Istovremena stabilizacija aktinskog citoskeleta u više ćelija specifičnih za nefron štiti bubreg od različitih povreda

Hronične bolesti bubregaiakutna povreda bubregasu mehaničkirazličite bolesti bubrega. Dok su hronične bolesti bubrega povezane sapovreda podocita, akutna povreda bubregautječe na epitelne stanice bubrežnih tubula. Uprkos ovim razlikama,kardinalna karakteristikaod obaakutne i hronične bolesti bubregaje disregulirani aktinski citoskelet. To smo pokazalifarmakološka aktivacija dinamina GTPazeublažava ozljedu podocitamišji modeli kroničnih bubrežnih bolestibypodstiču polimerizaciju aktina. Ovdje utvrđujemo ulogu dinamina u moduliranju krutosti i polaritetabubrežne tubularne epitelne ćelijeumrežavanjem aktinskih filamenata u razgranate mreže. Aktivacija sposobnosti umrežavanja dinamina pomoću agonista male molekule stabilizira aktomiozinski korteks apikalne membrane od ozljeda, što zauzvratčuva funkciju bubregau različitim mišjim modelima akutne ozljede bubrega. Značajno je da agonist dinamina istovremeno slabi podocit itubularna povredau genetskom mišjem modelu Alportovog sindroma. Naša studija pruža dokaze o izvodljivosti i naglašavaprednosti novih holističkih terapija za zaštitu nefrona.

KLIKNITE OVDJE DA ZNATE BILJNU FORMULACIJU CISTANCHE DOBRE KOD AKUTNE POVREDE BUBREGA

Thevodeći uzroci akutnog oštećenja bubrega(AKI) suishemija, hipoksija, ilinefrotoksičnost1. Iako se može preokrenuti, AKI predstavlja značajan zdravstveni problem sa visokim mortalitetom i bez konačnog liječenja. Bez obzira na svoju etiologiju, AKI prvenstveno ozljeđuje polarizirane epitelne stanice bubrežnih tubula čije apikalne mikroresice formiraju tubularni rub četkice koji sudjeluje u koordinaciji transporta esencijalnih elektrolita i vode2. Rana morfološka karakteristika AKI je gubitak ruba četkice i polariteta ćelije zbog razgradnje aktomiozinskog korteksa na apikalnoj membrani1.

Uspostavljanje i održavanje ćelijskog polariteta uključuje signalne kaskade, membranski promet i dinamiku citoskeleta, a sve su to visoko koordinirane3. Organizacija apikalne membrane je u velikoj mjeri određena arhitekturom aktomiozinskih mreža4, ​​koja uspostavlja krutost korteksa, čime se olakšava grupisanje proteina polariteta. Dok se motori miozina II smatraju primarnim generatorom kortikalne krutosti5,6, arhitektura aktomiozinskog korteksa uspostavljena je bezbrojnim proteinima koji vezuju aktin (ABP)7.

Pored poznatih ABP, četkica bubrežnih tubula je visoko obogaćena dinaminom8, GTPazom koja je najpoznatija po svojoj ulozi u endocitozi9. Dynamin ima intrinzičnu sklonost sklapanju u višestruka stanja oligomerizacije kao što su dimeri, tetrameri, prstenovi i spirale9. Identifikovali smo po prvi put direktne interakcije dinamin-aktin10 i pokazali da oligomerizacija dinamina reguliše polimerizaciju aktina u podocitima11,12, specijalizovanim ćelijama neophodnim za selektivnost bubrežnog filtera. Koristeći mišje modele CKD, pokazali smo da aktivacija polimerizacije aktina zavisne od dinamike preokreće povredu podocita obnavljanjem njihove jedinstvene strukture i funkcije12.

Ovdje to pokazujemo ububrežne tubularne epitelne ćelije, dinamin unakrsno povezuje filamentni aktin (F-aktin) u razgranate mreže. Sposobnost Dynamina umrežavanja je definisana njegovim stanjem oligomerizacije i dužinom F-aktina. Farmakološka aktivacija dinaminske oligomerizacije suprotstavlja AKI tako što stabilizira aktinske mreže, a time i integritet ćelije, što djelomično štiti ćelije epitela bubrega od ozljeda izazvanih oksidativnim stresom. Naša studija identifikuje aktomiozinski korteks apikalne membrane bubrežne tubularne ćelije kao metu koja se može podesiti u AKI preko dinamina kao proksija

Rezultati Dinamička oligomerizacija utvrđuje krutost i morfologiju apikalne membrane.

Da bismo ispitali ulogu interakcija dinamin-aktin u polariziranim bubrežnim tubularnim epitelnim stanicama, koristili smo Bis-T-23, alosterični aktivator oligomerizacije dinamina zavisne od aktina u rekonstituiranom sistemu13, u stanicama11,13 i u cijeli organizam 12. Ćelijski fenotipovi su procijenjeni u stanicama Madin-Darby Canine Bubreg (MDCK) praćenjem statusa F-aktina i uzorka bojenja proteina uskog spoja zonula occludens-1 (ZO-1), što je smatra se biomarkerom ćelijskog polariteta. Citohalazin D (CytoD) i latrunculin A (LatA), poznati inhibitori polimerizacije aktina, snizili su nivoe F-aktina i izazvali diskontinuirano ZO-1 bojenje (dodatna slika 1a). Nasuprot tome, Bis-T-23 je izazvao blagi porast nivoa F-aktina bez ikakvog efekta na ZO{17}} bojenje. Dodatak Bis-T-23 prije, ali ne nakon LatA, djelomično je sačuvao nivoe F-aktina i polaritet ćelije. Ni DMSO vehikulum ni inhibitor dinamina dynole14 nisu pokazali nikakav efekat (dopunska slika 1a).

Skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM) nam je omogućila da vizualiziramo promjene morfologije stanica uzrokovane lijekovima fokusirajući se na apikalnu membranu (slika 1a). Prosječna visina MDCK ćelija bila je 11 ± 2 µm, a prosječna dužina mikroresica je bila 0,63 ± 0,2 µm (Tabela 1), što je unutar raspona uočenog u bubregu15. LatA je smanjio visinu ćelije i dužinu mikroresica i pomerio ravnomerno raspoređene mikroresice u klastere, dok je Bis-T-23 inducirao suprotne efekte (Tabela 1, Slika 1a). Kada se doda prije LatA, Bis-T-23 je djelimično sačuvao visinu ćelije i dužinu mikroresica. Budući da mikroresice pokazuju izuzetnu kontrolu dužine koju definira kortikalni aktin u njihovoj bazi16, ovi podaci pružaju dokaz da je Bis-T-23 modificirao aktomiozinski korteks na apikalnoj membrani.

Da bismo utvrdili tačan efekat koji je Bis-T-23 imao na kortikalni aktin, vizualizirali smo aktomiozinski korteks unutar lamelipodije korištenjem platine replike elektronske mikroskopije (PR-EM). LatA je smanjio gustinu aktinskih mreža, a ovaj efekat je djelimično poništen dodavanjem Bis-T-23 prije LatA (slika 1b). Kako LatA ubrzava depolimerizaciju aktinskih filamenata izdvajanjem aktinskih monomera, zatim smo ispitali da li je uočeno očuvanje korteksa aktomiozina od strane Bis-T-23 posljedica njegovog pozitivnog učinka na polimerizaciju aktina. Za razliku od moćne stimulacije polimerizacije aktina uočenog u ekstraktima ćelija podocita10,11, Bis-T-23 samo je neznatno povećao polimerizaciju aktina u ekstraktu MDCK ćelija (dopunska slika 1b). Slično, imunodeplecija endogenog dinamina-2 (Dyn2) iz ekstrakta ili inhibicija njegove GTPazne aktivnosti od strane dynode rezultiralo je marginalnim oštećenjem polimerizacije aktina (dopunska slika 1c). Dok su LatA i CytoD značajno poremetili polimerizaciju aktina, dodavanje Bis-T-23 prije LatA ili CytoD nije bilo u stanju da prevlada njihove inhibitorne efekte (dodatna slika 1d, e). Jasplakinolid, lijek koji inducira polimerizaciju aktina stimulacijom nukleacije aktinskih filamenta17, nije značajno povećao ukupni nivo polimerizacije (dopunska slika 1d), što sugerira da lizat MDCK ćelija pokazuje skoro maksimalan nivo polimerizovanog aktina. Zajedno, ovi podaci ukazuju da su efekti Bis-T-23 na morfologiju apikalne membrane u MDCK ćelijama vođeni mehanizmom koji nije polimerizacija aktina.

S obzirom na opšte znanje o obogaćenoj lokalizaciji Dyn2 i F-aktina na rubu bubrežnih epitelnih ćelija8, i ulozi dinamina u endocitozi, zatim smo istražili da li Bis-T-23 utječe na aktin indirektno putem promjena u endocitozi. Kao što se očekivalo, i Dyn2 i F-aktin ko-lokalizirani su u korteksu aktomiozina ispod apikalne membrane, unutar mikrovila i u jamicama obloženim klatrinom (CCP), definirane njihovim različitim oblikom i veličinom (dopunska slika 1f). Ispitivali smo dinamiku CCP koristeći mikroskopiju fluorescencije totalne interne refleksije (TIRF)18,19. Bis-T-23, čak i u svojoj najvišoj koncentraciji, nije imao utjecaja na distribuciju životnog vijeka CCP-a, dok je dynol smanjio broj produktivnih CCP-a (dopunska slika 1g). Ovaj nedostatak korelacije između nivoa endocitoze i promjena u morfologiji ćelija tvrdi da Bis-T- 23 cilja na kortikalni aktin bez utjecaja na ulogu dinamina u endocitozi.

Budući da se polaritet bubrežnih ćelija održava arhitekturom i kontinuiranom kontrakcijom aktomiozinskih mreža, što uspostavlja krutost ćelije na apikalnoj membrani20, zatim smo izmjerili krutost ćelije pomoću mikroskopije atomske sile (AFM). Sistem Nanowizard IV i softver za analizu JPK korišteni su za određivanje promjena u Youngovom modulu21 pod različitim eksperimentalnim postavkama (dopunska slika 2a). Tretman LatA je rezultirao značajnim smanjenjem krutosti kontakta stanica-ćelija i krutosti apikalnih ćelija u MDCK ćelijama (Slika 1c–e). Nasuprot tome, Bis-T-23 značajno povećava krutost ćelije u poređenju sa DMSO nosačem (slika 1c–e), u skladu sa njegovim pozitivnim efektima na visinu ćelije, broj mikroresica i gustinu aktinskih mreža (tabela 1 i Slika 1b)22. Dodavanje Bis-T-23 prije LatA snažno je smanjilo negativni učinak LatA na krutost stanica (slika 1c–e), u skladu sa pozitivnim djelovanjem Bis-T-23 na aktinske mreže i morfologiju apikalne ćelije (tabela 1, slika 1b).

Slika 1 Dinaminska oligomerizacija definiše krutost ćelije utječući na arhitekturu aktina u ćelijama epitela bubrega. a Reprezentativne SEM slike MDCK ćelija tretiranih DMSO (0.1%) ili Bis-T-23 (30 µM, 0.1% DMSO) za 1 0 min prije dodavanja DMSO (0.1%) ili LatA (0.2 µM, 0.1% DMSO) za 2{{23} } min. Uvećane slike umetaka (područja u narandžastim kutijama) pokazuju raspored, distribuciju i gustinu mikroresica na apikalnoj membrani. b Reprezentativne PR-EM slike MDCK ćelija tretiranih kako je objašnjeno u (a). Slike pokazuju promjene u organizaciji aktomiozinskog korteksa u MDCK ćelijama pod naznačenim uslovima. c Reprezentativne slike Youngovih modula mapa MDCK ćelija tretiranih kako je objašnjeno u (a). d, e Stupasti grafikoni koji predstavljaju Youngov modul koji prikazuju krutost ćelije mjerenu na spoju ćelija-ćelija (d) ili na apikalnoj membrani (e). Svaki simbol predstavlja prosječnu krutost jedne ćelije. Rezultati prikazani u d, e su generirani iz najmanje 10 ćelija iz najmanje tri posude za kulturu. Trake greške, srednja vrijednost ± SD (*P manje ili jednako 0,05, **P manje ili jednako 0,01, ***P manje ili jednako 0,001, ****P manje od ili jednako 0,0001, neupareno dvostrani t-test). ns, nije značajno.

Takođe smo odredili krutost ćelije koristeći BioScope II sistem kao alternativni eksperimentalni pristup za AFM. U ovom slučaju, krivulje utiskivanja sile su dobivene prema modelu Dischera i saradnika koji su izračunati pomoću Matlab softvera23. Slični trendovi u pogledu krutosti ćelija zabilježeni su za međudjelovanje između LatA i Bis-T-23 (dopunska slika 2b, 2c). Osim toga, dynode nije pokazao nikakav učinak na krutost ćelije, dok je CytoD značajno smanjio krutost ćelije (dopunska slika 2d, e), u skladu sa njihovim fenotipovima aktina (dopunska slika 1a). Ovi podaci zajedno utvrđuju korelaciju između statusa korteksa aktomiozina, krutosti ćelije, morfologije apikalne membrane i polariteta ćelije. Ovi nalazi također uvjerljivo pokazuju ulogu oligomerizacije dinamina u definiranju mehaničkih parametara polariteta epitelnih stanica putem njenog djelovanja na aktomiozinski korteks.

Dynamin unakrsno povezuje aktinske filamente u razgranate mreže koje su u osnovi polariteta ćelija. Kako bismo razjasnili molekularni mehanizam kojim oligomerizacija dinamina utječe na arhitekturu korteksa aktomiozina, zatim smo ispitali učinak dinamina na aktinske filamente u rekonstituiranom sistemu. Na osnovu trenutne hipoteze, dužina aktinskih filamenata definira njihov način unakrsnog povezivanja6. Kako je prosječna dužina kortikalnih aktinskih filamenata unutar mreže na prednjoj ivici između 100 i 150 nm24, ispitali smo efekte dinamina na organizaciju kraćih filamenata nastalih zatvaranjem F-aktina gelsolinom (Gsn-aktin) (Sl. 2a). Dodavanje Dyn2 rezultiralo je formiranjem velikih, razgranatih mreža (sl. 2b, c). Na osnovu veličina i oblika rekombinantnog Dyn2 (slika 2d), mreže su formirane pretežno od Dyn2 dimera (Dyn2DIMER) i tetramera (Dyn2TETRA) koji su u interakciji sa nekoliko aktinskih filamenata (slika 2e): Dyn2DIMER je vezan za dva filamenta, Dyn2TETRA je povezao do četiri filamenta, a Dyn2RING je povezao do šest filamenata. Malo uvećanje slika otkrilo je da mreže zavisne od dinamina formiraju obrazac manjih i većih prstenastih oblika (slika 2c).

Da bismo povezali opažanja iz rekonstituiranog sistema s ulogom dinamina u stanicama, zatim smo odredili lokalizaciju endogenog Dyn2 na kortikalnim aktinskim mrežama koristeći monoklonsko anti-Dyn2 antitijelo praćeno zlatom konjugiranim sekundarnim antitijelom (dodatna slika 3a-c). Kao što se vidi u rekonstituisanom sistemu, dinamin je povezan sa različitim brojem F-aktina unutar razgranatih mreža (slika 2f). Zajedno, ovi podaci identifikuju novu aktivnost dinamina, odnosno umrežavanje F-aktina u razgranate mreže.

Da bismo povezali sposobnost umrežavanja dinamina i zaštitni efekat Bis-T-23 na korteks aktomiozina i morfologiju apikalne membrane, zatim smo ispitali efekte Bis-T-23 na posredovane dinaminom mreže u rekonstituisanim sistemima (slika 3a). Na osnovu konturnih dijagrama, koji daju topografske prikaze različitih gustina filamenata, Bis T-23 je povećao ukupnu gustinu mreže (slika 3a), što bi se moglo objasniti povećanjem broja F-aktina vezanog za dinamin zbog povećanje njegove oligomerizacije. Osim toga, dinamin snažnije umrežava kraće filamente od dugih F-aktina (Slika 3a-c), što sugerira da je sposobnost dinamina da formira razgranate mreže definirana njegovim statusom oligomerizacije i dužinom aktinskih filamenata. Sposobnost unakrsnog povezivanja aktinskih filamenata u mreže dijele dvije izoforme dinamina, sveprisutno eksprimirane Dyn2 i neuron-specifični dinamin-1 (Dyn1) (Slika 3b, c).

Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Prodavnica:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop