesi prezastupljeni ili obogaćeni na listi(ama) različito eksprimiranih gena.17 R paket clusterProfiler,18 posebno funkcija enrichGO, korišten je za analizu prevelike zastupljenosti. Korišteni su zadani parametri, sa izuzetkom ont Z BP, pvaluecutoff Z 0.25 i qvaluecutoff Z 0.25. R paket obogaćivanje (GitHub, https://github.com/YuLab-SMU/enrichplot, posljednji put pristupljeno 30. avgusta 2021.) je tada korišten, posebno funkcija emapplot, za vizualizaciju rezultata obogaćivanja iscrtavanjem gornjih pojmova obogaćivanja.
Analiza ligandnih receptora
iTALK19 je korišten za mapiranje receptora na ligande koji su različito eksprimirani u iCTCFpod / podocitima. Konkretno, rawParse je korišten za izračunavanje srednje ekspresije svakog gena, koristeći skalairane podatke iz Seurata. FindLR korištenjem srednjeg broja podataka tipa Z korišten je za identifikaciju parova liganda i receptora. Parovi liganda i receptora od interesa su nacrtani koristeći zadane parametre LRPlota. Debljina linija ukazuje na relativnu srednju ekspresiju liganda, a veličina vrha strelice ukazuje na relativnu srednju ekspresiju receptora.
NicheNet analiza
R paket NicheNet20 korišten je za predviđanje interakcija ligandreceptora koje bi mogle dovesti do promjena u ekspresiji gena u tipu ćelije od interesa. Svi klasteri podocita i svi klasteri endotela su kombinovani za ovu analizu. Korišteni su svi zadani parametri sa izuzetkom postavljanja donjeg graničnog praga od 0.11 za vizuelizaciju pripreme_liganda_cilja_. HCR obrada slike i kvantifikacija Slike su obrađene pomoću softvera ImageJ2 (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij). Za datoteke ImageJ korišćena je verzija 2.1.0/1.53c (http://imagej.net/ Contributors (posljednji put pristupljeno 2. avgusta 2020). Sirovi ND2 fajlovi su oduzeti u pozadini koristeći Rolling Ball metodu (kotrljajući Z 50 klizni stog) Zatim su projektovani srednji intenziteti slika Z-staka, a kanali slike su podeljeni i sačuvani odvojeno CellProfiler verzija 3.1.5 (Broad Institute of MIT i Harvard, Cambridge, MA)21 je korišćen za segmentaciju ćelija na osnovu intenziteta fluorescencije. DAPI kanala i za mjerenje intenziteta integrisane fluorescencije u ostatku kanala procijenjeni su za statističku analizu svi glomeruli sa 40 slika.
Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kupite za više detalja o specifikacijama:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 25% EHINAKOZIDA I 9% AKTEOZIDA ZA BUBREŽNU FUNKCIJU
