za vise information:ali.ma@wecistanche.com

Sante Princiero Berlingerio^1,†, Junling He^2,†, Lies De Groef³, Harold Taeter⁴, Tomas Norton⁴, Pieter Baatsen⁵, Sara Kairoli⁶, Bianca Goffredo⁶, Peter de Witte⁷, Lambertus van den Heuvel^1,8, Hans J. Baelde²i Elena Levtchenko^1,*

^{Dio I: Renal and Extra Renal Manifestations in Adult Zebra fish Model cistinoza}

¹Laboratorij pedijatrijske nefrologije, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgija; santeprinciero.berlingerio@kuleuven.be (S.P.B.); Bert.vandenHeuvel@radboudumc.nl (L.v.d.H.)

²Department of Patology, Leiden University Medical Center, 2300 RC Leiden, The Netherlands; J.He@lumc.nl (J.H.); j.j.baelde@lumc.nl (H.J.B.)

³Neural Circuit Development and Regeneration Research Group, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgium; lies.degroef@kuleuven.be

⁴Group of M3-BIORES, Division of Animal and Human Health Engineering, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgija; harold.taeter@kuleuven.be (H.T.); tomas.norton@kuleuven.be (T.N.)

⁵Molecular Neurobiology, VIB-KU Leuven, 3000 Leuven, Belgium; pieter.baatsen@kuleuven.be

⁶Odjel pedijatrijske medicine, Laboratorij metaboličke biohemijske jedinice, Dječja bolnica Bambino Gesù, IRCCS, 00146 Rim, Italija; sara.cairoli@opbg.net (S.C.); biancamaria.goffredo@opbg.net (B.G.)

⁷Laboratory for Molecular Biodiscovery, KU Leuven, 3000 Leuven, Belgium; peter.dewitte@kuleuven.be

⁸Odjel za pedijatrijsku nefrologiju, Medicinski centar Univerziteta Radboud, 6525 GA Nijmegen, Holandija

^*Prepiska: elena.levtchenko@uzleuven.be; Tel.: +32-16-34-38-22

^†Ovi autori su jednako doprinijeli ovom radu.

Apstraktno:Cistinozaje rijetka, neizlječiva, autosomna recesivna bolest uzrokovana mutacijama u genu CTNS. Ovaj gen kodira cistinozu lizosomnog transportera cistina, što dovodi do lizosomske akumulacije cistina u svim ćelijama tijela, s tim da su bubrega prvi zahvaćeni organi. Trenutno liječenje cisteaminom umanjuje nakupljanje cistida, ali ne preokreće proksimalnu tubularnu disfunkciju, glomerularnu ozljedu ili gubitakbubregFunkcija. U našoj prethodnoj studiji razvili smo zebrafish model cistinoza putem besmislice mutacije u genu CTNS i pokazali da ličinke zebrafiša dokapitulirajububregfenotip opisan kod ljudi. U trenutnoj studiji, okarakterizirali smo odraslu osobucistinozazebrafish model i procijenio dugoročne učinke bolesti nabubregi izvanrenalni organa putem biokemijskih, histološkog, plodnosti, i locomotornih studija aktivnosti. Otkrili smo da je odrasla osobacistinozaZebra riba predstavlja akumulaciju cistena u raznim organima, izmijenjenu morfologiju bubrega, poremećenu pigmentaciju kože, sniženje plodnosti, promijenjenu aktivnost lokomotora i očne anomalije. Ukupno gledano, naši podaci ukazuju da je odrasla osobacistinozaZebrafish model reproducira nekoliko ljudskih fenotipa cistinoze i može biti koristan za proučavanje patofiziologije i dugoročnih efekata novih terapija.

Ključne reci:bubregbolest;cistinoza; zebrafish model;bubregi izvanrenalni manifestacija; odrasle fenotipske osobine

1. Uvod

Cistinozaje autosomni recesivni poremećaj skladištenja uzrokovan mutacijama u genu CTNS koji kodira lizosomski cistinski proton ko-transporter cistinoza, noseći cistin od lizosomnog lumena do cistosola. Nekoliko organa je uključeno u bolest, kao što su mišići, testis, oči, i mozak, i među svima,bubrezisu prvi i najviše zahvaćeni organi [1]. Najčešća i najžešća klinička varijanta je infantilna nefropatskacistinoza, u kojoj je prva klinička manifestacijabubregFanconi sindrom, karakterizirana umanjenom proksimalnom cevastom epitelnom ćelijom

(PTE) reabsorpcija koja rezultira urinarni gubitak aminokiselina, glukoze, niske molekularne do intermedijalne proteine molekularne težine, i drugih metabolita. Oštećenje PTEC-a slijedi progresivna glomerularna disfunkcija i, kada se ne leči, dovodi do endstagebubregbolesti [1]. Trenutni terapeutski pristup sastoji se od cisteamina, koji je aminotiol koji ojašnjava cistin koji razbija disulfidni most cisteina, što rezultira formiranjem aminokiselinog cisteina i cisteamin-cistein miješanog disulfida. Ovaj lajt molekulaexitlysosomesviatheaminoacidtransporterPQLC2[2]. Međutim, liječenje cisteaminom, iako se snižava lizosomska akumulacija cistita, samo odgađa napredovanje bolesti [3–5]. Stoga, daljnje razumijevanje patogenezecistinozai razvijanje novog silovanja su još uvijek na programu istraživanja. Nekoliko životinjskih modela je razvijeno kako bi se dokapitulirao fenotip cistinoze [6,7]. Jedan od najkorišćenijih modela je Ctns−/− C57BL/6 miš, koji razvija nakupljanje cistina i blagu proksimalnu tubulopatiju. Međutim, ne pokazuje glomerularna oštećenja i fenotip je pronađen zavisan od genetičke pozadine [8].

Do danas su modeli zebrafiša postali atraktivno sredstvo za istraživanje ljudskih bolesti zbog nekoliko prednosti kao što su njihov brzi razvoj, visoka lakoća, niži troškovi održavanja, te dostupnost lako primenljivim tehnologijama za uređivanje gena [9]. U prethodnoj studiji, predstavili smo kongenski model ličinki zebrafiša s homozigoznom mutacijom gluposti u eksonu 8 gena CTNS−/− što je rezultiralo funkcionalnim gubitkom cistinoza [10], što je dovelo do nakupljanja cistina u cijelom tijelu, povećane deformacije ličinki, odgođenog razvoja, ibubregoštetiti. Međutim, dugoročne posljedice bolesti kod odraslih zebrafiša do sada nisu proučavane. U trenutnoj studiji, imali smo za cilj da okarakteriziramobubregi izvanrenalne manifestacije u odraslom zebrafish modelucistinoza.

Kliknite na organskiCistanche za bolest bubrega

2. Rezultati

2.1. Cistina se nakuplja u Ctns−/− Zebrafish

Cistinozasmatra se multisistemski poremećaj koji rezultira akumulacijom cistina u svim ćelijama tijela. U našem prethodnom radu, otkrili smo da cistinoza (ctns−/−) zebrafish prikazuje akumulaciju cistina počevši od larvnog stadija razvoja i u nekoliko organa do dobi od 8 mjeseci [9]. Kako bismo procijenili da li naš model održava nakupljanje cistina u kasnijim fazama bolesti, mjerili smo nivo cistina u cijelom tijelu,bubreg, testis, oči, mišić, i mozak u 18-mjesečnim ctns−/− zebrafish u odnosu na dob-matched divljeg tipa muške zebrafish. Pronašli smo 54-foldno povećanje sadržaja cistina u cijelom tijelu (1A) i 146-putano povećanje bubrega (1B) ctns−/− zebrafiša u usporedbi sa zebrafishom divljeg tipa. Osim toga, promatrali smo obimnu akumulaciju cistina u testisu, očima, mišićima i mozgu (1C-F) u ctns−/− zebrafish.

2.2. Manifestacija bubrega

2.2.1. Ctns−/− Zebrafish Present PTEC Damage

Budući da jebubregje najviše zahvaćen organ, ispitali smo histološke karakteristike bubrega koristeći Hematoxylin i Eosin(H&E)i Periodic Acid-Shiff(PAS) mrlje. Uocili smo prisustvo oblacnog oticanja, eozinofilnih kapljica nalik hijalinu, i cistoplazmičkih vakuola u PTEC-u od ctns−/− zebrafiša (figura 2B, D) ali ne i kod zebrafiša divljeg tipa (figura 2A, C). Napomene, nije pronađeno distalno tubularno oštećenje. Cistinski kristali su prethodno uočeni u PTEC-u kao cistoplazmatski vakuoli s rectangularnim ili polimorfnim oblicima [11]. Stoga smo istražili da li su te strukture bile prisutne i u tubulama zebrafiša. Pronašli smo brojne cistoplazmatičke vakuole u PTEC od ctns−/− zebrafish kroz toluidin plavo bojenje (3B, D, indiciran sa asterisks). Osim toga, pronašli smo vakuolarni prostor s istokutnim ili polimorfnim oblicima (figura 3B, D, naznačana sa glavama strelice). Ovaj nalaz smo potvrdili transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM) (3F). Ove strukture nisu bile prisutne u PTEC-u zebrafiša divljeg tipa (slike 3A, C, E). Zanimljivo je da smo, pored prisustva vakuola polimorfnog oblika, primetili i delimičan gubitak granice četke u PTEC ultrastrukturi (slike 3F).

Figura 1. Sadržaj cistina u homogenatima divljeg tipa i ctns−/− zebrafish. (A–F) Sadržaj ciste u cijelom tijelu (A),bubreg(B), testis (C), oči (D), mišić (E), i mozak (F) u divljem tipu i ctns−/− 18-mjesečni muški zebrafish. Koncentracija cistina se izražava kao nmol/mg protein. Svaka tačna predstavlja jednu zebrafish, za ukupno n = 3 divljeg tipa i n = 3 centa −/− 18-mjesečni mužjak zebrafish; neplaćeni t-test sa Welch-ovom korekcijom, dvorepi: * p< 0.05;="" **="" p=""><0.01; ns:="" not="" significant.="">

Na 2.Bubreghistologija u divljem tipu i ctns−/− zebrafish. (A, B) Reprezentativne slikebubregtubule divljeg tipa (A) i ctns−/− (B) 18-mjesečne zebrafish. Detalji proksimalnih tubula sa eozinofilnim kapljicama nalik hijalinu (crne glave strelica) i cistoplazmatski vakuoli (*). H&E mrlja. Skalne trake predstavljaju 50 μm. (C,D) Reprezentativne slike PAS-ove mrlje od renalnih tubula divljeg tipa (C) i ctns−/− (D) 18-mjesečne zebrafish. Detalji proksimalnih tubula s kapljicama nalikom hijalina (crne glave strelica) i cistoplazmatski vakuoli (*). PAS fleka. Vage predstavljaju 50 μm. PT: proksimalni tubul; DT: distalna tubula.

Na 3.Bubregcistinski kristali u divljim tipovima i ctns−/− Zebrafish PTEC-ovima. (A,B) Reprezentativni toluidin plavo-mrljasti slikebubregproksimalne tubule u divljem tipu (A) i ctns−/− (B) 18-mjesečnoj zebrafish. Skalne šipke predstavljaju 50 μm. (C,D) Brojke 3C, D pokazuju više uvećanje na sliku 3A,B. Detalji renalnih proksimalnih tubula sa cistoplazmalnim vakuolama ((D); *), pravih i polimorfnih vakuolarnih prostora ((D); crne glave strelica). (E, F) Reprezentativne TEM slike bubrega proksimalne tubule divljeg tipa (E) i ctns−/− 18-mjesečne zebrafish (F). (F) Parcijalni gubitak proksimaltubulebrushborders (PB)i akumulacijatherectangularandpolymorphousvacuoles (*) su primjećeni u bubregu proksimal tubule ctns−/− zebrafish. Pogled na pravougaonik visokog uvećanja u donjem desnom uglu pokazuje polimorfne vakuole i veliku vakuolu sa ravnom membranom graničnih segmenata (ravna linija). Skalne rešetake predstavljaju 5 μm.

2.2.2. Ctns−/− Zebrafish Show Glomerular Hypertrophy

Pošto glomerularna oštećenja obično prate PTEC lezije, mi smo procijenili glomerularnu histologiju odctns−/− zebrafish,i smoobslužili dactns−/− malezebrafishshowedsignificant uvećanje Bowman kapsule (4B, E) i glomerularnog tufta (figura 4B, F), ali ne i Bowmanov prostor (figura 4B, G) u usporedbi sa muškom zebrafishom divljeg tipa (figura 4A, E–G). Thesamewasfirmedfortheglomerulartuftinfemalezebrafishcarrying the ctns−/− mutacija (Figure 4F), i sličan trend je uočljivo na mjerenjimaBowmanovog prostora iBowmanove kapsule (Figure4E, G). Opažena je noproliferacijamesangijalnih ćelija ili glomeruloskleroze. Na TEM slikama, nismo promatrali izmjene na membrani glomerularnog podruma, podocitnom procesu izljeva stopala ili abnormalno fenestratnim endotelijnim ćelijama u glomerulima ctns−/− zebrafiša (slika 4D) u usporedbi sa zebrafishom divljeg tipa (slika 4C).

Na 4. Glomerular morfology in wild-type and in ctns−/− zebrafish. (A, B) Reprezentativne slike glomerulusa divljeg tipa (A) i ctns−/− (B) 18-mjesečne zebrafish. PAS fleka. Skalne trake predstavljaju 50 μm. (C,D) Reprezentativne TEM slike glomerulusa divljeg tipa ( ctns−/− (D) zebrafish. Skalne rešetake predstavljaju 1 μm. (E–G) Kvantifikaciju površinske površine Bowmanove kapsule (E), glomerularnog tufta (F) i Bowmanova prostora (G) divljeg tipa i zebrafiša u oba spola.

2.2.3. Ctns−/− Zebrafish Display Increased Apoptosis at the PTEC Level

Dalje, istražili smo da licistinozapokrenuo smrt ćelija u našem zebrafish modelu [10,12]. Izveli smo isečenu kaspasu-3 immunostaining ububregtkivima divljeg tipa i ctns−/− zebrafish i promatrali smo značajno povećanje razine cijepanog kasplaze3 proteina u PTEC-u od ctns−/− zebrafish (figure 5B, D, G) u odnosu na zebrafish divljeg tipa (figure 5A, C, G) u oba spola. Izraz cijepane kaspase-3 je uglavnom bio prisutan u ćelijama koje pokazuju polimorfne cistoplazmatski vakuole (figura 5B, D). U glomerulima nije bio prisutan izraz cijepljene kaspase-3, kako u divljim tipovima tako i u ctns−/− zebrafish (figura 5E, F).

Na 5. Povećana apoptoza u PTEC-ima sa vakuolama u ctns−/− zebrafish. (A, B) Reprezentativne slike isječene kaspase-3 immunostaining tubula divljeg tipa (A) i ctns− stare zebrafiš. Skalne rešetake predstavljaju 50 μm. (C,D) Donji paneli pokazuju više uvećanje kutijanih područja u gornjim pločama. Detalji PTEC-a sa cistoplazmatičkom vakuolom (*). Skalne trake predstavljaju 50 μm. (E, F) Reprezentativne slike isječene kaspase-3 immunostaining glomerulusa divljeg tipa (E) i ctns−/− (F) 18-mjesečne zebrafiše. Skalne rešetake predstavljaju 50 μm. (G) Kvantifikacija tubularne kaspase-3 za obojenje pozitivnog područja u divljem tipu i zebrafiša u oba roda. Svaka točna predstavlja jednu zebrafish, za ukupno n = 3 divljeg tipa i ctns−/− 18-mjesečnu zebrafish. Dvosmjesna ANOVA sa Fisher-ovim najmanje značajnim testom razlike (PLSD): ** p< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001.="">

2.3. Dodatne manifestacije bubrega

2.3.1. Ctns−/− Zebrafish Show a Characteristic Hypopigmented Spotted Skin Pattern

Cistinozapacijenti često pokazuju prerano starenje kože, hipopigmentaciju, i plavu kosu [1.13]. Zanimljivo je da smo uočili hipopigmentirani pjegavi uzorak kože ctns−/− zebrafiša, dok je riba divljeg tipa predstavila tipični crni prugasti uzorak. Fenotip je prisutan u oba roda tokom čitavog njihovog života (na 6.A, B). Da bismo istražili razliku u pigmentaciji, izveli smo PAS bojenje na koži zebrafisha i otkrili smo da je CTNS−/− zebrafish prikaz izmijenio distribuciju melaninog sloja u epidermisu, što je uzrokovalo svjetlo pjegav uzorak (slike 6C, D).

Na 6. Hipopigmented spoted skin pattern in ctns−/− zebrafish. (A, B) Reprezentativne slike divljeg tipa (A) i ctns−/− (B) 18-mjesečne zebrafish. Vage predstavljaju 0,5cm. Crne glave strela ukazuju na različite prugaste šare kože. (C,D) PAS-mrlja slike epiderme divljeg tipa (C) i ctns−/− (D) 18-mjesečne zebrafish. Crne glave strela naglašavaju melanin sloj. Prekid u melaninom sloju je prisutan u ctns−/− (D) dok je izostanak u zebrafishu divljeg tipa (C). Skale predstavljaju 50 μ

2.3.2. Ctns−/− Zebrafish Show Spermatogenic Cysts Enriched in Spermatozoa

Cistinozapoznato je da utiče na funkcije testisa, što rezultira azoospermijom i neplodnošću u muških bolesnika [14–16]. Porijeklo azoospermije je još uvijek nejasno, iako je spermatogeneza pokazala da je netaknuta na nivou testisa. Za suprotnosti sa muškim pacijentima, ženke sa cistinozom su plodne [17]. U našem zebrafish modelu, i ženski i muški ctns−/− zebrafish su plodni. Da bismo istražili da li mutacija CTNS−/− utječe na anatomiju testisa, obavili smo PAS mrljanje i pronašli smo povećano nakupljanje spermatozoa u spermatogenim cistama u CTNS−/− zebrafish

Na 7. Spermatogenic ciste obogaćene u spermatozoa u ctns−/− zebrafish. (A, B) Reprezentativni H&E je zamahnuo slikama testisa divljeg tipa (A) i ctns−/− (B) 18-mjesečne zebrafish. Tamno plava i zaobljena bojenja predstavljaju spermatozoa akumuliranu u spermatogenim cistama (indicirano sa asterisks). Skale predstavljaju 200 μm.

2.3.3. Ctns−/− Female Zebrafish Show Decreased Egg Production

Da bismo istražili funkcionalnost reproduktivnog sistema, mjerili smo proizvodnju jaja i postotak oplođenih jaja i u divljim tipovima i u ctns−/− zebrafish. Otkrili smo da ctns−/−ženke pokazuju umanjenu proizvodnju jaja (8A) i snižen procenat oplođenih jaja (na 8B) u odnosu na ženke divljeg tipa.

Na 8. Proizvodnja jaja i postotak oplođenih jaja u divljem tipu i ctns−/− zebrafish. (A) Proizvodnja jaja je izmjerena kao ukupan broj jaja u divljem tipu i ctns−/− zebrafish 18-mjesečni zebrafish. Stopa proizvodnje jaja je 1,941 visoka kod zebrafiša divljeg tipa u odnosu na ctns−/− 18mjesečna zebrafiš (omjer stope = 1,941); 95% CI (donja granica = 1.165, višu granicu = 3.234); Poisson regresijska analiza; p = 0,011. (B) Procenat oplođenih jaja je izmjeren na ukupnom broju jaja. Izgledi oplođenih jaja su 3,504 visoka kod zebrafiša divljeg tipa u odnosu na ctns−/− 18-mjesečnu zebrafish (omjer kvota = 3,504); 95% CI (donja granica = 2.005, višu granicu = 6.124); Logistička regresijska analiza; p< 0.001;="" n/a:="" not="" applicable.="">

2.3.4. Ctns−/− Zebrafish Display Decreased Locomotor Activity

Od kada su miљiжi i slabost dijagnostikovani ucistinozapacijenti, općenito iz druge decenije života [1,18], procijenili smo aktivnost lokomotora u našem zebrafish modelu. Otkrili smo da je ctns−/− zebrafish iz oba spola pokazao umanjenu aktivnost lokomotora u odnosu na zebrafish divljeg tipa, što ukazuje na oštećenu funkciju mišića (9. Međutim, histološka analiza skeletnog mišićnog tkivo nije otkrila prividne abnormalnosti u ctns−/− zebrafish.