Sidt2 je ključni protein u putu autofagije-lizosomske degradacije i neophodan je za održavanje strukture bubrega i funkcije filtriranja
Nov 07, 2023
Regulacija i homeostaza autofagije su od suštinskog značaja za održavanje morfologije i funkcije organa. Kao protein lizozomske membrane, efekatSidt2onstruktura bubregaibubrežna autofagijaje još uvijek nepoznato. U ovoj studiji smo otkrili da bubrezi odSidt2−/−miševi su pokazali promjene u zadebljanju bazalne membrane, fuziji procesa stopala i oticanju mitohondrija, što sugerira daoštećena je struktura bubrega. Povećani proteini u urinu nakon 24 h ukazuju na to da jefunkciju bubregatakođe je oštećen. Istovremeno, odsustvoSidt2uzrokovao je smanjenje broja kiselih lizosoma, smanjenje aktivnosti kisele hidrolaze i ekspresije u lizosomu, te povećanje pH u lizozomu, što sugerira da je funkcija lizosoma poremećena nakonSidt2brisanje. Akumulacija autofagolizosoma, povećani nivoi LC3-II i P62 proteina i smanjeni nivoi mRNA P62 ukazuju na to da je odsustvoSidt2gen izazvao abnormalni put autofagijeflow. Eksperiment s hlorokinom, imunoflautofagosom uorescencije, test fuzije lizosoma i Ad-mcherry-GFP-LC3B dalje su ukazali da, nakonSidt2delecijom, proizvodnja autofagosoma se nije povećala, ali je fuzija autofagosoma i lizosoma i degradacija autofagolizosoma bila poremećena. Prilikom inkubacijeSidt2−/−stanicama s aktivatorom autofagije rapamicinom, otkrili smo da može aktivirati autofagiju, koja se manifestira povećanjem autofagosoma, ali ne može poboljšati degradaciju autofagolizosoma. U međuvremenu, to je dalje ilustrovalo da jeSidt2gen igra važnu ulogu u nesmetanom napredovanju procesa autofagolizozoma. Ukratko, odsustvoSidt2gen je uzrokovao poremećenu funkciju lizosoma i smanjen broj kiselih lizosoma, što je dovelo do poremećaja formiranja i degradacije autofagolizosoma, što se na kraju manifestiralo kaoabnormalna struktura i funkcija bubrega. Sidt2Neophodan je za održavanje normalne funkcije lizosoma i fiziološke stabilnosti bubrega.
UVOD
Tradicionalno gledište je da su lizosomi deponije ćelija za uklanjanje otpada koje proizvode ćelije [1–3]. Međutim, mnoge studije su pokazale da je uloga lizosoma daleko složenija i može uključivati transdukciju ćelijskog signala, tumorigenezu, razvoj i druge aspekte koji utiču na životne aktivnosti tijela [4-10]. Lizozomi su obično obogaćeni tkivima kao što su jetra i bubrezi [11]. Stoga je lizosomalna disfunkcija također usko povezana s tkivnim bolestima jetre i bubrega, kao što su Gaucherova bolest [12], mukopolisaharidoza [13], Niemann-Pickova bolest [14], odgođena glomeruloskleroza [15], idiopatska membranska nefropata [16] itd. Lizosomalni membranski proteini (LMP) su komponente membrane čija funkcija nije samo održavanje integriteta lizosoma, već su također uključeni u različite aspekte kao što su transdukcija unutarćelijskog signala i regulacija koji su neophodni za održavanje funkcije lizosoma i životne aktivnosti ćelije [17–19].
Do danas je otkriveno više od 100 LMP-ova, ali funkcije većine njih su još uvijek nepoznate [20]. Transmembrane 7 superfamily member 1 (TM7SF1) je neophodan za održavanje funkcije bubrežnih podocita [21] i igra važnu ulogu u procesu razvoja bubrega [22]. Kanal 5 (ClC-5) sa hloridnim naponom (ClC-5) je kanal hloridnog jona (Cl(−)) izražen u bubrežnim tubulima, koji je neophodan za normalnu funkciju bubrežnih tubula [23]; kada je mutirana, može izazvati Dentovu bolest [24]. Prekomjerna ekspresija hloridnog kanala 7 (ClC-7) sprječava apoptozu bubrežnih tubularnih epitelnih stanica uzrokovanu poremećenim redoks stanjem [25]. Ove studije pokazuju da su LMP, kao komponente bubrežnog tkiva obogaćenog lizozomima, neophodni za održavanje normalne funkcije, ali je specifičan mehanizam njihove povezane patogenosti još uvijek nejasan.
SID1 transmembranska porodica, član 2 (Sidt2) je novootkriveni LMP koji je visoko eksprimiran u tkivima jetre i bubrega [26]. Prethodne studije su pokazale da delecija Sidt2 može uzrokovati bolesti povezane s jetrom, koje se manifestiraju kao steatoza jetre i poremećaji metabolizma lipida u jetri [11, 18]. U nedavnoj studiji otkrili smo da su bubrezi Sidt2−/− miševa takođe oštećeni, ali je specifičan mehanizam nejasan. Lizozomi su važne izvršne organele za autofagiju [10]. Da li je uključena regulacija autofagije? U ovoj studiji smo ispitali korelaciju između lizosomske funkcije (autofagije) i bolesti i istražili osnovni mehanizam koji uključuje Sidt2 koji uzrokuje oštećenje bubrega, što će biti od velike pomoći za proučavanje korelacije između LMP i bolesti.
REZULTATI
Sidt2−/− model to pokazujeoštećenje bubregaje povezan sa akumulacijom autofagolizosoma
Metoda konstruisanja Sidt2−/− miševa prikazana je na slici 1A. Dobijena homozigotna DNK repa miša je sekvencionirana i rezultat sekvenciranja je bio unimodalni (slika 1B), a gubitak fragmenta od 199 bp dogodio se u drugom egzonu. Putem PCR identifikacije genotipa, otkrili smo da su Sidt2+/+(Divlji tip, WT) miševi imali 685 bp DNK segmenata, dok su Sidt2−/− miševi imali 486 bp (slika 1C). Kao što je prikazano na slici 1D, Sidt2 protein se teško mogao detektovati kod Sidt2−/− miševa nego kod WT, što sugeriše da je model uspešno konstruisan. Testom urina ustanovljeno je da je 24-časovni protein u urinu značajno povećan kod Sidt2−/− miševa u poređenju sa WT (Slika 1E), što sugeriše da je barijera za filtriranje bubrega smanjena nakon što je Sidt2 obrisan. Posmatranja transmisijskom elektronskom mikroskopijom (slika 1F) pokazala su da, u poređenju sa WT miševima (a–f), bubrezi Sidt2−/− miša pokazuju difuznu fuziju procesa stopala, zadebljanje bazalne membrane glomerula (g, h), bubrežni tubularni epitel ćelijski edem, oštećenje mikroresica (i, j), mitohondrijski edem, promjene nalik na vakuole i nestanak bodlji (k, l). Zanimljivo je da su Sidt2−/− miševi takođe pokazali veliki broj akumulacija autofagolizozoma (prikazanih crvenim strelicama, m, n), a taj broj je bio značajno veći nego kod kontrole (Slika 1G). Na ćelijskom nivou, otkrili smo da je Sidt2 takođe bitan za opstanak ćelija bubrega. Brisanje gena Sidt2 uzrokuje smanjenu proliferaciju i povećanu apoptozu MPC5 i SV40 MES 13 ćelija (dopunska slika 1).
Brisanje gena Sidt2 dovodi do promjena u broju i funkciji kiselih lizosoma u stanicama bubrega miša
Crispr-Cas9 tehnologija je korištena za nokautiranje Sidt2 gena u MPC5 i SV40 MES 13 ćelijama kako bi se dobili ćelijski modeli. Verifikacije nivoa mRNA i proteina (sl. 2A–C) izvedene su qRT PCR-om i western blotingom, što pokazuje da su modeli uspešno konstruisani. Sistem degradacije posredovan lizozomima je ključni korak u degradaciji autofagije. Kao nezamjenjiv LMP, da li će nokaut Sidt2 utjecati na ekspresiju proteina povezanih s lizozomima? Izmjerili smo glavni LMP membranski protein 1 (LAMP1) povezan s lizozomima. Rezultati su pokazali da se ekspresija LAMP1 smanjila nakon delecije Sidt2 u ćelijama MPC5 i SV40 MES 13 (slika 2D, E). Dalje smo koristili LysoTracker za označavanje kiselih lizosoma i otkrili da se broj kiselih lizosoma smanjio nakon delecije Sidt2 u oba tipa ćelija (Slika 2F, G). Nakon toga, izmjerili smo lizosomalni katepsin B (CTSB) i otkrili da se u tkivu bubrega miša (sl. 2H, I), MPC5 ćelijama (sl. 2J, K) i SV40 MES 13 ćelijama (sl. 2L, M), ekspresije CTSB u Sidt2−/− modelima su svi smanjeni, što ukazuje da je aktivnost proteolitičkih enzima u lizosomima smanjena kada je gen Sidt2 obrisan. Slično, ekspresija prekursora CTSB u dva tipa ćelija grupe Sidt2−/− je značajno smanjena, što ukazuje da je CTSB takođe bio pogođen nakon delecije Sidt2. Dalje smo koristili LysoSensor za detekciju kiselog okruženja lizosoma. Što je niži omjer intenziteta fluorescencije, to je viša pH vrijednost u lizozomu. Rezultati su pokazali da se nakon brisanja Sidt2 pH vrijednost povećala (slika 2N, O) i da je acidifikacija bila abnormalna. Da bismo dalje istražili da li su gornje lizosomske abnormalnosti uzrokovane abnormalnim brojem lizosoma ili abnormalnim funkcijama lizosoma, istražili smo stanice elektronskim mikroskopom (slika 2P). Otkrili smo da nema očiglednih promjena u broju primarnih lizosoma i ukupnom broju lizosoma (uključujući primarne i sekundarne lizozome) nakon Sidt2 delecije (slika 2Q).
Put autofagije bubrega je abnormalan nakon uklanjanja Sidt2
Kao što je gore spomenuto, veliki broj akumulacija autofagolizozoma je uočen u ćelijama bubrega Sidt2−/− miševa, što sugerira da je put autofagije bio abnormalan. Uz pomoć Western blot analize, pokazano je da je došlo do značajnog povećanja nivoa proteina LC3-fosfatidiletanolamin konjugata (LC3-II) i sekvestosoma 1(P62) u bubregu Sidt2−/− miševa, i povećanje ekspresije proteina povezanih sa autofagijom 5 (Atg5), autofagijom 7 (Atg7) i autofagijom 12 (Atg12) (Slika 3A, B). Međutim, nivo P62 mRNA je značajno smanjen (slika 3C), što ukazuje na to da je put autofagije bio abnormalan nakon eliminacije Sidt2 in vivo. Zatim smo otkrili da je ekspresija proteina autofagije LC3-II, P62, Atg5, Atg7 i Atg12 takođe povećana (Slika 3D–G) u dva tipa ćelija bubrega nakon delecije Sidt2, što je bilo konzistentno sa in vivo. Povećanje LC3-II ukazuje na povećanje autofagosoma u ćelijama bubrega nakon delecije Sidt2, što može biti uzrokovano aktivacijom autofagije ili blokiranom degradacijom autofagosoma. Imunofluorescencija P62 (slika 3H) jasno je pokazala povećanje sadržaja P62 u Sidt2−/− ćelijama (slika 3I). Za razliku od nivoa proteina, qRT-PCR je pokazao da se P62 značajno smanjio na nivou mRNA (slika 3J), što ukazuje da je povećanje P62 povezano sa nedovoljnom degradacijom. Povećanje Atg5, Atg7 i Atg12 ukazuje na to da je autofagija započela i formirala se normalno, ali akumulacija P62 također je sugerirala prepreke u procesu autofagije, a ova kontradikcija nas je zahtijevala da dalje istražimo pravu situaciju toka autofagije.
In vitro, primjena hlorokina ukazuje na smanjen tok autofagije nakon gubitka Sidt2. Eksperiment s hlorokinom je jedan od klasičnih eksperimenata za posmatranje toka autofagije. Da bismo razumjeli razloge povećanja LC3-II i P62 nakon delecije Sidt2, koristili smo hlorokin (CQ), nizvodni inhibitor autofagije, da djelujemo na ćelije kako bismo promatrali tok autofagije. Prvo smo koristili različite gradijente koncentracije da potvrdimo da je koncentracija zasićenja inhibirana CQ bila 50 μM (sl. 4A-F) u MPC5 i SV40 MES 13 ćelijama. Povrh ove koncentracije, kada je koncentracija CQ nastavila da raste, LC3-II i P62 se nisu dalje povećavali da bi dostigli zasićenje. Stoga smo koristili 50 μM CQ stimulaciju tokom 16 h da potpuno inhibiraju tok autofagije, a u ovom trenutku, LC3-II razlike između Sidt2+/+ grupe i Sidt2−/− grupe su nestale u MPC5 i SV40 MES 13 ćelija. Slično, nakon 50 μM CQ obrade, P62 razlike uzrokovane brisanjem Sidt2 također su nestale (sl. 4G, H, J, K). Statistički podaci o fluksu autofagije su pokazali da se on smanjio kada je nedostajao Sidt2 (sl. 4I, L), što je dalje potvrdilo da je povećanje ekspresije LC3-II i P62 nakon delecije Sidt2 uzrokovano neuspjehom čišćenja autofagije nego povećanje nivoa autofagije (aktivacija autofagije).
Poremećaj fuzije autofagosoma-lizosoma in vitro nakon delecije Sidt2 Čišćenje i degradacija su srednja i kasna faza u procesu autofagije, uključujući fuziju autofagosoma sa smanjenim nakon delecije Sidt2 (slika 5D), što ukazuje da je fuzija autofagozomi i lizozomi su oštećeni.
Slika 1Oštećenje bubregai akumulacija autofagolizozoma kod Sidt2−/− miševa. Shema ciljanja gena Cre-LoxP sistema; B iznad je izvezeni dijagram sekvence DNK mišjeg repa nokautnog gena Sidt2; ispod je mapa sekvenciranja, strelica koja označava lokaciju gena koji nedostaje. U poređenju sa WT miševima, gubitak gena od 199 bp javlja se u eksonu 2; C Verifikacija nivoa DNK Sidt2 (izvučena iz repnog tkiva). Prajmer amplificirani proizvod sadrži bazni nokaut region, prikazan kao Sidt2+ /+(WT), Sidt2+/− ili Sidt2−/−; D verifikacija nivoa proteina za otkrivanje nivoa ekspresije Sidt2 proteina Western blot-om; E bubrega 24 h proteina u urinu kod WT i Sidt2−/− miševa; F ultramikromorfološka struktura bubrega WT miševa (a, f) i Sidt2−/− miševa (g–n). U poređenju sa WT mišem, Sidt2−/− mišji bubreg pokazuje fuziju procesa stopala, zadebljanje bazalne membrane (g, h), edem bubrežnih tubularnih epitelnih ćelija, oštećenje mikroresica (i, j), destrukciju mitohondrija (k, l) i akumulacija autofagolizozoma (m, n); G ukupan broj bubrežnih autofagolizosoma u WT i Sidt2−/− miševima. *P < 0.05, **P < 0.01.
Slika 3. Brisanje Sidt2 remeti put autofagije. Detekcija nivoa ekspresije proteina vezanih za WT i Sidt2−/− ćeliju pomoću Western blota; B statistički grafikoni rezultata Western blot testa; C P62 nivo ekspresije mRNA u tkivima bubrega WT i Sidt2−/− miševa; D nivoi ekspresije proteina puteva autofagije MPC5 ćelije pre i posle nokauta Sidt2; E statistički grafikon (D) grafikona; F nivoi ekspresije proteina puteva autofagije u SV40 MES 13 ćelijama prije i poslije nokauta Sidt2; G statistički grafikon (F) grafikona; H P62 imunofluorescencija u MPC5 i SV40 MES 13 ćelijama prije i poslije nokauta Sidt2; I statistički grafikoni rezultata imunofluorescencije; J P62 nivoi ekspresije mRNA u MPC5 i SV40 MES 13 ćelijama prije i poslije nokauta Sidt2. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.
Ad-mCherry-GFP-
Dvostruko označavanje LC3B fluorescencije sugerira da su formiranje autofagolizosoma i njegov put degradacije blokirani nakon delecije Sidt2. Eksperiment transfekcije Ad-mCherry-GFP-LC3B može se koristiti za otkrivanje promjena u dinamičkom protoku autofagije unutar ćelija. Tokom procesa autofagije, mCherry-GFP-LC3B se skuplja na membrani autofagosoma i manifestuje se u obliku žutih mrlja pod fluorescentnim mikroskopom. Kada se autofagozomi i lizozomi spoje u autofagolizozome, kisela sredina unutar lizozoma će ugasiti fluorescenciju GFP-a tako da se manifestira u obliku crvenih mrlja. Stoga, GFP vezan za LC3 može se koristiti samo za otkrivanje autofagozoma, dok mCherry može detektirati autofagozome i autofagolizozome u isto vrijeme. Kada se zelena i crvena fluorescentna mrlja kombinuju i prikažu kao žute fluorescentne mrlje, to odgovara autofagosomima. U ovom trenutku, crvena fluorescencija može ukazivati na autofagolizozome, a može ukazivati i na glatkoću formiranja autofagolizosoma [27]. MPC5 ćelije i ćelije SV40 MES 13 u grupama Sidt2+/+ i Sidt2−/− transficirane su Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirusom i fotografirane konfokalnim laserskim mikroskopom (slika 6A). Utvrđeno je da se broj žutih fluorescentnih tačaka povećao, a broj crvenih fluorescentnih tačaka smanjio (slika 6B, C) nakon delecije Sidt2, što je pokazalo da se broj autofagosoma povećao, a autofagolizozomi smanjili u grupi Sidt2−/−. To je zato što su postojale prepreke za formiranje autofagolizosoma, a putevi degradacije autofagolizosoma su bili blokirani, što je dovelo do prepreka degradaciji autofagolizosoma.
Rapamicin nije poboljšao akumulaciju P62 uzrokovanu delecijom Sidt2, već je pogoršao. Rapamicin (RAPA) je inhibitor mTOR i aktivira autofagiju. Kada je RAPA djelovao na MPC5 i SV40 MES 13 ćelije grupe Sidt2+/+ i Sidt2−/−, povećao je količine LC3-II u obje grupe. To je značilo da RAPA može aktivirati uzvodni put autofagije. Slično, otkrili smo da je povećanje nivoa LC3-II u grupi Sidt2−/− sa RAPA bilo očiglednije nego u kontrolnoj (Sidt2+/+grupa), što pokazuje da kada je RAPA djelovala na grupi Sidt2−/−, degradacija autofagosoma još uvek nije poboljšana. U međuvremenu, također smo primijetili promjene u P62 i otkrili da kada je RAPA djelovao na Sidt2+/+ grupu MPC5 i SV40 MES 13 ćelija, P62 se nije značajno promijenio, što ukazuje da je tok autofagije bio normalan. Kada je RAPA djelovao na grupu Sidt2−/−, nivo ekspresije P62 je dodatno povećan u poređenju sa onim prije primjene i također je bio očigledniji od onog u kontroli nakon tretmana RAPA (Slika 7A, B, D, E). Nakon toga, kako bismo istražili razloge nedosljedne ekspresije P62 proteina nakon što su Sidt2+/+ i Sidt2−/− grupa tretirane RAPA-om, izmjerili smo nivoe mRNA P62 i otkrili da se nivo povećao. nakon RAPA tretmana u grupama Sidt2+/+ i Sidt2−/−, i grupa Sidt2+/+ imale su viši nivo od onog u grupi Sidt2−/− (slika 7C , F), što bi dodatno moglo dokazati da je tok autofagije bio nesmetan u grupi Sidt2+/+, dok se poremećaj toka autofagije dogodio na kraju autofagije u grupi Sidt2−/−, odnosno degradacija autofagolizosoma veza. Također smo proučavali učinak Sidt2 na proliferaciju i apoptozu bubrežnih stanica pod uvjetom aktivirane autofagije i otkrili da nakon aktivacije autofagije inducirane bez seruma medija, u poređenju sa kontrolnom grupom, proliferacija Sidt2−/− grupa je dodatno inhibirana, a apoptoza je bila očiglednija (dopunska slika 2).
Slika 5 Fuzija autofagosoma i lizosoma je spriječena nakon delecije Sidt2. Kolokalizacija imunofluorescencije LC3B i LAMP1 u MPC5 i SV40 MES 13 ćelijama prije i poslije nokauta Sidt2, analiza sa Pearsonovim koeficijentom korelacije; B poređenje LC3B fluorescentnih tačaka prije i poslije Sidt2 nokauta u MPC5 i SV40 MES 13 ćelijama; C poređenje Pearsonovog koeficijenta korelacije prije i poslije Sidt2 nokauta u MPC5 i SV40 MES 13 ćelijama; D poređenje brzine fuzije prije i nakon nokauta Sidt2 u MPC5 i SV40 MES 13 ćelijama (odnos broja ko-lokaliziranih fluorescentnih mrlja LAMP1 i LC3B prema broju fluorescentnih mrlja LAMP1); *P < 0,05, **P < 0,01.
Wecistanche usluga podrške - najveći izvoznik cistanchea u Kini:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel:+86 15292862950
Kupite za više detalja o specifikacijama:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
