Abstract
Pozadina AKI je uobičajena posljedica infekcije SARS-CoV-2 i doprinosi ozbiljnosti i smrtnosti od COVID-19. Ovdje smo testirali hipotezu dapromene bubregaizazvan AKI-om povezanim s COVID-19 mogao bi se otkriti u stanicama prikupljenim iz urina. Metode Izvršili smo jednoćelijsko sekvenciranje RNK (scRNAseq) na ćelijama dobijenim iz urina osam hospitaliziranih pacijenata sa COVID-19 sa (n55) ili bez AKI (n53), kao i četiri pacijenta sa ne-COVID-19 AKI (n54) za procjenu razlika u ćelijskom sastavu i ekspresiji gena tokom AKI. Rezultati Analiza 30.076 ćelija otkrila je raznoliku lepezu tipova ćelija, od kojih je većina bilabubreg, urotelne i imunološke ćelije. Analiza puteva tubularnih ćelija pacijenata sa AKI pokazala je obogaćivanje transkripata povezanih sa putevima povezanim sa oštećenjem u poređenju sa onima bez AKI. Ekspresija ACE2 i TMPRSS2 bila je najveća u urotelnim ćelijama među oporavljenim tipovima ćelija. Značajno je da smo kod jednog pacijenta otkrili SARS-CoV-2 virusnu RNK u urotelnim ćelijama. Ove iste ćelije su obogaćene za transkripte povezane sa antivirusnim i antiinflamatornim putevima. Zaključci Uspješno smo izveli scRNAseq na sedimentu mokraće hospitaliziranih pacijenata sa COVID-19 kako bismo neinvazivno proučavali ćelijske promjene povezane s AKI i uspostavili skup podataka koji uključuje i ozlijeđene i neozlijeđene ćelije bubrega. Osim toga, pružamo preliminarne dokaze o direktnoj infekciji ćelija mokraćnog mjehura SARS-CoV-2. Urinarni sediment sadrži obilje informacija i koristan je izvor za proučavanje patofiziologije i staničnih promjena koje se javljaju ubolesti bubrega.
ORGANSKA ZDRAVSTVENA HRANA ZA ZDRAVLJE BUBREGA
Uvod
Teški akutni respiratorni sindrom infekcija koronavirusom 2 (SARS-CoV-2) pokreće patologiju u više sistema, uključujući bubrege, a AKI je povezan sa značajnim morbiditetom i mortalitetom u bolesti koronavirusa 2019. (COVID-19) (1 –5). Više studija je pokazalo visoku stopu AKI-ja među hospitaliziranim pacijentima s COVID-19 (6), pri čemu su neke prijavile i do 50% inficiranih osoba koje su razvile AKI (7-9). Primarni SARS-CoV-2 receptor ACE2 eksprimiran je na epitelnim ćelijama u cijelom urinarnom sistemu, uključujući ćelije proksimalnih tubula i urotelne ćelije (10–13), iako je nejasno da li je AKI kod pacijenata sa COVID-19 je posljedica direktne virusne infekcije proksimalnih tubula ili je rezultat sistemskog odgovora na SARS-CoV-2 (14–22). Slično tome, nejasno je može li SARS-CoV-2 izazvati virusni cistitis putem direktne infekcije urotelnih ćelija, iako je ta mogućnost predložena (23-26). Uprkos visokoj prevalenci AKI-ja povezanog s COVID-19, osnovne ćelijske promjene koje se javljaju u okruženju AKI-ja ostaju slabo shvaćene.
AKI povezan sa COVID-19 ostao je u velikoj meri nedovoljno istražen jer pristup tkivu bubrega zahteva biopsiju ili postmortalnu analizu (27). Nedavne studije su otkrile raznovrstan niz ćelija bubrega, bešike i imunog sistema u urinu (28-30). Stoga, urin može ponuditi vrijedan uvid u neinvazivnu studiju promjena bubrega tokom AKI-ja povezane s COVID-19. Ovdje smo izveli jednoćelijsko RNA sekvenciranje (RNA-Seq) kako bismo okarakterizirali ćelijsku raznolikost u urinu hospitaliziranih pacijenata sa COVID-19 sa i bez AKI. Testirali smo hipotezu da se promjene bubrega u AKI povezane s COVID-19 mogu otkriti u stanicama prikupljenim iz urina. Također smo prikupili uzorke od pacijenata bez COVID-19 i sa AKI (ne-COVID-19 AKI). Pronašli smo nekoliko populacija upalnih imunoloških stanica i različito aktiviranih puteva u AKI povezanom s COVID-19, kao i preliminarne dokazeza direktnu infekciju urotelnih ćelija SARS-CoV-2.
Materijali i metode
Učesnici i varijable Odrasli u dobi od 18 godina i više su pregledani tokom prijema ili transfera na Univerzitet Alabama u bolnici u Birminghamu (UAB) između marta i maja 2021. Slučajevi AKI su identificirani pomoćuBolest bubregaPoboljšanje definicije globalnih ishoda kao porast serumskog kreatinina (sCr) .0,3 mg/dl u roku od 48 sati ili 0,1,53 početne vrijednosti kreatinina. Kontrole bez promjene u kreatininu odabrane su na osnovu podudaranja dobi i spola gdje je to moguće i obrađene sa svakim odgovarajućim AKI uzorkom. Osnovni sCr je određen korištenjem najnovije vrijednosti sCr 7–365 dana prije hospitalizacije. Dodatni klinički podaci u vezi sa demografijom, medicinskom istorijom, kliničkim karakteristikama i laboratorijskim vrednostima izvučeni su iz karata pacijenata preko tima UAB Centra za kliničke i translacione nauke i2b2. Uključeno je osam hospitaliziranih pacijenata sa COVID-19, pet sa AKI i tri bez AKI. Ovu studiju i kolekciju uzoraka odobrio je UAB institucionalni odbor za reviziju. Konsultativni tim UAB-a za akutnu nefrologiju je također prikupio uzorke pacijenata s AKI-jem koji nije COVID-19 (n54) kako bi uporedio ćelijske promjene sa AKI-om povezanim s COVID-19. Oni su prikupljeni prema drugom protokolu institucionalnog odbora za reviziju koji omogućava prikupljanje uzoraka ostatka urina i stoga je anoniman.
Sakupljanje i obrada uzoraka
Svi koraci su izvedeni na ledu. Urin je sakupljen ili kao ispražnjeni uzorak ili iz urinarnog katetera. Uzorci su odmah prebačeni u laboratoriju nivoa biološke sigurnosti 21 na obradu. Uzorci urina su prebačeni u 50-ml konusnu epruvetu i centrifugirani na 10003g 10 minuta na 4 C. Ćelijske pelete su isprane ledeno hladnim PBS, filtrirane kroz 40-mm filter i ponovo centrifugirane. Žive ćelije su pročišćene korišćenjem MACS kompleta za uklanjanje ostataka (Miltenyi Biotec), a zatim EasySep Annexin V kompleta za uklanjanje mrtvih ćelija (StemCell). Ukratko, ćelije su resuspendovane u ledeno hladnom PBS-u i pomešane sa rastvorom za uklanjanje ostataka. Hladni PBS je prekriven smjesom i centrifugiran na 3003 g 10 minuta na 4 C. Gornje dvije faze su aspirirane, a zatim su preostale ćelije isprane sa PBS. Ćelije su resuspendirane i pomiješane sa koktelom za uklanjanje mrtvih ćelija, koktelom za odabir biotina, a zatim RapidSpheres prije razdvajanja u EasySep magnetu. Ćelije su isprane i resuspendirane u 52 ml PBS (bez kalcijuma ili magnezijuma) 10,04% BSA (Fisher Scientific) za obradu scRNAseq
scRNAseq
Pročišćene ćelije su prebačene u UAB protočnu citometriju i jednoćelijsko jezgro i odmah obrađene pomoću kompleta za sekvenciranje jednoćelijske RNK Chromium 39 (103Genomics) prema proizvođaču's uputstva.Suspenzija ćelija je izbrojana, kombinovana sa 103 Smjesa kromnog reagensa i stavljena u mikrofluidicjednoćelijski uređaj za particioniranje u kojem se lizira i preokrećetranskripcija se odvija u mikrokapljicama. Rezultirajuća cDNKwas amplified by PCR i naknadno obrađen da se dobije
biblioteke sekvenciranja sa bar kodom. Sekvenciranje sa parom obavljeno je na platformi za sekvenciranje Illumina NovaSeq6000 ili NextSeq500 (Illumina). Čitanja su obrađenakoristeći 103 Genomics Cell Ranger jednoćelijski softverSuite verzija 6.0 na UAB Cheaha High-PerformanceRačunarski klaster. BCLfidatoteke su konvertovane u FASTQfiles koristeći brzu funkciju CellRanger. CellRangerfast je korišten za poravnanje FASTQfina prilagođeni genomkoji se sastoji od ljudskog genoma hg38 (GRCh38.p13) sa
genom SARS-CoV-2 (NC_045512.2) umetnut kao egzon (31). Za analizu su kreirane tabela gena, tabela bar kodova i matrice transkripcione ekspresijenavedeno u nastavku.
Analize podataka
Analize su provedene korištenjem paketa kreiranih za okruženje R statističke analize (verzija 4.06). Podaci su prvenstveno analizirani u Seurat verziji 3.2.3 (32,33) i njegovojpovezane zavisnosti. Podaci od svakog pacijentasu uvezeni pomoću Read103 funkciju, a zatim strukturpretvoren u Seurat objekat pomoću CreateSeuratObject. Zakontrola kvaliteta, ćelije sa jedinstvenim karakteristikama broje preko 2500ili ispod 200 i ćelije sa mitohondrijalnim proporcijama.15% je bilofiltered out. Podaci su normalizirani korištenjem LogaNormalizirati i skalirati da se pripremi za linearnu dimenzijusmanjenje. Predmeti pojedinačnih pacijenata su označenisa jedinstvenim grupnim identitetomfikatjone, a zatim spojene u ajedan objekt koji koristi Seurat funkciju spajanja. Patient Samplesovi su integrisani sa funkcijom RunHarmony koristećiHarmony R paket (34). Analiza glavnih komponentiizvršeno je, a zatim su ćelije grupirane na osnovudiferencijalnu ekspresiju gena kako je odredio SeuratFunkcija FindAllMarkers postavljena na rezoluciju od jedan. Dimensionalna redukcija je izvedena pomoću uniformnog razvodnikaaproksimacija i projekcija. Tipovi ćelija su bili identičnifiedupoređivanjem različito izraženih transkripata zasvaki klaster sa poznatim transkriptima povezanim sa specific tipovi ćelija (29,35,36). Za pokretanje je korišten paket Escape RAnaliza obogaćivanja skupa gena (GSEA) (37). WebGestaltRje korišten za analizu genske ontologije za identifikaciju putevakoristeći Biološki proces i Kjoto enciklopedijuBaza podataka o genima i genomima (38).
