Simulirana mikrogravitacija utječe na biomarkere vezane za imunitet kod raka pluća
Aug 10, 2023
Abstract: Mikrogravitacija je nova strategija koja može poslužiti kao komplementarno sredstvo za razvoj budućih terapija raka. Kod karcinoma pluća, dobro je obrađen utjecaj mikrogravitacije na ćelijske procese i migracioni kapacitet ćelija. Međutim, njegov učinak na mehanizme koji pokreću progresiju raka pluća ostaje u povojima. U ovoj studiji, pokazalo se da je 13 različito eksprimiranih gena povezano s prognozom raka pluća pod simuliranom mikrogravitacijom (SMG). Koristeći analizu obogaćivanja skupa gena, ovi geni su obogaćeni putevima humoralnog imuniteta. Umjesto toga, alveolarne bazalno-epitelne (A549) ćelije su bile izložene SMG preko 2D klinostat sistema in vitro. Pored promjene morfologije i smanjenja stope proliferacije, SMG je vratio fenotip epitelne u mezenhimalni prijelaz (EMT) A549, ključni mehanizam u progresiji raka. Ovo je dokazano povećanom ekspresijom E-kadherina u epitelu i smanjenom ekspresijom mezenhimskog N-kadherina, te stoga pokazuje manje metastatsko stanje. Zanimljivo je da smo uočili povećanu ekspresiju FCGBP, BPIFB, F5, CST1 i CFB i njihovu korelaciju sa EMT pod SMG, što ih čini potencijalnim tumor supresorskim biomarkerima. Zajedno, ovi nalazi otkrivaju nove mogućnosti za uspostavljanje novih terapijskih strategija za liječenje raka pluća.
Ključne riječi: simulirana mikrogravitacija; EMT; rak pluća; metastaze; tumor supresor; biomarker
Efekti biljke Cistanche-Antitumor
1. Uvod
Svemir je poznat po tome što nema vektor gravitacije, koji utiče na tijelo na nivou organa, tkiva i ćelija. Mikrogravitacija, stanje prividnog bestežinskog stanja, značajan je svemirski stresor za koji se zna da značajno utječe na ljudsko zdravlje, kao što je gubitak kostiju, atrofija mišića i dekondicioniranje srca [1,2]. Utjecaj mikrogravitacije na ćelije raka također je sve veći fokus interesovanja u svemiru i istraživanju raka. Pokazalo se da mikrogravitacija potiskuje aktivnost imunoloških ćelija i remeti sisteme više tijela, što može povećati rizik od razvoja raka [2–4]. Zbog ovih očiglednih zdravstvenih problema, okruženje mikrogravitacije omogućilo je istraživačima da proučavaju biofizičke mehanizme na koje utiče mikrogravitacija i pomoglo u otkrivanju terapeutika za neurodegenerativne poremećaje, imunoterapije i potencijalno boljih i ciljanijih terapija protiv raka [4–6]. Brojne studije su dobro dokumentovale i pregledale velike implikacije koje mikrogravitacija ima na ćelijsku progresiju, proliferaciju i apoptozu u bezbroj tumorskih ćelijskih linija, uključujući rak pluća [7-12]. Međutim, pokazalo se da mnoge druge studije koje uključuju mikrogravitaciju izazivaju promjene u ekspresiji gena koje su uključene u proliferaciju stanica raka, metastaze i preživljavanje, pomjerajući stanice prema manje agresivnom fenotipu [13,14]. Ovo bi moglo baciti svjetlo na nova razumijevanja tumorske biologije i dijagnoze, stoga naglašavajući mikrogravitaciju kao inovativni alat za otkrivanje novih ciljeva u nadi da će se razviti novi istraživački pristupi i poboljšati terapijske strategije. Rak pluća, s karcinomom ne-malih stanica pluća (NSCLC) kao najistaknutijim tipom, vodeći je uzrok smrti, čini 12% svih karcinoma i najčešće dijagnosticirani rak [15]. U studijama koje su uključivale mikrogravitaciju, koje bi nas mogle usmjeriti da bolje razumijemo kancerogeni proces, pokazalo se da ćelije raka pluća gube svoju stabljiku nakon izlaganja mikrogravitaciji, čime utječu na rast i funkciju stanica raka [11]. Studija Ahn et al. pokazalo je da izlaganje ćelija raka pluća (A549) mikrogravitaciji izaziva brzu migraciju i proliferaciju. Ovo je objašnjeno povišenim nivoima matriksnih metaloproteaza (MMP-2 i MMP-9) pod mikrogravitacijom, što igra ključnu ulogu u invaziji i migraciji raka [10]. U drugoj studiji, Chung et al. otkrili su da simulirana mikrogravitacija nije značajno uticala na proliferaciju ćelija raka pluća, već je povećala migraciju u poređenju sa kontrolnom grupom pod normalnom gravitacijom [16]. Naprotiv, Chang et al. pokazalo smanjenje migracije u ćelijskoj liniji raka pluća A549 nakon 24 sata izlaganja uslovima mikrogravitacije [17]. Uprkos značajnim efektima mikrogravitacije na ćelijsko ponašanje, koje uključuje apoptozu, migraciju i invazivnost, njen učinak na rak pluća tek treba u potpunosti razjasniti. Dobro je poznato da epitelne ćelije prolaze kroz nekoliko biohemijskih promena kako bi se uspostavio mezenhimski fenotip koji povećava otpornost na apoptozu, invazivnost i migracione sposobnosti. Takav biološki proces poznat je kao tranzicija epitela u mezenhim (EMT), što je znak progresije raka [18]. Odnos EMT-a i progresije raka je dobro diskutovano. Poznato je da tumori aktiviraju EMT povećanjem transkripcionih faktora, ekspresijom proteina na površini ćelije i proizvodnjom enzima koji razgrađuju ECM. Jednom kada se EMT aktivira, tumorske ćelije gube svoju ćelijsku adheziju i stiču migratorna i invazivna svojstva [19]. Samo dvije studije su pokazale da simulirana mikrogravitacija inducira prolaznu epitelno-mezenhimsku tranziciju (EMT) u keratinocitima [9]. Osim toga, takvi fenomeni su istaknuti u MCF-7 ćelijama i HUVEC [20]; međutim, nijedna studija se nije fokusirala na efekat mikrogravitacije na EMT kod raka pluća. Uprkos brojnim ključnim otkrićima o sposobnosti mikrogravitacije da modulira tumorogene i metastatske procese raka, tačni mehanizmi pokretani mikrogravitacijskim gradom ostaju relativno nepoznati, stoga otvaraju pitanja u vezi s adaptivnim promjenama koje se javljaju na molekularnom nivou. U ovoj studiji smo identifikovali potpis gena povezanih sa imunitetom (FCGBP, BPIFB1, F5, CFB i CST1) koji su značajno pokazali povećanu ekspresiju mRNA u A549 ćelijama pod dejstvom simulirane mikrogravitacije (SMG). Osim toga, procijenili smo doprinos SMG u progresiji raka A549 putem EMT regulacije. FCGBP, BPIFB1, F5, CFB i CST1 i njihova korelacija sa ključnim markerima EMT pokazali su potencijalno manje metastatski fenotip raka pluća pod SMG. Nalazi ove studije pružaju osnovu za buduća istraživanja koja su potrebna za identifikaciju osnovnih mehanizama, koji će razviti naše razumijevanje i pomoći u razvoju novih terapijskih strategija za liječenje raka pluća.
Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor
2. Rezultati
2.1. Najčešći diferencijalno izraženi geni identificirani u ćelijama raka pluća pod simuliranom mikrogravitacijom (SMG) u poređenju sa prizemnom gravitacijom (GG)
Da bismo identificirali gene uključene u rak pluća pod simuliranom mikrogravitacijom (SMG), inicijalno smo istraživali gene koji su različito eksprimirani pod SMG u usporedbi s prizemnom gravitacijom (GG) za ljudski rak pluća koristeći javno dostupnu bazu podataka Gene Expression Omnibus (GEO). Odabrana su dva skupa podataka, GSE78210 i GSE36931, koji uključuju ekspresiju gena za dvije različite ćelijske linije humanog raka pluća, A549 i Colo699, kultivirane u 2D i 3D uvjetima ćelijske kulture. Razlike u profilima genetičke ekspresije između uzoraka SMG i GG prikazane su na grafovima vulkana (Slika 1). Identifikovani različito eksprimirani geni (DEG; Slika 2) za svaki skup podataka podijeljeni su na one koji su pojačano regulirani kod raka pluća (21 gen u A549 i 29 gena u Colo699 iz skupa podataka GSE78210 i 47 gena u A549 iz skupa podataka GSE36931) i one koji su smanjeni I rak pluća (40 gena u A549 i 27 gena Colo699 iz skupa podataka GSE78210 i 87 gena u A549 iz skupa podataka GSE36931), kao što je prikazano u Tabeli 1. Trinaest DEG je bilo značajno visoko eksprimirano u A549 ćelijama i GSE78210 skupa podataka u 1 GSE783610 SMG u poređenju sa GG stanjem. Najčešći geni identifikovani su pomoću Internet alata InteractiVienn (slika 2A). Geni kandidati uključuju AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP i BPIFA1. Da bi se utvrdilo da li su identifikovani DEG uključeni u uobičajene puteve, geni kandidati su učitani u Metascape (http://metascape.org; pristupljeno 11. novembra 2021.). Zanimljivo je da su ovi geni obogaćeni putevima koji uključuju humoralni imuni odgovor i reguliranu egzocitozu (slika 2B).
Slika 1. Grafikon vulkana koji prikazuje diferencijalno izražene gene (DEG) koristeći GEO Omnibus. (A) Vulkanski grafikon koji prikazuje DEG pod efektima SMG i GG u A549 ćelijama koristeći (A) GSE78210 i (B) GSE36931 skupove podataka. (C) Grafikon vulkana koji prikazuje DEG pod SMG i GG efektima u ćelijskoj liniji Colo699 koristeći skup podataka GSE78210. Crvena boja ukazuje na pojačano regulirane gene, dok plava boja ukazuje na niže regulirane gene.
Tabela 1. Ukupni geni koji su različito eksprimirani na SMG u poređenju sa GG u ćelijskim linijama raka pluća A549 i Colo699. Svaki skup podataka je imao promjene preklopa prilagođene za izdvajanje gornjih 5% DEG-ova. Za GSE36931, fold change (FC) je prilagođen tako da uključuje samo gene sa FC većim ili jednakim 4 ili manjim ili jednakim -4. Za GSE78210, FC je prilagođen tako da uključuje samo gene s FC većim ili jednakim 3 ili manjim ili jednakim -3.
Slika 2. Trinaest zajedničkih DEG-ova između skupova podataka GSE78210 i GSE36931 kod raka pluća. (A) Venov dijagram koji prikazuje 134 stepeni u GSE36931 (ćelijska linija A549), 61 stepeni u GSE78210 (ćelijska linija A549) i 56 stepeni u GSE78210 (ćelijska linija Colo699) pod SMG uslovima u poređenju sa GG. Od ukupno identifikovanih 251 gena, 13 DEG je uobičajeno između dva skupa podataka, GSE78210 i GSE36931, u ćelijskoj liniji A549. Venov dijagram je generiran pomoću InteractiVinn.
2.2. Diferencijalno izraženi geni u korelaciji sa kliničkom prognozom pacijenata sa adenokarcinomom pluća
Diferencijalno izraženi geni u korelaciji sa kliničkom prognozom pacijenata sa adenokarcinomom pluća Za procenu kliničke prognostičke vrednosti gena kandidata kod pacijenata sa adenokarcinomom pluća, Kaplan–Meier ploter (http://www.kmplot.com/; pristupljeno 11. novembra 2{ {44}}21) korišten je za poređenje ukupnog preživljavanja (OS) pacijenata sa adenokarcinomom pluća (LUAD) sa visokom/srednjom ekspresijom gena kandidata (Slika 3). Visoki nivoi ekspresije mRNA NOX1 (omjer opasnosti (HR), 1,45; 95% interval pouzdanosti (CI), 1,11–1,9; p=0.0058), GDA (HR , 1,74; 95% CI, 1,33–2,26; p=3.2e-05), TCN1 (HR, 1,62; 95% CI, 1,26–2,08; p=0.00014), i BPIFA1 (HR, 1,44; 95% CI, 1,12–1,84; p=0.0026) uočeno je da su značajno povezani sa lošom prognozom (Slika 3A-D). S druge strane, visoki nivoi ekspresije mRNA FCGBP (HR, 0,63; 95% CI, 0,46–0,85; p=0.0026) bili su povezani sa boljom prognozom i većim ukupnim preživljavanjem kod pacijenata sa LUAD (Slika 3E). Nije bilo značajne korelacije između mRNA
Slika 3. FCGBP, CST1, F5, CFB i BPIFB1 koreliraju sa kliničkom prognozom pacijenata sa adenokarcinomom pluća. Kaplan-Meier krive preživljavanja nivoa ekspresije mRNA gena kandidata: (A)NOX1; (B) GDA; (C) TCN1; (D) PLUNC; (E) FCGBP; (F) AZGP1; (G) H2Bf; (H) B7X; (I) AGR3; (J) CEACAM6; (K) F5; (L) BPIFB1; i (M) CST1 kod pacijenata sa adenokarcinomom pluća. HR: omjer opasnosti.
prednosti dodataka cistanche-antitumor
Kliknite ovdje da pogledate Cistanche proizvode
【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2.3. Ekspresija FCGBP, BPIFB1, F5, CFB i CST1 u ćelijama A549 nakon simulirane mikrogravitacije
Za validaciju ekspresije in silico identifikovanih gena (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP i BPIFA1), urađena je in vitro aplikacija pomoću qRT-PCR. Zanimljivo je da su korištenjem qRT-PCR-a naši podaci pokazali značajno povećanje ekspresije FCGBP mRNA, posebno na 48 i 72 sata u A549 ćelijama, nakon SMG-a u poređenju sa GG (Slika 4A). Pored toga, ekspresije mRNA CFB, F5 i BPIFB1 su značajno povećane 72 h nakon SMG, iu poređenju sa GG, u A549 ćelijama (Slika 4B, C, E). Blago povećanje, iako nije značajno, u ekspresiji mRNA je otkriveno za CTS1 pod SMG uslovima u poređenju sa GG (Slika 4D). Ekspresije AZGP1, AGR3, GDA, VTCN1, BPIFA1, NOX1, CEACAM5 i TCN1 su neodređene i za SMG i za GG (podaci nisu prikazani).
Slika 4. Povećana regulacija FCGBP, CST1, F5, CFB i BPIFB1 u uslovima SMG in vitro. Nivoi ekspresije mRNA (A) FCGBP, (B) CFB, (C) F5, (D) CTS1 i (E) BPIFB1, kvantificirani pomoću qRT-PCR i normalizirani na GAPDH u ćelijama A549 podvrgnutim GG i SMG uslovima tokom 24 , 48 i 72 h. Stupasti grafikoni prikazuju rezultate 3 nezavisna eksperimenta (n=3). * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001 i **** p < 0,0001.
Sve u svemu, ovi podaci impliciraju da različito izraženi FCGBP, F5, CFB i BPIFB1 kod raka pluća mogu igrati važnu ulogu u progresiji raka pluća.
2.4. Simulirana mikrogravitacija smanjuje vitalnost ćelije i preokreće tranziciju epitela u mezenhim u A549 ćelijskoj liniji raka pluća
Da bi se istražilo da li SMG utječe na potencijal proliferacije A549 ćelija, izvršena je analiza vitalnosti ćelije korištenjem testa isključenja tripan plavog. Naši podaci su otkrili da je SMG značajno inducirao vremenski ovisno smanjenje proliferacije stanica (Slika 5B). Smanjenje proliferacije ćelija bilo je značajno uglavnom nakon 48 i 72 h nakon SMG u poređenju sa GG, što je pokazalo povećanje ćelijske proliferacije A549 ćelija. Paralelno, promjena u ćelijskoj morfologiji otkrivena je u A549 ćelijama pod SMG. Da bi se procijenile ove promjene, ćelije su uklonjene iz stanja SMG, posađene na ploče 24-jažica i posmatrane pod svjetlosnom mikroskopijom nakon 1 h primjene SMG. Zanimljivo je da su ćelije izložene SMG otkrile granularnu, zgrudanu morfologiju nakon SMG. (Slika 5A).
Slika 5. Simulirana mikrogravitacija smanjuje vitalnost ćelije i izaziva morfološke promjene u A549 ćelijama na način ovisan o vremenu. (A) Reprezentativne mikrografije roditeljskih ćelija A549 (GG) i A549 ćelija koje su podvrgnute SMG tokom 24, 48 i 72 h pre nego što su ponovo zasijane na 1 sat pod GG. Slike su snimljene pri 10x uvećanju. (B) Vijabilnost ćelija A549 je procenjena korišćenjem testa isključenja tripan plave boje. Prosječna vitalnost ćelije 3 nezavisna eksperimenta prikazana je kao kontrola procenta. **** p < 0.0001. Slika 5. Simulirana mikrogravitacija smanjuje vitalnost ćelije i izaziva morfološke promjene u A549 ćelijama na način ovisan o vremenu. (A) Reprezentativne mikrografije roditeljskih ćelija A549 (GG) i A549 ćelija koje su podvrgnute SMG tokom 24, 48 i 72 h pre nego što su ponovo zasijane na 1 sat pod GG. Slike su snimljene pri uvećanju od 10x. (B) Vijabilnost ćelija A549 je procenjena korišćenjem testa isključenja tripan plave boje. Prosječna vitalnost ćelije 3 nezavisna eksperimenta prikazana je kao kontrola procenta. **** p < 0,0001.
Kineska biljka cistanche biljka-antitumor
Da bismo razumjeli dobijene podatke o smanjenoj ćelijskoj proliferaciji u A549, procijenili smo doprinos SMG mehanizmu epitelne-mezenhimalne tranzicije (EMT). EMT je zaštitni znak i važan mehanizam koji pokreće progresiju raka i metastaze, čime se poboljšava pokretljivost ćelija i invazivna svojstva [19]. Ključni EMT markeri (E-kadherin, N-kadherin, ZO-1 i Puž) i nivoi ekspresije mRNA metaloproteinaza MMP-2 i MMP-9 mjereni su qRT-PCR u A549, pod i GG i SMG (slika 6). Nakon primjene SMG, uočeno je značajno povećanje ekspresije mRNA E-kadherina, paralelno sa značajnim smanjenjem ekspresije mRNA N-kadherina, 48 i 72 h nakon SMG (Slika 6A, B). Neznačajno povećanje ZO-1 i MMP-9 i smanjenje transkripcionog faktora puževa otkriveno je na SMG (Slika 6C-E). MMP-2 je značajno smanjen u A549 48 h nakon SMG (Slika 6F), što ukazuje na manje invazivan oblik. Zajedno, ovi podaci podržavaju fenotip mezenhimsko-epitelne tranzicije (MET) izazvan SMG-om u A549.
Slika 6
2.5. Put tranzicije od epitela do mezenhima korelira s ekspresijom FCGBP, BPIFB1, F5, CFB i CST1
Da bi se stekao dalji mehanistički uvid u potencijalnu ulogu identifikovanih gena u A549 i njihovu moguću korelaciju sa EMT pod uslovima SMG, sprovedena je analiza interakcije gena korišćenjem GeneMANIA protiv EMT genskih markera. Slika 7 prikazuje interakcije gena ucrtane između EMT gena E-kadherin (CDH1), N-kadherin (CDH2), TJP1, CTNNB1, SNAI1 (puž), ZO-1, i -catenin, respektivno. Znajući njihovu značajnu ulogu u invaziji i migraciji raka, metaloproteinaze MMP-2 i MMP-9 su također uključene u analizu. Čvorovi identifikuju obrasce koekspresije između gena različite jačine na osnovu debljine čvora. Geni kandidati pokazuju stepen ko-ekspresije jedan drugog; BPIFB1 je ko-eksprimiran sa CFB i CST1; FCGBP se ko-izražava sa F5, CST1 i CFB; CST1 je ko-eksprimiran sa CFB, a F5 je ko-eksprimiran sa CFB, CST1 i BPIFB1. Čvorovi koekspresije su takođe identifikovani između EMT gena i gena kandidata; CDH1 je ko-eksprimiran sa FCGBP i F5; CDH2 je ko-eksprimiran sa F5, CST1, BPIFB1 i FCGBP; CTNNB1 je ko-eksprimiran sa CST1 i FCGBP; SNAI1 je ko-eksprimiran sa CST1, F5 i BPIFB1; TPJ1 je ko-eksprimiran sa CST1, FCGBP i F5; CTNNB1 je ko-eksprimiran sa CST1 i FCGBP; MMP2 je ko-eksprimiran sa BPIFB1 i CST1; i MMP9 je ko-eksprimiran sa F5, CST1, FCGBP i CFB. Ovi nalazi ukazuju na značajnu korelaciju između novih identifikovanih gena i EMT markera u uslovima SMG, verovatno u vezi sa EMT putevima.
Slika 7. FCGBP, CST1, F5, CFB i BPIFB1 koreliraju sa EMT putanjom. Mreža interakcija gen-gen odabranih gena kandidata; FCGBP, CST1, F5, CFB i BPIFB1 sa EMT genima; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 i SNAI1, kao i geni MMP2 i MMP9 povezani sa ćelijskom migracijom koje generiše GeneMANIA (http://genemania.org/; pristupljeno 11. novembra 2021.) za identifikaciju interakcija između gena kandidata sa EMT i markeri migracije ćelija. Različite boje ruba mreže ukazuju na primijenjene bioinformatičke metode: predviđanje web stranice (narandžasta), fizičke interakcije (crvena), koekspresija (ljubičasta), zajednički proteinski domeni (smeđa), put (svijetlo plava), ko-lokalizacija (tamno plava) i genetske interakcije (zelena)
3. Diskusija
Cistanche čaj
Diskusija Rak pluća, jedna od značajnih i svjetski prijetećih bolesti, nedavno je privukao veliku pažnju u "Svemirskim istraživanjima". Međutim, uprkos napretku u ovom polju, progresija raka pluća i njegov odgovor na liječenje ostaju kontroverzni zbog nedostatka definitivnih strategija procjene koje pomažu u prevenciji ili liječenju raka [21]. Koliko znamo, ovo je prvi izvještaj koji identifikuje skup gena kao potpis za progresiju raka pluća u mehaničkom okruženju izazvanom simuliranom mikrogravitacijom (SMG). Ističemo povećanu ekspresiju gena povezanih s imunološkim odgovorom FCGBP, BPIFB, F5, CST1 i CFB, i njihovu korelaciju s epitelno-mezenhimskom tranzicijom (EMT) pod SMG, čineći ih potencijalnim biomarkerima progresije raka pluća. Ovdje također ističemo učinak induciranog SMG-a na regulaciju EMT-a, što je znak progresije raka [18,22], u podržavanju fenotipa mezenhimske tranzicije u epitel (MET). Sve u svemu, ova studija nudi osnovu za povezanost identifikovanih gena sa EMT; međutim, potrebna su dalja istraživanja kako bi se otkrili tačni mehanizmi koji pomažu u razvoju nove ciljane terapije za rak pluća. U ovoj studiji prikazali smo trinaest gena (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP i BPIFA1) koji su značajno eksprimirani kod raka pluća pod simuliranom mikrogravitacijom (SMG) kao u poređenju sa gravitacijom tla u silikonu. Naši podaci su pokazali da su ovi različito eksprimirani geni obogaćeni putevima vezanim uglavnom za humoralni imunitet i reguliranu egzocitozu. Interes je paralelan s našim nalazima, iako je glavna funkcija FCGBP-a još uvijek nejasna [23]. Ovo može biti dijelom zbog kontradiktornih uloga koje ispoljava u različitim tumorima [25]. Na primjer, pokazalo se da je FCGBP značajno povezan s boljom ukupnom prognozom i preživljavanjem specifičnim za bolest kod pacijenata s rakom glave i vrata, karcinomom debelog crijeva i osteosarkomom [25–27], dok je kod karcinoma jajnika i prostate visoka ekspresija FCGBP je bio povezan sa lošijim ukupnim preživljavanjem [28]. Treba napomenuti da se uloga FCGBP pripisuje mehanizmima imunološke odbrane, protuupalnim odgovorima, kao i zaštiti ćelija [29,30], što ga čini bitnim prognostičkim markerom [31]. Koristeći in vitro aplikacije, procijenili smo ekspresiju identificiranih gena u karcinomu pluća iu uslovima SMG putem 2D klinostata. Postoji širok izbor tipova klinostata i drugih mikrogravitacionih platformi koje su razvijene. To uključuje 1/2/3 D klinostat sisteme, mašine za nasumično pozicioniranje opremljene bočicama (uglavnom za ćelije raka štitnjače) i posude sa rotirajućim zidom koje je razvila NASA. Svaki je dizajniran da služi određenom istraživačkom cilju, pri čemu su neki dizajnirani za kultivaciju adherentnih ili suspenzijskih ćelija, a drugi se koriste za online mjerenje kinetičkih odgovora. Treba napomenuti da je klinostat jedna od najjednostavnijih i najprilagodljivijih platformi koje koriste različite eksperimentalne aplikacije. U principu, 2D klinostat karakterizira os rotacije koja se kontinuirano rotira prilagođenom konstantnom brzinom iu smjeru koji je okomit na smjer vektora Zemljine gravitacije, stvarajući tako centrifugalne sile koje oponašaju stvarnu mikrogravitaciju [14,32,33 ]. Zanimljivo, od trinaest gena, ekspresije FCGBP, BPIFB, F5, CST1 i CFB značajno su se povećale kao odgovor na 2D klinostat izazvan SMG u A549 ćelijama. Izrazi FCGBP i BPIFB su bili najviše pogođeni, pokazujući značajno povećanje u svim procijenjenim vremenskim tačkama: 24, 48 i 72 h nakon SMG. Slično FCGBP, poznato je da BPIFB1 doprinosi odgovorima urođenog imuniteta [34]. Pokazalo se da BPI nabor koji sadrži protein člana 1 porodice B (BPIFB1), koji se prvenstveno proizvodi od epitela disajnih puteva, učestvuje u mehanizmima odbrane domaćina, zajedno sa baktericidnim i antiinflamatornim efektima [35]. U respiratornim bolestima, pokazalo se da BPIFB1 ispoljava antitumorske i antimetastatske efekte; međutim, tačni mehanizmi ostaju nejasni, što zahtijeva dalje istraživanje [34,36]. Jedna studija Wei et al. otkrili su da BPIFB1 inhibira migraciju i invaziju nazofaringealnog karcinoma [37]. S obzirom na to, otkriveno je da mutacije koje se javljaju u BPIFB1 promovišu rizik od raka pluća, a njegova regulacija dovodi do loše prognoze kod pacijenata s karcinomom pluća [38,39]. Pored uloge FCGBP i BPIFB, pokazalo se da faktor komplementa B (CFB) i himerni tumor supresor 1 (CST1) imaju zaštitnu ulogu kod raka. Na primjer, objavljeno je da je visoka ekspresija CFB povezana s povećanim ukupnim preživljavanjem pacijenata i preživljavanjem bez bolesti kod pacijenata s karcinomom pluća [40]. Nadalje, sistem komplementa služi kao prva linija odbrane od patogena, služeći kao glavna komponenta i urođenog i stečenog imunološkog sistema [41]. Što se tiče CST1, različite studije su istakle njegova zanimljiva svojstva, kao što je sposobnost da potisne rast stanica, inducira apoptozu i njegovu otpornost na inaktivaciju onkogenim oblicima p53, što ga čini privlačnom, ali alternativnom terapijskom metom divljeg tipa p{ {74}}otporni humani tumori [42]. Pored povećane ekspresije FCGBP, BPIFB1, F5, CFB i CST1, naši podaci zanimljivo pokazuju dva ćelijsko povezana fenotipa ćelija A549 pod SMG-promjenom morfologije u agregate i ćelije u obliku gruda i značajno smanjenje proliferacije stopa nakon SMG. Ovo je paralelno sa nekim drugim studijama, gde su ćelije koje su bile izložene SMG pokazivale male nakupine ili višeslojne ćelijske agregate [43,44]. Ove morfološke razlike ogledaju se u pratećim dramatičnim funkcionalnim promjenama u ćelijskim procesima, čiji je dio EMT. EMT je obeležje metastatskog procesa, povezanog sa izbegavanjem imunološkog nadzora i invazijom na vaskulaturu, čime se omogućava ćelijama da se šire u sekundarne organe [19,22]. U principu, maligne epitelne ćelije prolaze kroz EMT mehanizam u primarnim fazama razvoja tumora, gde ove ćelije imaju tendenciju da ispolje mezenhimalna svojstva, pokazujući povećanu pokretljivost koja olakšava njihov beg iz primarne niše, dok se metastatske ćelije formiraju na sekundarnom bočnom displeju. manje dediferenciranih svojstava u poređenju sa odgovarajućim primarnim tumorima. Ovdje je MET (mezenhimski-epitelni) proces dio takve progresije formiranja metastatskog tumora. Međutim, to ne zanemaruje učešće EMT-a u različitim fazama progresije raka jer će ćelije raka na sekundarnim mjestima ili nastaviti rasti i proliferirati ili će biti u stanju mirovanja [45,46]. Takva višestruka koordinacija gena i pojava specifičnih migratornih markera koji regulišu metastatsku progresiju ćelija raka mogu rezultirati različitim ishodima nakon izlaganja SMG [47]. Na primjer, u uslovima mikrogravitacije, različite ćelije raka dojke su pokazale različite morfologije, ćelijsku adheziju i svojstva migracije nakon izlaganja mikrogravitaciji [5]. Treba napomenuti da je glavna karakteristika EMT-a gubitak molekula ćelijske adhezije, E-kadherina, što utiče na mirovanje integriteta ćelija. S druge strane, povećanje neuralnog kadherina, N-kadherina, dovodi do promjena stanične adhezije. Ovo je indukovano uglavnom transformišućim faktorom rasta (TGF-), koji aktivira pleiotropno eksprimirane faktore transkripcije, kao što su proteini puža, Twist i Zeb i drugi signalni putevi implementirani u metastatskim putevima [18,48,49]. Ovdje izvještavamo o poboljšanju epitelnog markera E-kadherina (CDH1) i smanjenju nivoa mRNA mezenhimalnog N-kadherina (CDH2), ključnih markera EMT-a [49]. To implicira da u kombinaciji s našim podacima o smanjenoj stopi proliferacije A549, stanice pokazuju manje metastatsko stanje. Zanimljivo je da je izmijenjena ekspresija ključnih EMT markera također bila praćena značajnom smanjenom regulacijom matriksne metaloproteinaze MMP-2, koja je glavna komponenta bazalne membrane koja normalno odvaja epitelni sloj od okolnog mezenhima, što dovodi do gubitak bazalne membrane [50]. Ovo je paralelno sa studijom Changa et al., gdje su izvijestili o svojim nalazima smanjenja metastatskog potencijala ćelija humanog adenokarcinoma pluća kroz promjenu ekspresije MMP2 [17]. Općenito, uloga MMP je dobro implicirana u progresiji maligniteta, uključujući metastaze, gdje je smanjena ekspresija MMP (MMP-2 i MMP-9) i enzimska aktivnost karakteristika manje metastatskog fenotipa [ 50–52]. Imajući značajnu ulogu EMT u metastazama, naši podaci naglašavaju značajnu korelaciju FCGBP, BPIFB, F5, CST1 i CFB sa EMT genskim markerima, kao i genima MMP2 i MMP9 povezanim sa ćelijskom migracijom. Zanimljivo, Xiong et al. su pokazali da je FCGBP glavni regulator EMT u žučnoj kesi [53]. Ovo znači da identificirani geni mogu poslužiti kao potencijalni biomarkeri za buduća istraživanja koja mogu predvidjeti i dalje razumjeti progresiju raka pluća. Zajedno, naši nalazi klasifikuju identificirane gene kao ključne regulatore EMT-a, promovišući potencijalno poboljšanje manje metastatskog fenotipa putem mezenhimalne u epitelnu tranziciju (MET) stanica raka pluća.
4. Materijali i metode
4.1. Skupovi podataka za identifikaciju zajedničkih diferencijalno izraženih gena (DEG) u ćelijskim linijama raka pluća izloženim simuliranoj mikrogravitaciji
Relevantni skupovi podataka iz javno dostupne baze podataka Gene Expression Omnibus (GEO) su ekstrahovani za početnu analizu. Ova baza podataka se koristi kao javno dostupna funkcionalna genomička analiza podataka o ekspresiji gena visoke propusnosti i mikronizovima. Odabrani skupovi podataka ispunjavali su sljedeće kriterije: skupovi podataka koji koriste samo ćelijske linije raka pluća kod ljudi, studije koje uključuju podudarne kontrolne uvjete gravitacije u zemlji (GG), skupove podataka s definiranom klasifikacijom ćelijskih linija raka pluća i skupove podataka sa ekspresijom gena ćelija raka pluća kod ljudi koristeći mikromrežu. Dva skupa podataka odgovaraju ovom kriteriju, GSE78210 i GSE36931. Ukupno, 25 uzoraka je uključeno u studije, a 14 uzoraka ćelijske linije raka pluća u simuliranoj mikrogravitaciji (SMG) upoređeno je sa 11 GG kontrola, kao što je prikazano u Tabeli 2 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/; pristupljeno 11. novembra 2021.).
Tabela 2. Detalji skupova podataka ekstrahiranih iz Omnibusa genske ekspresije (GEO) koji se koristi za početnu identifikaciju DEG između simulirane mikrogravitacije (SMG) i prizemne gravitacije (GG) ćelija raka pluća.
4.2. Analiza obogaćivanja skupa gena GEO2R za generiranje DEG u svakoj bazi podataka
GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r; pristupljeno 11. novembra 2021), interaktivni online alat koji se koristi za poređenje GEO serija, korišten je u svakom skupu podataka za grupisanje i identifikuju pojačano i niže regulisane gene u SMG uslovima u poređenju sa GG uslovima. Geni sa p-vrednostima manjim od 0,05 i promenom puta većom od 2 odabrani su kao različito eksprimirani geni DEG u uslovima SMG. Posljedično, DEG-ovi svakog skupa podataka su se ukrštali jedan s drugim, a zajednički geni su identificirani
4.3. Kvantifikacija kliničko-patološke uključenosti identificiranih gena
Zatim su dobijeni geni koji su ušli u uži izbor potvrđeni korištenjem Kaplan–Meier Plottera (http://www.kmplot.com/; pristupljeno 11. novembra 2021.), internetske javne baze podataka koja procjenjuje učinak odabranih gena na kliničke ishode pacijenata. Ukupno preživljavanje (OS) definirano je kao trajanje od trenutka postavljanja dijagnoze (u mjesecima) do smrti. Podaci o ekspresiji gena i informacije o preživljavanju izvedeni su iz Omnibusa genske ekspresije (GEO), Atlasa genoma raka (TCGA) i Evropskog atlasa genoma-fenoma (EGA). Pacijenti su kategorizirani u dvije grupe: (1) visoka ekspresija (sa vrijednostima TPM iznad gornjeg kvartila) i (2) niska/srednja ekspresija (sa vrijednostima TPM ispod gornjeg kvartila). Kaplan–Meier dijagrami su korišćeni za poređenje OS pacijenata sa adenokarcinomom pluća (LUAD) sa visokom/srednjom ekspresijom gena kandidata.
4.4. Obogaćena ontološka grupisanja za identificirane gene
Da bi se istražilo da li identificirani geni dijele zajedničke puteve, izvršena je analiza obogaćivanja puteva genske ontologije (GO) za identificirane gene pomoću web alata Metascape (https://metascape.org/; pristupljeno 11. novembra 2021.) za sveobuhvatnu napomenu na listi gena i resurs za analizu uz GEO2R
4.5. Ćelijska linija i ćelijska kultura
Ćelijska linija alveolarnog bazalnog epitela (A549) humanog adenokarcinoma, koja se naširoko koristi kao model za adenokarcinom pluća, uzgajana je u medijumu Roswell Park Memorijalnog instituta (RPMI)-1640 sa dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS; Sigma, St. Louis, MO, SAD) i 100 jedinica/mL penicilina/streptomicina (P/S; Sigma, St. Louis, MO, SAD). Ćelijska linija je uzgajana u vlažnom inkubatoru na 37 ◦C u atmosferi od 5% CO2. Kada su ćelije došle do konfluencije, sakupljene su upotrebom 0,5% tripsina, centrifugirane na 100 × g 5 minuta i korištene po potrebi.
4.6. Mikrogravitacija
Ćelije raka pluća (A549) uzgajane su u 2D klinostat sistemu koji oponaša okruženje gotovo nulte gravitacije (mikrogravitacija). Ovaj Rotary Culture Max (RCMW™; Synthecon® Inc—Hjuston, Teksas, SAD) je bioreaktor opremljen posudom za ćelijsku kulturu koja uključuje mikroporozno perfuzijsko jezgro i sistem oksigenatora, koji obezbeđuje hranljive materije i eksterno gasiranje medija, stoga osigurava pravilnu izmjenu plinova i okruženje za kulturu ćelija sa niskim smicanjem. Komora je bila napunjena podlogom za kulturu koja je sadržavala ćelije. Ova komora se horizontalno rotira oko jedne ose okomite na silu gravitacije brzinom od 10 o/min. 2D klinostat je postavljen u vlažni inkubator na 37 ◦C u atmosferi od 5% CO2. A549 ćelije su sakupljene nakon simulirane mikrogravitacije (SMG) u 24, 48 i 72 h. Da bi se stvorilo uporedivo okruženje za rak pluća, A549 ćelije su uzgajane u pločama za kulturu u GG, u nerotiranom ili statičkom stanju, i držane su u blizini uređaja unutar vlažnog inkubatora (37 ◦C). Ove ćelije se nazivaju kontrolnom grupom i takođe su sakupljene 24, 48 i 72 h.
4.7. Test vitalnosti ćelija
Za GG uslove, A549 ćelije su posađene u 24-ploče sa ćelijskom kulturom u gustini od 3.0 × 104 ćelije po 500 µL. Ćelije su sakupljene tripsinizacijom 24, 48 i 72 h nakon zasijavanja, zatim centrifugirane na 200 × g 5 minuta. Dobijene ćelijske pelete su rekonstituirane u mediju za kulturu. Za SMG uslove, A549 ćelije su zasejane u 2D klinostat rotirajući sistem pri gustini od 6,0 × 104 ćelije po 1 mL. Ćelije su sakupljene 24, 48 i 72 h nakon izlaganja SMG, a zatim centrifugirane na 200 × g 5 minuta. Dobijene ćelijske pelete su rekonstituirane u mediju za kulturu. Urađen je test isključenja boje Trypan blue (Sigma, SAD). Broj ćelija je određen korišćenjem automatizovanog brojača ćelija CellDrop™.
4.8. Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (qRT-PCR)
Nivoi ekspresije gena (nivoi mRNA) in silico identificiranih gena (AZGP1, CFB, NOX1, VTCN1, AGR3, GDA, TCN1, CST1, F5, CEACAM6, BPIFB1, FCGBP i BPIFA1) zajedno sa EMT genskim markerima (Tabela 3) su također određene u A549 ćelijama pomoću qRT-PCR. Ukratko, ekstrakcija ukupne RNK iz ćelija izvedena je pomoću RNEasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Njemačka) u 24, 48 i 72 h na GG i nakon izlaganja SMG-u prema protokolima proizvođača. Jedan µg ukupne RNK je reverzno transkribovan u jednolančanu komplementarnu DNK (cDNK) u reakcionoj zapremini od 20 µL koristeći iScript™ komplet za sintezu cDNA (Thermo, Waltham, MA, SAD). qRT-PCR je izveden pomoću PowerUp™ Sybr™ Green master mixa (Thermo, SAD) u Quant Studio 5 pcr mašini (Thermo, SAD). Koraci PCR amplifikacije bili su sljedeći: početni korak denaturacije na 95 ◦C tokom 3 min, temperatura žarenja ciljnog gena 30 s, a zatim 72 ◦C tokom 30 s. Vrijednost ciklusa praga fluorescencije dobivena je za svaki gen. ∆∆Metoda Cq je korištena za izračunavanje relativne promjene puta u ekspresiji gena nakon normalizacije na gen za održavanje, Gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH).
Tabela 3. Lista ljudskih prajmera. NOX1, NADPH oksidaza 1; GDA, guanin deaminaza; TCN1, Transcobalamin 1; FCGBP, Fc Gamma Binding Protein; BPIFA1, BPI Fold koji sadrži član porodice A 1; AZGP1, alfa{8}}glikoprotein 1; CFB, faktor B; VTCN1, V-set domena koja sadrži inhibitor aktivacije T ćelija 1; AGR3, prednji gradijent 3; CTS1, himerni tumor supresor 1; F5, faktor koagulacije V; CEACAM6, CEA ćelijski adhezioni molekul 6; BPIFB1, BPI preklop koji sadrži član porodice B 1; ZO-1, Zonula zatvara protein 1; MMP-9, Matrix metaloproteinase 9; MMP-2, Matrix metaloproteinase 2; i GAPDH, gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza
4.9. Analiza interakcije gena
Podaci iz in vitro qRT-PCR implementirani su u analizu interakcije gen-gen koristeći in silico web alat GeneMANIA (http://genemania.org/; pristupljeno 11. novembra 2021.), mrežni algoritam za predviđanje funkcija gena koristeći veliki skup podaci o funkcionalnoj asocijaciji. Ovo je provedeno kako bi se dalje procijenile interakcije između/među odabranim genima kandidata; FCGBP, CST1, F5, CFB i BPIFB1 sa EMT genima; CDH1, CDH2, TJP1, CTNNB1 i SNAI1, kao i geni koji se odnose na ćelijsku migraciju, MMP2 i MMP9.
4.10. Statistička analiza
Za statističku analizu korišten je softver GraphPad Prism. Rezultati su izraženi kao pojedinačni podaci ili kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Studentov t-test je korišten za poređenje različitih grupa. Razlike između grupa procijenjene su jednosmjernom ANOVA varijansom (ANOVA). p-vrijednosti su određene i vrijednosti p < 0.05, p < 0.01, p < 0,001 (*, **, i ***, redom) smatra se značajnim. Svi eksperimenti su izvedeni u tri primjerka (n=3).
Reference
1. White, RJ; Averner, MJN Ljudi u svemiru. Nature 2001, 409, 1115–6828. [CrossRef]
2. Bradbury, P.; Wu, H.; Choi, JU; Rowan, AE; Zhang, H.; Poole, K.; Lauko, J.; Chou, J. Modeliranje uticaja mikrogravitacije na ćelijskom nivou: Implikacije za ljudske bolesti. Front. Cell Dev. Biol. 2020, 8, 96. [CrossRef] [PubMed]
3. Yuan, M.; Liu, H.; Zhou, S.; Zhou, X.; Huang, Y.-E.; Hou, F.; Jiang, W. Integrativna analiza regulatornog modula otkriva povezanost mikrogravitacije sa disfunkcijama višetjelesnih sistema i tumorigenezom. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7585. [CrossRef] [PubMed]
4. Crucian, BE; Chouker, A.; Simpson, RJ; Mehta, S.; Marshall, G.; Smith, SM; Zwart, SR; Heer, M.; Ponomarev, S.; Whitmire, A.; et al. Disregulacija imunološkog sistema tokom svemirskog leta: Potencijalne protumjere za misije istraživanja dubokog svemira. Front. Immunol. 2018, 9, 1437. [CrossRef] [PubMed]
5. Nassef, MZ; Melnik, D.; Kopp, S.; Sahana, J.; Infanger, M.; Lützenberg, R.; Relja, B.; Wehland, M.; Grimm, D.; Krüger, M. Ćelije raka dojke u mikrogravitaciji: Novi aspekti istraživanja raka. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 7345. [CrossRef]
6. Takamatsu, Y.; Koike, W.; Takenouchi, T.; Sugama, S.; Wei, J.; Waragai, M.; Sekiyama, K.; Hashimoto, M. Zaštita od neurodegenerativnih bolesti na Zemlji iu svemiru. NPJ Microgravity 2016, 2, 16013. [CrossRef]
7. Nassef, MZ; Kopp, S.; Wehland, M.; Melnik, D.; Sahana, J.; Krüger, M.; Corydon, TJ; Oltmann, H.; Schmitz, B.; Schütte, A. Prava mikrogravitacija utječe na citoskelet i fokalne adhezije u ljudskim stanicama raka dojke. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3156. [CrossRef]
8. Dietz, C.; Infanger, M.; Romswinkel, A.; Strube, F.; Kraus, A. Indukcija apoptoze i promjena adhezije stanica u ljudskim stanicama raka pluća pod simuliranom mikrogravitacijom. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3601. [CrossRef]
9. Ricci, G.; Cucina, A.; Proietti, S.; Dinicola, S.; Ferranti, F.; Cammarota, M.; Filippini, A.; Bizzarri, M.; Catizone, A. Mikrogravitacija inducira prolazni EMT u ljudskim keratinocitima ranom smanjenjem E-kadherina i remodeliranjem stanične adhezije. J. Appl. Sci. 2020, 11, 110. [CrossRef]
10. Ahn, CB; Lee, J.-H.; Han, DG; Kang, H.-W.; Lee, S.-H.; Lee, J.-I.; Sin, KH; Lee, JW Simulirana mikrogravitacija sa plutajućim okruženjem promoviše migraciju karcinoma pluća ne-malih ćelija. Sci. Rep. 2019, 9, 14553. [CrossRef] [PubMed]
11. Pisanu, ME; Noto, A.; De Vitis, C.; Masiello, MG; Coluccia, P.; Proietti, S.; Giovagnoli, MR; Ricci, A.; Giarnieri, E.; Cucina, A. Matične ćelije raka pluća gube svoje zadano stanje matične ćelije nakon izlaganja mikrogravitaciji. BioMed Res. Int. 2014, 2014, 470253. [CrossRef] [PubMed]
12. Infanger, M.; Kossmehl, P.; Shakibaei, M.; Bauer, J.; Kossmehl-Zorn, S.; Cogoli, A.; Curcio, F.; Oksche, A.; Wehland, M.; Kreutz, RJC; et al. Simulirano bestežinsko stanje mijenja proteine citoskeleta i ekstracelularnog matriksa u stanicama papilarnog karcinoma štitnjače. Cell Tissue Res. 2006, 324, 267–277. [CrossRef] [PubMed]
13. Chen, J.; Mikrogravitacija, L. Tumorske ćelije u mikrogravitaciji. U svemir: putovanje kako se ljudi prilagođavaju i žive u mikrogravitaciji; IntechOpen: London, UK, 2018; Tom 139, str. 259–268.
14. Grimm, D.; Schulz, H.; Krüger, M.; Cortés-Sánchez, JL; Egli, M.; Kraus, A.; Sahana, J.; Corydon, TJ; Hemmersbach, R.; Wise, PM Borba protiv raka mikrogravitacijom: Višećelijski sferoid kao model metastaze. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 3073. [CrossRef]
15. Schabath, MB; Cote, ML Napredak raka i prioriteti: Rak pluća. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 2019, 28, 1563–1579. [CrossRef] [PubMed]
16. Chung, JH; Ahn, CB; Sin, KH; Yi, E.; Sin, HS; Kim, H.-S.; Lee, SH Simulirani efekti mikrogravitacije na proliferaciju i migraciju ćelija raka pluća ne-malih ćelija. Aerosp. Med. Hum. Perform. 2017, 88, 82–89. [CrossRef]
17. Chang, D.; Xu, H.; Guo, Y.; Jiang, X.; Liu, Y.; Li, K.; Pan, C.; Yuan, M.; Wang, J.; Li, T.; et al. Simulirana mikrogravitacija mijenja metastatski potencijal stanične linije humanog adenokarcinoma pluća. Vitr. Cell. Dev. Biol. Anim. 2013, 49, 170–177. [CrossRef]
18. Hanahan, D.; Weinberg, R. Obilježja raka: sljedeća generacija. Cell 2011, 144, 646–674. [CrossRef]
19. Ribatti, D.; Tamma, R.; Annese, T. Epitelno-mezenhimalna tranzicija kod raka: istorijski pregled. Transl. Oncol. 2020, 13, 100773. [CrossRef]
20. Shi, S.; Li, Q.; Cao, Q.; Diao, Y.; Zhang, Y.; Yue, L.; Wei, L. EMT transkripcijski faktori su uključeni u izmijenjenu ćelijsku adheziju pod simuliranim efektom mikrogravitacije ili preopterećenja regulacijom E-kadherina. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 1349. [CrossRef]
21. Topal, U.; Zamur, C. Mikrogravitacija, matične ćelije i rak: Nova nada za liječenje raka. Stem Cells Int. 2021, 2021, 5566872. [CrossRef]
22. Ksiazkiewicz, M.; Markiewicz, A.; Zaczek, AJ Epitelno-mezenhimska tranzicija: znak u formiranju metastaza koji povezuje cirkulirajuće tumorske ćelije i matične ćelije raka. Pathobiology 2012, 79, 195–208. [CrossRef] [PubMed]
23. Yan, T.; Tian, D.; Chen, J.; Tan, Y.; Cheng, Y.; Ye, L.; Deng, G.; Liu, B.; Yuan, F.; Zhang, S. FCGBP je prognostički biomarker i povezan je sa imunološkom infiltracijom u gliomu. Front. Oncol. 2021, 11, 769033. [CrossRef] [PubMed]
