Ponovno povezivanje metabolizma glukoze i lipida induciranog G-proteinskim spojenim receptorom 17 Utišavanje omogućava tranziciju oligodendrocitnih progenitora u mijelinizirajuće stanice Ⅱ
Jul 13, 2023
3. Rezultati
3.1. Utišavanje GPR17 u diferenciranju OPC-a značajno je promijenilo ekspresiju gena uključenih u metabolizam lipida i glukoze
Da bismo istakli biološke procese na koje značajno utiče ekspresija GPR17 tokom diferencijacije OL-a, interferirali smo u njegovu ekspresiju transfekcijom OPC pacova sa SMART-pool siRNA specifičnim za GPR17 štakora. Nakon što smo potvrdili uspješno obaranje GPR17 pomoću qRT-PCR-a (slika S1), izvršili smo analizu mikromreža 30.584 transkripta pacova u GPR17-utišanim u odnosu na kontrolni OPC i analizirali različito eksprimirane gene (DEG) pomoću različitih bioinformatičkih alata. Prvo, 640 DEG je proučavao Meta-Core, kako bi se izvršila analiza obogaćivanja puteva i identifikovali procesi za koje se predviđa da će biti značajno pogođeni. Ova analiza je sugerirala promjenu mTOR signalizacije, za koju se već pokazalo da je povezana s funkcijom GPR17 [37], i drugih procesa za koje se zna da su relevantni za sazrijevanje OPC-a, kao što su "remodeliranje citoskeleta" i„regulacija metabolizma lipida(Tabela 1).
plus
Kliknite ovdje da biste saznali Cistanche za rast kostiju
Tabela 1. Softver MetaCore je korišten za izvođenje analize obogaćivanja putanja na DEG nakon utišavanja GPR17. Tabela prikazuje najznačajnije puteve koji su rezultat analize, broj povezanih gena i uobičajenih gena uključenih u skup podataka
Zatim je alat Ingenuity pathway analysis (IPA) korišten za izvođenje analize podudaranja, koja automatski identificira kurirane IPA skupove podataka sa značajnim sličnostima i razlikama u poređenju sa skupom podataka upita. Ova analiza jača predviđenu vezu između ekspresije GPR17 i metabolizma lipida, pokazujući da su promjene ekspresije 38 gena u našem skupu podataka (Tablica S1) povezane s izmijenjenom sintezom masnih kiselina (Slika 1). Među njima, utišavanje GPR17 izazvalo je pojačanu regulaciju LXR (X receptor alfa jetre, NR1H3 na slici 2 i tabeli S1, nuklearni receptor koji reaguje na oksisterole) i SREBP1 (protein 1 koji vezuje regulatorni element sterola, SREBF1 na slici 1 i tabeli S1), dva ključni igrači u sintezi masnih kiselina i holesterola. U našem skupu podataka, također smo primijetili da je nekoliko izmijenjenih gena, uključujući PDH (piruvat dehidrogenaza), Ldha (laktat dehidrogenaza alfa) i Pdk1 (piruvat dehidrogenaza kinaza 1), povezani s metabolizmom glukoze i Krebsovim ciklusom, što ukazuje na potencijalnu uključenost GPR17 receptor u regulaciji ovih metaboličkih procesa. Prema ovome, analiza obogaćivanja zasnovana na ontologiji gena (ToppGene paket) na DEGs otkrila je promjenu "metaboličkog procesa monokarboksilne kiseline" (GO:{{20}}032787, p- vrijednost: 0,02), izvan drugih procesa koji se odnose na razvoj CNS-a i metabolizam ćelija, kao što su "regulacija razvoja nervnog sistema" (GO:0051960, p-vrijednost: 0,033) i "sfingolipidni metabolički procesi" (GO:0006665, p-vrijednost : 0,043) (Slika 2; kompletna lista u Tabeli S2).
Globalno, ove promjene sugeriraju da utišavanje GPR17 može djelovati kao okidač za obraćanje ćelija na mijelinizaciju, podešavanjem nekoliko gena uključenih u transkripcijsku regulaciju homeostaze lipida i glukoze, kao i u korištenju kolesterola i lipida za proizvodnju mijelina.
Slika 1. Alat za analizu puteva domišljatosti (IPA, Qiagen) korišten je za analizu skupa podataka i istraživanje bolesti i bioloških procesa za koje se predviđa da će se povećavati ili smanjivati na osnovu obrasca različito eksprimiranih gena u skupu podataka. Iz ove analize ekstrapolirali smo šemu na slici koja uključuje gene povezane sa sintezom lipida različito izražene u našem skupu podataka (p-vrijednost=9.67 × 10−4 ). Puni nazivi ovih gena, zajedno sa relativnom promjenom nabora (log2 omjer) prikazani su u Tabeli S1. U crvenim, povišenim genima; u zelenim genima sa smanjenom regulacijom
Slika 2. Toppgene paket je korišten za analizu obogaćivanja na DEG-ovima zasnovanu na GO. Slika prikazuje neke od značajnih bioloških procesa koji se odnose na centralni nervni sistem i ćelijski metabolizam koji su potencijalno izmijenjeni utišavanjem GPR17. Plave trake označavaju ukupne gene povezane sa svakim pojmom; crvene trake označavaju gene koji su zajednički sa našim skupom podataka za svaki termin. Kompletna lista bioloških procesa koji su rezultat ove analize i relativne p-vrijednosti prikazani su u Tabeli S2.
3.2. Metabolomska analiza tokom OPC diferencijacije in vitro
Da bismo procenili korelaciju između ekspresije GPR17 i aktivacije specifičnih metaboličkih puteva, izvršili smo metabolomsku analizu kultivisanih OPC tokom njihovog fiziološkog sazrevanja. OPC su održavani u mediju za diferencijaciju i zatim lizirani u četiri različite vremenske tačke (nakon 0, 1, 3 i 5 dana diferencijacije, DID), koje odgovaraju različitim fazama sazrijevanja OL-a. Paralelno, da bi se procijenilo da se u svim eksperimentima sazrijevanje dogodilo u očekivanom vremenu, OPC su kultivirani i obojeni na GPR17 i MBP. Rezultati su pokazali da je broj ćelija koje eksprimiraju GPR17- dostigao svoj maksimum na 3 DID, a zatim se vratio na bazalne nivoe na 5 DID, dok se broj MBP-pozitivnih ćelija progresivno povećavao tokom sazrijevanja (Slika 3a), u skladu sa prethodni rezultati [37]. OPC metabolomska evaluacija izvedena je tečnom hromatografijom-tandem masenom spektrometrijom (LC-MS/MS) kao što je prethodno opisano [38], fokusirajući se na energetske metabolite uključene u glikolizu, pentozofosfatni put, Krebsov ciklus, oksidaciju masnih kiselina, njihove kofaktore NADH, NAD plus, NADPH, NADP plus, ATP, ADP, AMP, aminokiseline i neki njihovi derivati. Metabolomski profili analiziranih četiri vremenske tačke prikazani su na slici 3b. Na dan 0, nivoi nekoliko metabolita koji pripadaju i/ili povezani sa Krebsovim ciklusom (npr. sukcinat, malat, alfa-ketoglutarat, glutamat, aspartat, alanin i prolin) bili su viši, kao što se i očekivalo od ćelija koje dolaze iz stanja visoke proliferacije (Slika 3c). U srednjim fazama (od DID 1 do 3), OPC su pokazali izraženu regulaciju molekula uključenih u sintezu masnih kiselina i holesterola. Shodno tome, uočili smo povećane nivoe acetil-CoA (slika 3c), koji predstavlja prekursor holesterola i masnih kiselina i malonil-CoA, specifičnog intermedijera u sintezi masnih kiselina. Na DID 5, uočili smo povećanje nivoa nekoliko acil-karnitina i aminokiselina paralelno sa značajnim povećanjem slobodne intracelularne glukoze (slika 3c). Također smo primijetili smanjenje nivoa AMP i ADP od dana 0 do DID 5 i prolazno povećanje ATP između DID 1 i DID 3. Ovi podaci ukazuju na to da od dana 0 do DID 3, što odgovara U vremenskom prozoru tokom kojeg GPR17 dostiže svoju maksimalnu ekspresiju, OPC su uglavnom koristili glukozu i aminokiseline za održavanje biosinteze holesterola i masnih kiselina. Na DID 5, kao što je naglašeno povećanim nivoima acil-karnitina, OPC se vjerovatno oslanjaju na iskorištavanje masnih kiselina. Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da tokom fiziološke diferencijacije OPC progresivno mijenjaju svoj energetski metabolizam kako bi postali zreli mijelinizirajući OL.
3.3. Metabolomska analiza nakon utišavanja GPR17 tokom sazrevanja OPC in vitro
Da bismo otkrili doprinos GPR17 receptora u pokretanju energetskih metaboličkih promjena koje se dešavaju tokom ćelijske diferencijacije, izvršili smo metabolomiku na GPR17- utišanim OPC-ovima, u poređenju sa kontrolnim OPC-ima koji primaju kodiranu RNK. Prvo smo ispitali uticaj utišavanja GPR17 na sazrevanje OPC imunofluorescentnim bojenjem za GPR17 i MBP. Kao što se očekivalo, nakon utišavanja receptora, pronašli smo smanjenje GPR17 bojenja, jasno vidljivo na 3 DID. Također smo primijetili značajno povećanje broja zrelih MBP-pozitivnih OL-a na 3 DID (nije prikazano) i 5 DID (Slika S2). Paralelno, detaljna qPCR analiza je izvršena u pet vremenskih tačaka (0, 1, 2, 3 i 5 dana u diferencijaciji, DID), otkrivajući, u kontrolnim OPC-ima, snažno povećanje ekspresije GPR17 nakon 1 DID, koji dostiže značajne nivoe počevši od 2 DID, progresivno povećanje ekspresije MBP do 5 DID i značajno smanjenje ranog markera NG2 (Slika 4a). Suprotno tome, nakon utišavanja GPR17 (Slika 4b), GPR17 mRNA je dostigla niže nivoe na DID1 i zatim ostala stabilno niska, ekspresija MBP se dalje povećala, a NG2 dalje opala. Direktno poređenje ekspresije NG2 i MBP u GPR17-utišanim u odnosu na kontrolni OPC u svakoj vremenskoj tački prikazano je na slici 4c. Uzeti zajedno, ovi rezultati sugeriraju da je, pod ovim eksperimentalnim uvjetima, utišavanje GPR17 u OPC-ima ubrzalo njihov proces diferencijacije. Zatim je OPC metabolomika izvedena pomoću LC-MS/MS u pet odabranih vremenskih tačaka. Poređenje metabolomskih podataka dobijenih od GPR17-utišanih i kontrolnih OPC-a u svakoj vremenskoj tački omogućilo nam je da identifikujemo metabolite na koje značajno utiče utišavanje GPR17
Slika 3. (a) Grafikon prikazuje promjene u procentu GPR17 plus i MBP plus ćelija tokom diferencijacije. n=3 po grupi; jednosmjerna ANOVA sa Tukeyjevim testom. * p < 0.05, ** p < 0.01) (b) Toplotna mapa pokazuje obilje metabolita u svakom pojedinačnom uzorku zaustavljenom na 0,1 , 3 ili 5 DID. Obilje analiziranih metabolita predstavljeno je hromatskom skalom u rasponu od tamnoplave (vrlo niska zastupljenost) do tamno smeđe (vrlo visoka zastupljenost). n=4–5 po grupi. (c) Metaboliti sa obiljem koji se značajno razlikuje među uslovima (0, 1, 3 i 5 dana u diferencijaciji, DID; jednosmjerna ANOVA sa Fisherovim LSD testom).
Na DID 1 (slika 5a) nismo pronašli značajne promjene. Na DID 2 (slika 5b), pronašli smo značajno povećanje nekih metabolita Krebsovog ciklusa (malat, fumarat citrat), skromno povećanje slobodnog karnitina (CO), acetil-karnitina (C2), propionil-karnitina (C3: 0), butiril-karnitin (C4:0), valeril-karnitin (C5:0), heksadekanoil-karnitin (C16:0i značajno smanjenje glukoze , laktat, kreatin i ornitin. Redukcija uljanog laktata i kreatina i povećanje propionil-karnitina (C3) također je uočeno na DID3 (slika 5c). Na DID 5 (slika 5d) još uvijek smo pronašli povećanje slobodnog karnitina ( CO), acetilkarnitin (C2), propionil-karnitin (C3:0), butiril-karnitin (C4:{{30}}), valeril-karnitin (C5:0 )tetradekanoil-karnitin (C14:0), heksadekanoil-karnitin (C16:0), oktadekanoil-karnitinC18:0), oktadecenoil-karnitin (C18:1), slično onome što je prvobitno uočeno u više diferenciranih ćelija (vidi sliku 3), povećanje dihidroksiaceton-3-fosfata/gliceraldehid3-fosfata (DHAP/GAP), fumarata i citrata, i smanjenje acetil-CoA, Met-SOkreatina, taurina i karnozin.
Slika 4. Učinak utišavanja GPR17 na sazrijevanje OPC-a. Nivoi ekspresije GPR17 (zeleno), NG2plavi) i MBP (crveni) procijenjeni su PCR-om u realnom vremenu tokom diferencijacije u kontrolnim uslovima (ćelije transficirane skramble RNA i nakon utišavanja GPR17 (b), i normalizirane u odnosu na ekspresiju na T{{ 6}} (postavljeno na 0). n=6 za svaku vremensku tačku. Jednosmjerna ANOVA sa Tukeyjevim testovima višestrukih poređenja (a): ** p < {{10} }.001 VS. DID 0-2-3-5, @ p < 0.05 Vs. DID 3-5; ## p < 0.01 vs. dan 0; SSS p < {{30}}.001 VS. DID{ {21}}; (b): *** p < 0.001 protiv DID 0-2-3-5, @@@ p < 0 .001 naspram dana 0, # p < 0,05, ### p < 0,001 naspram dana 0.S p < 0,05, SS p < 0,01, SSS p < 0,001 V. DID 5. (C) Ekspresija NG2 i MBP u GPR17-utišanim OPCsvs. kontrolnim OPC-ovima (postavljeno na 0) u svakoj vremenskoj tački. Promjena preklapanja (FC) je prijavljena kao LOG,(FC). Jedan uzorak t-test, * p < 0,05, * p < 0,01; *** p < 0,001 u odnosu na relativni DID u kontrolnim OPC-ima.
Slika 5. Metabolomske promjene izazvane utišavanjem GPR17 u OPC-ima. (a–d) Brojnost svakog metabolita nakon utišavanja GPR17 normalizirana je na onu u relativnom kontrolnom uzorku. Rezultirajuće promjene nabora korištene su za generiranje grafikona vulkana za svaku vremensku tačku (1, 2, 3, 5 dana u diferencijaciji). Tačke iznad isprekidane horizontalne linije predstavljaju metabolite koji su pokazali statistički značajnu promjenu (Fisherov LSD korigovan FDR; p.adj < 0.1). Zelenom bojom metaboliti sa nižom ekspresijom, crvenom, oni sa većom ekspresijom, nakon utišavanja GPR17. n=7–9 po svakoj grupi. DID: dani u diferencijaciji.
3.4. GPR17 Modulira oslobađanje laktata tokom OPC sazrevanja
Na osnovu metabolomskih rezultata opisanih gore, utvrđeno je da utišavanje GPR17 smanjuje intracelularne nivoe laktata. Da bismo procijenili da li ovo smanjenje odražava opći pad metabolizma laktata ili povećano oslobađanje ovog metabolita, izmjerili smo njegove razine u ćelijskim lizatima i u odgovarajućim medijima u različitim vremenskim točkama. Kao što je prikazano na slici 6, u kontrolnim uslovima, intracelularni laktat je dostigao najveću količinu na DID 2 (slika 6a) (kada je ekspresija GPR17 receptora takođe maksimalna), a zatim se smanjio kada su ćelije postale zrele. Umjesto toga, nakon utišavanja GPR17, porast intracelularnog laktata je ukinut, a njegovi nivoi su se dalje smanjivali prema diferencijaciji. Zaista, poređenje nivoa laktata u GPR17-utišanim OPC-ima naspram kontrolnih OPC-a u svakoj vremenskoj tački je istaklo smanjenje nivoa laktata u DID 2 i 3 (Slika 6b). Ekstracelularni laktat je pratio različitu kinetiku, pokazujući značajno smanjenje u poređenju sa DID 1 na DID 2-3-5 u kontrolnim uslovima, dok je u GPR17-utišanim OPC-ima ostao stabilno viši, a zatim značajno smanjen na DID 5 (slika 6c ). Međutim, kada se porede nivoi laktata u različitim vremenskim tačkama između dva eksperimentalna uslova, utišavanje GPR17 ometa fiziološku redukciju,povećanje prisustva laktatau mediju na DID 2 i 3 (slika 6d),što ukazuje na povećano oslobađanje.
Slika 6. Utišavanje GPR17 u OPC-ima mijenja metabolizam laktata. (a) Obilje laktata tokom sazrevanja OPC u kontrolnim uslovima (zelena linija) i nakon utišavanja GPR17 (narandžasta linija). n=7–9 po grupi. Jednosmjerna ANOVA sa Tukeyjevim testom višestrukih poređenja. * p < 0.05, ** p < 0.01 u odnosu na DID2 CTL; §§ p < 0.01, §§§ p < {{30}}.001 naspram DID1 siGPR17 (b ) Nivoi laktata nakon utišavanja GPR17 normalizirani su u odnosu na kontrolne uzorke (postavljeno na 1) u svakoj vremenskoj tački (n=7–9). ** p < 0,01; jedan uzorak t-test. Kondicionirani mediji iz GPR17-utišanih i kontrolnih OPC-a sakupljeni su iz iste kulture korištene za metabolomsku analizu. Nivoi laktata u podlozi su procenjeni pomoću LC-MS/MS. (c) Obilje laktata u ekstracelularnom prostoru tokom sazrevanja OPC u kontrolnim uslovima (zelena linija) i nakon utišavanja GPR17 (narandžasta linija). Jednosmjerna ANOVA sa Tukeyjevim testom višestrukih poređenja. ** p < 0,01, *** p < 0,001 u odnosu na DID1 CTL; § p < 0,05 u odnosu na DID5 siGPR17. (d) Nivoi ekstracelularnog laktata nakon utišavanja GPR17 su normalizovani u odnosu na kontrolne uzorke (podešene na 1) u svakoj vremenskoj tački. * p < 0,05; ** p < 0,01; jedan uzorak t-test. Efekat inhibicije MCT1 u kontrolnim (e,g) i GPR17-utišanim (f,h) OPC-ima procijenjen je analizom ekspresije MBP, u uzorcima tretiranim inhibitorima u odnosu na relativne kontrole (tretirane vozilom) , na 3 i 5 dana diferencijacije. n=6 po grupi.
Jedan od mehanizama kojimOPC mogu osloboditi laktatje preko monokarboksilatnog transportera MCT1. Štaviše, nedavne studije su objavile da sami OPC mogu da steknu ekstracelularni laktat preko MCT receptora promovišući njihov ćelijski ciklus i diferencijaciju [39]. Stoga smo se zapitali da li povećano oslobađanje laktata izazvano utišavanjem GPR17 može biti posredovano MCT1 i da li to može biti djelimično odgovorno za efekat uočen na sazrevanje OPC u istim uslovima (Slika 4). U tom cilju, tretirali smo OPC sa AR-C155858, selektivnim inhibitorom MCT1, tokom normalne diferencijacije i nakon utišavanja GPR17. Kao što se očekivalo, oslobađanje laktata je uspješno inhibirano u oba stanja (slika S3). Efekat inhibicije MCT1 na sazrevanje OPC u različitim eksperimentalnim uslovima procenjen je analizom nivoa ekspresije MBP. Skromno smanjenje genske ekspresije MBP, koje je blizu statističke značajnosti (p=0.07), nađeno je samo u uzorcima transficiranim specifičnom siRNA za GPR17 (Slika 6e–h); međutim, nije se pojavila značajna varijacija u uzorcima transficiranim kontrolnom RNK (siNEG). Ovi rezultati sugeriraju da povećanje ekstracelularnog laktata posredovano smanjenjem GPR17 podstiče sazrijevanje OPC; međutim, mali stepen smanjenja MBP-a ukazuje da ovaj metabolit nije jedini faktor uključen u proces.
3.5. Lipidomska analiza nakon utišavanja GPR17 tokom OPC sazrevanja
Rezultati transkriptomske analize nakon utišavanja GPR17 također su naglasili potencijalnu vezu između njegove funkcije i sintetičkih puteva lipida i kolesterola, koji su glavne komponente mijelina. Da bismo dalje istražili ulogu GPR17 u metabolizmu lipida, primijenili smo LC-MS/MS na lipidomsku analizu GPR17-utišanih OPC-a nakon 2, 3 i 5 dana diferencijacije, u poređenju sa danom 0. Lista analiziranih lipida, relativnih promjena nabora i p-vrijednosti prikazana je u Tabeli S4. Dvije najzastupljenije klase lipida u eksperimentalnim grupama bile su masne kiseline i porodica diacil-fosfatidilkolina (PCaa). Tokom diferencijacije kontrolnih OPC-a, nismo pronašli nikakve značajne promjene u obilju bilo koje klase lipida. Umjesto toga, GPR17-utišani OPC-i pokazali su trend ka izmijenjenom obilju slobodnih masnih kiselina, ceramida, acil-alkil-fosfatidilholina (PCae) i fosfatidilinozitola (PI) u poređenju sa kontrolnim OPC-ima, posebno na DID 3 i 5, ali samo diacil-fosfatidiletanolamin (PEaa) i sfingomijelin (SM) su pokazali statistički značajnu promjenu (Slika 7).
Slika 7. Promjene u obilju lipidnih klasa izazvane utišavanjem GPR17 tokom OPC diferencijacije. Prijavljena je zastupljenost svake klase lipida u kontrolnim uslovima u različitim vremenskim tačkama (a) Analizirana je kinetika svake klase lipida nakon utišavanja GPR17: (b) masne kiseline, (C) ceramidi (d) LysoPC (lizofosfatidil-kolini), (e) LizoPE (lizofosfatidiletanolamini), (f) PCaa (diacil-fosfatidil-holini), (g) PCae (acil-alkil-fosfatidil-holini), (h) PEaa (di-acilfosfatidil-etanolamin), (i) PEla (acil-alkil-fosfatidil-etanolamini), (i) PI (fosfatidilinozitoli), (k) PS (fosfatidil-serini), (D SM (sfingomijelini). n=5 za svaku grupu. Kinetika: Dvosmjerna ANOVA praćena Tukeyjevim testom višestrukog poređenja siGPR17: Dvosmjerna ANOVA praćena Sidakovim testom višestrukog poređenja * p.adi < 0.05, ** p.adi < 0.01.
Poređenje lipidomskih podataka dobijenih iz GPR17-utišavanja i kontrola u svakoj vremenskoj tački omogućilo nam je da identifikujemo lipide na koje je značajno utjecalo utišavanje GPR17. Nakon 2 DID, nisu pronađene značajne promjene (podaci nisu prikazani). Nakon 3 DID, diacilfosfatidilholin (PCaa) C40:4 je bio manje zastupljen, a diacil-fosfatidiletanolaminPEaa) C34:3 je bio u većoj količini u GPR17-utišanim OPC (slika 8a). Nakon 5 dana diferencijacije, utišavanje GPR17 dovelo je do nekoliko promjena u obilju lipida: smanjenje nekoliko diacil-PC i diacil-PE i istovremeno povećanje nekoliko plazmalogena (acil alkil-PC) zajedno sa sfingomijelinom (SM) C18:1 i SM (OH) C16:1 (Slika 8b). Ovi podaci ukazuju na to da smanjenje GPR17 mijenja profil lipida glavne komponente mijelina kao PC i PE.
Slika 8.Lipidomske promjene izazvane utišavanjem GPR17 u OPC. (a,b) Količina svakog lipida nakon utišavanja GPR17 normalizirana je na onu u relativnom kontrolnom uzorku. Rezultirajuće promjene nabora korištene su za generiranje vulkanskog grafikona za svaku vremensku tačku (3, 5 dana u diferencijaciji). Tačke iznad isprekidane horizontalne linije predstavljaju metabolite koji su pokazali statistički značajnu promjenu (Fisherov LSD korigovan FDR; p.adj < 0.1). U zelenoj su lipidi sa nižom ekspresijom, crvenom, oni sa većom ekspresijom, nakon utišavanja GPR17. n=5 po grupi.
Pitajte za više:
Email:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: plus 86 15292862950
PRODAVNICA:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
