Nedavni napredak u otkrivanju antigena krpelja i razvoju vakcine protiv krpelja, 1. dio

sažetak:

Krpelji mogu ozbiljno utjecati na zdravlje ljudi i životinja širom svijeta, uzrokujući značajne ekonomske gubitke svake godine. Hemijski akaricidi se široko koriste za suzbijanje krpelja, koji negativno utječu na okoliš i rezultiraju pojavom populacija krpelja otpornih na akaricide. Vakcina se smatra jednim od najboljih alternativnih pristupa u kontroli krpelja i bolesti koje se prenose krpeljima, jer je jeftinija i efikasnija od hemijske kontrole. Mnoge vakcine zasnovane na antigenima razvijene su kao rezultat trenutnog napretka u transkriptomici, genomici i proteomskim tehnikama.

Neki od njih (npr. Gavac® i TickGARD®) su komercijalno dostupni i obično se koriste u različitim zemljama. Nadalje, značajan broj novih antigena se istražuje s perspektivom razvoja novih vakcina protiv krpelja.

Međutim, potrebno je više istraživanja kako bi se razvile nove i efikasnije vakcine zasnovane na antigenima, uključujući procjenu efikasnosti različitih epitopa protiv različitih vrsta krpelja kako bi se potvrdila njihova unakrsna reaktivnost i njihova visoka imunogenost. U ovom pregledu raspravljamo o nedavnim napretcima u razvoju vakcina baziranih na antigenu (tradicionalnih i baziranih na RNA) i pružamo kratak pregled nedavnih otkrića novih antigena, zajedno s njihovim izvorima, karakteristikama i metodama koje se koriste za testiranje njihovih antigena. efikasnost.

Antigeni su supstance koje mogu izazvati imunološki odgovor, uključujući bakterije, viruse, ćelije, itd. Imunitet je sposobnost tijela da odgovori na vanjske antigene, uključujući urođeni i stečeni imunitet. Veza između antigena i imuniteta je bliska, a imunitet može prepoznati i napadati antigene, čime štiti tijelo od bolesti. Na primjer, kada je ljudsko tijelo izloženo određenom patogenu, imuni sistem prepoznaje antigen i proizvodi antitijela da ga napadne kako bi se izbjegla bolest. Stoga je interakcija između antigena i imuniteta važan mehanizam za održavanje dobrog zdravlja. Dakle, sa ove tačke gledišta, moramo obratiti pažnju na poboljšanje našeg imuniteta u svakodnevnom životu. Cistanche ima značajan uticaj na poboljšanje imuniteta. Cistanche je bogat raznim antioksidativnim supstancama, kao što su vitamin C, vitamin C, karotenoidi, itd. Ovi sastojci mogu ukloniti slobodne radikale, smanjiti oksidativni stres i poboljšati otpornost imunološkog sistema.

Kliknite dodatak cistanche deserticola

Ključne riječi:

vakcinomika; kandidati za antigen; vakcina protiv krpelja; kontrola krpelja.

1. Uvod

Krpelji su ektoparaziti koji napadaju ljude i životinje i odgovorni su za značajne ekonomske gubitke. Oni su drugi najvažniji vektori za prenošenje bolesti kod ljudi nakon komaraca [1,2]. Oni su također jedan od najvažnijih vektora za prijenos bolesti koje utječu na svjetsku stočarsku industriju i kućne ljubimce [3–5]. Krpelji imaju malo prirodnih neprijatelja, zbog čega je teško kontrolirati infekciju krpelja. Hemijski akaricidi su samo djelomično djelotvorni, s nekoliko neciljanih nedostataka, uključujući odabir krpelja otpornih na akaricide i kontaminaciju okoliša i životinjskih proizvoda ostacima kemikalija [6].

Osim toga, za kontrolu bolesti koje prenose krpelji, u raznim zemljama se koriste neke vakcine na bazi antigena; međutim, potrebni su novi i efikasniji pristupi, uključujući razvoj novih vakcina koje ciljaju na infestaciju krpelja i infekcije patogenima [7,8].

Tradicionalno, princip „izolirati–inaktivirati–ubrizgati“ je igrao ključnu ulogu u dizajniranju i razvoju vakcine za kontrolu parazita/patogena. Vakcine prve generacije bile su sastavljene od patogena koji su bili živi, ​​atenuirani ili ubijeni. Vakcine druge generacije sastojale su se od pročišćenih komponenti parazita/patogena i razvijene su kao rezultat napretka u ćelijskoj kulturi, hemiji polisaharida, tehnologiji rekombinantne DNK i imunologiji [9,10]. Napredak genomike i drugih "omika" u posljednje dvije decenije rezultirao je razvojem "treće generacije" vakcina, zasnovanih na tehnologijama kao što su funkcionalna omika, reverzna vakcinologija i pristup sistemskoj biologiji.

Da bi se prevazišla ograničenja konvencionalnih pristupa razvoju vakcina, razvoj vakcine je postao prilagođeniji, sa fokusom na antigenske delove koji su ciljani zaštitnim imunološkim odgovorima [11,12], sa širokom perspektivom patogena i njegove interakcije sa imuni sistem domaćina [13]. Stoga se moderna vakcinologija sve više oslanja na nove pristupe omike koji koriste vrhunske tehnologije visoke propusnosti, kao što su genomika, transkriptomika i proteomika, zajedno s napretkom u bazičnoj imunologiji, biologiji domaćin-patogen, imunomiji, naprednoj bioinformatici, računarskom modeliranju i poboljšanom razumijevanje i tehnološke inovacije.

U poređenju sa upotrebom hemikalija, vakcinacija je mudra opcija jer je ekološki sigurna i isplativa za kontrolu zaraze krpeljima [12,14]. Iako je vakcinacija racionalna strategija za kontrolu infestacije krpeljima, do sada je komercijalizirano samo nekoliko cjepiva, uz minimalnu brigu o indukciji unakrsnog reaktivnog imuniteta protiv vrsta krpelja [15].

Za razvoj novih cjepiva, ključno je identificirati i okarakterizirati nove kandidate za antigen koji bi bili očuvaniji i koji bi imali sposobnost induciranja unakrsnog reaktivnog imuniteta kod vrste domaćina. Cilj ovog pregleda je da se pruži pregled tradicionalnih i RNA baziranih vakcina i mogućnosti njihove primene i novih antigena koji imaju potencijal da se iskoriste kao obećavajući kandidati za antigene za razvoj vakcine.

2. Identifikacija antigena: Mapa puta za razvoj vakcine protiv krpelja

Identifikacija antigena je ključna za razvoj vakcine protiv krpelja. Ključno je razumjeti molekularne mehanizme povezane s interakcijama domaćin-parazit-patogen kako bi se identificirali kandidati za antigen koji će vjerovatno poslužiti kao kandidati/mete za razvoj vakcine. Idealni kandidat za antigen izaziva dugotrajne i efikasne imune odgovore kod domaćina [16,17]. Mnoge studije su provedene otkako su Allen i Humphreys objavili svoje nalaze 1979. godine, koristeći niz antigena, uključujući cijele homogenate krpelja i unutrašnje organe, za izazivanje različitih nivoa imuniteta protiv krpelja [16].

Pojavilo se nekoliko novih mogućnosti za predviđanje, skrining i identifikaciju antigena koji štite od infestacije krpelja od Ixodes scapularis, prve vrste krpelja koja je sekvencionirana [18]. Sada postoje mnoge baze podataka nukleotida i proteina dostupnih iz različitih tkiva krpelja i razvojnih faza, a poznat je i širok spektar stimulansa koji utiču na krpelje, kao što je hranjenje krpelja ili infekcija patogenima [17,19].

Vjerojatnost odabira zaštitnih antigenskih kandidata izvedenih od krpelja za kontrolu infestacije krpeljima i infekcije patogenima također se povećala kao rezultat nedavnog napretka u tehnologiji omike (tj. transkriptomika, proteomika i metabolomika) [20]. Osim toga, upotreba reverzne vakcinologije (RV), ili vakcinomike, omogućila je otkrivanje novih kandidata za antigen vakcine [20].

Kao rezultat toga, sintetički i rekombinantni proteini su procijenjeni i pokazano je da mogu izazvati određeni nivo zaštitnog imuniteta. Svrha ovog odjeljka je da se raspravlja o kandidatima za antigen koji potiču iz različitih tkiva koja su identificirana, procijenjena za njihovu efikasnost i koja se smatraju potencijalnim kandidatima za razvoj vakcine protiv krpelja, na osnovu dostupne literature (Tabela 1 i Slika 1).

Slika 1. Pregled distribucije i šeme procjene efikasnosti ciljanih antigena vakcine protiv krpelja za prevenciju infestacije krpeljima i bolesti koje se prenose krpeljima.

2.1. Kandidati za antigen povezane s jajima

Žumance je esencijalna komponenta za razvoj krpelja jer služi kao rezervoar različitih proteina koji igraju ključnu ulogu u embrionalnom razvoju ovih člankonožaca [21,22]. Kao i kod insekata, proteini žumanca se sintetiziraju u masnom tijelu krpelja [21,23]. Razgradnju žumanca vrše razne vrste enzima koji se nalaze u jajima. Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) je primjer žumančane proteinaze koja je izolirana iz R. microplus jaja i za koju se navodi da je uključena u proces embriogeneze krpelja.

Ovi enzimi posebno igraju ključnu ulogu u razgradnji vitelina, glavne proteinske komponente žumanca [21]. BYC su prvi izolovali da Silva Vaz Jr i dr. [24] iz R. microplus jaja, a zatim je inokuliran u goveda kako bi se utvrdila njegova uloga u indukciji imuniteta domaćina. Utvrđeno je da ovaj enzim pruža djelomičnu zaštitu od krpelja i izaziva zaštitni imunološki odgovor kod goveda, ali njegova efikasnost je bila između 14 i 36 posto. Naknadna studija je eksprimirala rekombinantni BYC protein u prokariotskom ekspresijskom sistemu (E. coli).

Zanimljivo je da je rekombinantni protein pokazao ukupnu veću efikasnost (25,24 posto) u poređenju sa enzimom direktno izolovanim iz žumanca [25,26]. Pokazalo se da različiti faktori mogu uticati na efikasnost ovog proteina, na primer, način pripreme BYC proteina može uticati na strukturu proteina i na kraju na njegove funkcije. Nadalje, ova varijacija može biti povezana s sojom krpelja ili drugim eksperimentalnim uvjetima [24].

Vitelin, lipoglikoprotein koji se također nalazi u žumanjku, sličan drugim proteinima žumanca, sintetizira se u masnim tijelima artropoda [27,28]. Kod krpelja, vitelin ili vitelogenini su ključni za razvoj jajašca i ovipoziciju, što je pokazano utišavanjem tri vitelogeninska gena u H. longicornis [29]. Vitelin protein je pročišćen iz jaja krpelja kao nekovalentni kompleks od šest polipeptida visoke molekularne težine (44-107 kDa). Paralelno sa ovom studijom, 80 kDa glikoprotein (GP80) je izolovan i pročišćen iz larvi R. microplus.

Oba proteina su zatim inokulirana da bi se ispitala njihova efikasnost. Vakcinacija Vitellinom i GP80 pokazala je ukupnu efikasnost od 68 posto, što sugerira da vakcina koja sadrži oba antigena može izazvati imuni odgovor i također pružiti djelomičnu zaštitu protiv R. microplus kod ovaca domaćina [28].

Zanimljivo, kada je rekombinantni heksahis-GP80 (HH-GP80), koji je bio pogrešno savijen i nije glikoziliran, ubrizgan u domaćina pod istim eksperimentalnim uslovima, nije pokazao nikakvu efikasnost [28]. Na osnovu nalaza gornje studije, čini se da vakcinacija vitelina i GP80 može izazvati imunološki odgovor kod ovaca i može djelomično zaštititi ovce od krpelja B. micro plus. Ispravno savijanje HH-GP80 je ključno za njegovu aktivnost, budući da su zaštitni epitopi povezani sa savijanjem proteina i/ili oligosaharida vezanih za njega, a ti epitopi su neophodni za njegovu aktivnost.

Cistein endopeptidaza koja razgrađuje vitelin (VTDCE) je još jedan enzim povezan s jajetom koji su identificirali i izolirali Seixas et al. [30]. Slično BYC, ovaj enzimski protein se ne sintetizira u jajnicima R. microplus i uključen je u hidrolizu vitelina, čime obezbjeđuje hranljive materije za embrione u razvoju.

Međutim, utvrđeno je da oba enzima različito regulišu hidrolizu vitelina [30]. Ista istraživačka grupa kasnije je analizirala pročišćeni VTDCE protein kao antigen i otkrila da ovaj protein također pruža djelomičnu zaštitu od krpelja, jer je imunizacija stoke rezultirala 21 posto učinkovitosti i 17,6 posto smanjenjem težine plodnih jaja [31]. Proteini povezani sa jajima BYC i VTDCE pružili su ograničenu zaštitu domaćinu od infestacije krpeljima, i stoga se čini da nisu prikladni kandidati za antigen kada se koriste sami u vakcini.

2.2. Kandidati za antigen povezane sa žlijezdama slinovnice

Krpelji sadrže protein sličan enzimu koji konvertuje angiotenzin koji može da kontroliše krvni pritisak regulacijom zapremine tečnosti, slično enzimu koji konvertuje angiotenzin kod sisara [32,33]. Ova kontrola omogućava krpelju da se neprekidno hrani krvlju domaćina. Žlijezde pljuvačne žlijezde i srednje crijevo krpelja B. micro plus sadrže glikoprotein male količine, koji je nazvan Bm91 [32]. Bm91 trenutno nije uključen u komercijalne vakcine protiv krpelja, ali se smatra kandidatom za suzbijanje krpelja [34]. Kada je rekombinantni protein Bm91 procijenjen sam u terenskim uslovima sa prirodnom infestacijom krpelja, rezultati su bili razočaravajući, jer je ovaj protein pokazao samo 6 posto efikasnosti, što se čini neprikladnim za razvoj vakcine za kontrolu krpelja [35].

Međutim, kada je rekombinantni protein Bm91 koji je proizveden u E. coli kombinovan sa Bm86 (kandidatom za antigen koji se koristi u komercijalnim vakcinama) i onda je ova kombinacija proteina korišćena kao vakcina, rezultati su bili mnogo obećavajući , budući da je dodatak Bm91 poboljšao efikasnost Bm86 antigena [33], što sugerira da kombinacija ova dva proteina (Bm91 i Bm86) izgleda kao efikasna strategija za razvoj novog antigena - vakcina protiv krpelja.

Transkriptomske i diferencijalne analize ekspresije gena pljuvačnih žlijezda su pokazale da genom vrsta krpelja (npr. R. microplus i Dermacentor andersoni) sadrži proteinsku sekvencu nazvanu protein svilenog bića [36,37]. Karakterizacija diferencijalne ekspresije gena u pljuvačnim žlijezdama R. microplus kao odgovor na infekciju A. marginale naglasila je molekularne mehanizme interakcije krpelja sa patogenom. Naknadne funkcionalne studije su pokazale da protein svilene svile (SILK) može igrati ključnu ulogu u infekciji i razmnožavanju A. marginale kod krpelja. Interakcija između molekula izvedenih od krpelja i patogena uključena je u umnožavanje A. marginale u ćelijama pljuvačne žlezde [36,38].

Nakon ove studije, predloženo je da bi protein svile u obliku flagelliforme mogao biti odgovarajući kandidat za antigen za razvoj vakcine. U tu svrhu, Merino et al. [14] proizveli su rekombinantni protein svilene flagelliforme i analizirali njegovu antigenu aktivnost ubrizgavanjem u goveda domaćina. Utvrđeno je da je rekombinantni protein odličan antigenski kandidat, jer pruža 62 posto zaštite od infestacije krpeljima i infekcije koju prenose krpelji (npr. babezioza) kod goveda. Vakcinacija proteinom flagelliformne svile smanjila je umnožavanje A. marginale kod goveda. Titri antigen-specifičnih antitijela su u korelaciji sa smanjenom infestacijom krpelja i infekcijom patogenom, što ukazuje da je učinak cjepiva rezultat odgovora antitijela.

Nadalje, na ekspresiju antigena vakcine koji kodiraju gen kod krpelja koji su se hranili govedom također je utjecala vakcinacija i ko-infekcija sa A. marginale i B. bigemina. Stoga se čini da vakcine koje koriste proteine ​​krpelja koji su uključeni u interakcije vektor-patogen mogu biti efikasne i u kontroli infestacije krpelja i u prevenciji infekcije patogenom u isto vrijeme [14].

Salp15 je imunosupresivni pljuvački protein I. scapularis sa molekulskom težinom od 15 kDa koji inhibira aktivaciju CD4 plus T ćelija, aktivnost komplementa, proizvodnju citokina i funkciju dendritskih ćelija u domaćinu [39–41]. Naknadne studije su istraživale molekularni mehanizam Salp15. Protein vanjske površine, OspC, proizvodi B. burgdorferi na vanjskoj površini stanice. Proizvodnja spiroheta (B. burgdorferi spirochetes) u srednjem crijevu zaraženih krpelja počinje kada se hrane krvlju domaćina, koja se zatim prenosi do domaćina.

Tokom izlaska iz pljuvačnih žlijezda i prijenosa spiroheta B. burgdorferi na domaćina, Salp15 fizički stupa u interakciju s OspC na površini spiroheta B. burgdorferi, što olakšava preživljavanje spiroheta, prijenos patogena i infekciju domaćina [38,42 ]. Interakcija Salp15–OspC stoga može potencijalno zakloniti OspC od imunološkog odgovora domaćina tako da je spiroheta zaštićena od imunološkog odgovora [38]. Nedavno je ekspresioni sistem Escherichia coli korišćen za sintetizaciju Salp15 rekombinantnog proteina, i pokazalo se da je sistem efikasan u proizvodnji ovog proteina u značajnom prinosu sa dobrom rastvorljivošću. Ove karakteristike Salp15 rekombinantnog proteina ukazuju da on ima praktičnu primenu i da se može koristiti za proizvodnju vakcina protiv krpelja [41,43,44].

Metaloproteaze (MP) su multifunkcionalni proteini koji učestvuju u širokom spektru složenih fizioloških i patoloških procesa u živim organizmima [45]. Nekoliko MP je identificirano u različitim vrstama krpelja i smatra se da su ključni za održavanje funkcija povezanih s krvnim obrokom kod krpelja [46–49]. Na primjer, pljuvačne žlijezde iksodidnih krpelja sadrže MP koji su prepoznati kao ključne bioaktivne komponente u vitalnim fiziološkim funkcijama i stoga se smatraju potencijalnim ciljevima u strategijama kontrole za borbu protiv ovih ektoparazita [49]. Da bi procijenili antigenski potencijal MPs, Ali et al. (2015) [50] amplificirali su fragment sekvence koja kodira R. micro plus MP, izrazili ga kao rekombinantni protein i koristili pročišćeni oblik ovog proteina kao antigen vakcine protiv R. microplus kod goveda [50]. Rekombinantni R. micro plus MP protein pokazao je ukupnu efikasnost od 60 posto.

Osim toga, smanjio je broj hranjenja krpelja, broj proizvedenih jaja i broj izleženih jaja, što ga čini [41] idealnim kandidatom za razvoj vakcine protiv krpelja [50]. Da bi dalje istražili prikladne kandidate za antigen iz R. microplus, Maruyama et al. [51] izvršili su RNA-seq studiju na pljuvačnim žlijezdama u svim fazama hranjenja R. microplus, i otkrili su fragment iz transkriptoma koji je sličan MP (Rm239) zajedno sa tri druga gena, uključujući Rm39, Rm76 i Rm180 . Primjena ovih proteina kao vakcina pokazala je da svi oni mogu inhibirati hemostatske odgovore, potisnuti odgovore antitijela domaćina i smanjiti sposobnost krpelja da se veže za domaćina pomoću cementnog proteina bogatog glicinom.

Stoga su autori razvili višekomponentnu vakcinu protiv krpelja koristeći ova četiri različita tipa proteina [51]. Imunizacija goveda ovom multikomponentnom vakcinom rezultirala je smanjenjem infestacije R. microplus za 73,2 posto, što ukazuje da formulacija multi-antigenske vakcine protiv krpelja može biti efikasnija od monokomponentnih vakcina [51].

Ribosomi, koji se još nazivaju i fabrike proteina, komponente su svih živih organizama. Pokazalo se da ribosomski protein P{{0}} igra ključnu ulogu u regulaciji translacijske aktivnosti ribozoma i pomaže organizmu da prilagodi svoj metabolizam različitim uvjetima okoline. Pripada grupi kiselih proteina koji formiraju strukturu nalik stabljici u najvećoj podjedinici ribosoma ribosoma [52]. Postoje dokazi koji pokazuju da pljuvačka krpelja sadrži ribosomske proteine ​​koji igraju ulogu u izbjegavanju odbrambenih mehanizama domaćina [53–55]. Nedavno je objavljeno da su zečevi vakcinisani rekombinantnim ribosomskim proteinom P0 pokazali jake humoralne odgovore koji su prvenstveno smanjili linjanje nimfe i reprodukciju ženke. Protein je pokazao zaštitu od 57,5 ​​posto od infestacije O. erraticus, ali nije pružio unakrsnu zaštitu od infestacije afričkog krpelja Ornithodoros moubata [56].

U drugoj studiji, istraživači su hemijski sintetizirali peptid od 20 aminokiseline, koji je izveden iz ribosomskog P0 proteina krpelja Rhipicephalus, i uspješno ga konjugirali s proteinom Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Megathura crenulate služi kao antigen protiv R. microplus, pokazujući 96 posto efikasnosti kod goveda [57]. U ovoj studiji, rezultati sugeriraju da je P0 konjugiran sa KLH odlična vakcina. Međutim, proizvodnja takve vakcine će biti skupa i stoga možda neće biti isplativa za stoku. Stoga je neophodno sprovesti dalja istraživanja o rekombinantnoj proizvodnji antigenske vakcine kako bi se procenila njena efikasnost i kako bi njena proizvodnja bila ekonomski isplativija.

Inhibitori serin proteaze: Pokušaji izolacije antigena iz vrsta krpelja identifikovali su neke inhibitore serin proteinaze (serpine), za koje se činilo da imaju antigenske sposobnosti. Serpini su uključeni u različite fiziološke aktivnosti kod životinja, posebno kod goveda, gdje utiču na zgrušavanje krvi, mijenjajući protrombinsko vrijeme i djelomično aktivirajući tromboplastinsko vrijeme [58–60]. Serpini ometaju imuni sistem krpelja i na taj način olakšavaju početni proces hranjenja ovih parazita [61]. Andreotti et al. [62] izolovali su i identifikovali R. micro plus tripsin inhibitore (BmTI) iz ekstrakata larve.

Da bi se procijenila njegova antigena aktivnost, ukrštena goveda su vakcinisana sa BmTI, za koji je utvrđeno da ometa migraciju leukocita na mestu fiksacije larvi [63,64]. Vakcinacija teladi antigenima BmTI značajno je smanjila broj ženki krpelja i njihovu težinu, što je rezultiralo 72,8 posto efikasnosti protiv R. microplus. Ovi podaci sugeriraju da imunizacija BmTI može djelovati u ranoj fazi razvoja larvi [65]. Da bi se istražilo može li skraćeni BmTI također izazvati imunizaciju, sintetiziran je N-terminalni fragment BmTI koji je pokazao nižu efikasnost (18,4 posto) kod goveda u odnosu na protein pune dužine.

Stoga, imunizacija N-terminalnim domenom nije dovoljna da poboljša učinak BmTI na interakcije domaćin-parazit [64]. Slično tome, kada su rekombinantni inhibitori tripsina larve R. microplus (rRmLTI) korišćeni kao ispitivanje vakcine, efikasnost (32 procenta) je ponovo bila niska, što sugeriše da su i skraćeni ili celi rekombinantni protein manje efikasni, verovatno zbog nedostatka precizno savijanje proteina in vitro. Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da inhibitori tripsina izgledaju pogodni kandidati za proizvodnju efikasne vakcine; međutim, metoda za njihovu proizvodnju u velikim razmjerima treba poboljšati kako bi se poboljšala njihova učinkovitost [66]. Različiti drugi serpini su ocijenjeni kao mogući kandidati za vakcinu protiv krpelja iz različitih vrsta krpelja, uključujući Amblyomma americanum (AAS19), Haemaphysalis longicornis (HLS2), Rhipicephalus (Boophilus) microplus, itd. Svi ovi serpini su pokazali delimičnu zaštitu domaćinu; međutim, nivo zaštite može varirati u zavisnosti od vrste krpelja i vrste serpina [67–69].

Kombinovanje proteina iz jednog ili više krpelja u jedan polipeptidni lanac predstavlja atraktivnu strategiju vakcinacije protiv krpelja. Stoga se inhibitori tripsina/ili serpini u kombinaciji sa imunogenim fragmentima drugih proteina krpelja mogu koristiti kao multi-antigenski konstrukti. Na primjer, sintetiziran je himerni protein koji sadrži rekombinantni Bm86-Campo Grande antigen (BmCG), rRmLTI i toplinski labilnu podjedinicu enterotoksina B iz Escherichia coli (LTB) kao molekularni adjuvans. Ovaj himerni RmLTI–BmCG–LTB antigen imao je 55,6 posto efikasnosti protiv R. microplus kod goveda.

2.3. Kandidati za antigen povezane sa srednjim crijevom

Proteini feritina važni su za fiziološko skladištenje željeza u netoksičnom, ali biološki dostupnom obliku. Oni su ključni za metabolizam gvožđa iz unesene krvi tokom hranjenja krpelja [70,71]. Do sada su identificirana i okarakterizirana dva molekula feritina (feritin 1 i feritin 2). Feritin 1 (FER1) se nalazi unutar ćelija, gde je uključen u fiziološko skladištenje gvožđa.

Za feritin 2 (FER2) ne postoje funkcionalni ortolozi kod kičmenjaka. Uglavnom se izražava u crijevima i igra ključnu biološku ulogu u transportu željeza do pljuvačnih žlijezda i jajnika [71]. Protein FER2 je zabilježen u različitim vrstama krpelja uključujući D. variabilis, R. microplus, I. ricinus, Haemaphysalis longicornis i I. scapularis [71,72]. Na osnovu studija gubitka funkcije FER2, to je obećavajući kandidat za vakcinu, jer supresija ovog gena narušava sposobnost hranjenja krpelja, smanjuje ovipoziciju i smanjuje izleganje larvi [71].

Osim FER2, FER1 se pokazao kao prikladan kandidat za antigen za kontrolu raznih vrsta krpelja. Hajdusek i dr. testirali rekombinantni FER2 protein R. microplus (RmFER2) za imunizaciju goveda i otkrili da je vakcina zasnovana na FER{4}} pokazala ukupnu efikasnost od 64 posto [73]. Slično, rekombinantni proteini FER1 i FER2 H. longicornis korišćeni su za imunizaciju zečeva. Oba proteina su visoko imunogenična i induciraju proizvodnju antitijela domaćina. Imunizacija domaćina značajno je smanjila napunjenu težinu infestiranih krpelja i smanjila broj jaja i broj krpelja sa potpuno izleženim jajima. Međutim, rekombinantni FER2 je izazvao veće smanjenje s većom djelotvornošću (49 posto) od rekombinantnog FER1 (34 posto) [72].

Nedavno su Manjunathachar i saradnici [74] izvijestili da je tele vakcinisano sa H. anatolicum FER2, vektorom krimsko-kongo hemoragične groznice, bilo snažno zaštićeno od larvi (51,7 posto) i odraslih (51,2 posto) infestacija krpelja, kao kao i protiv krpelja sa FER2 oborenim od strane RNAi. Mnoga druga nedavna istraživanja su također potvrdila da FER2 pruža značajnu zaštitu domaćinu od infestacije krpeljima korištenjem rekombinantnog proteina FER2 [75–77]. Molekularni mehanizam zaštite uključuje uglavnom proizvodnju anti-FER2 antitijela u tijelu domaćina, koja se prenose u vrste krpelja tokom procesa hranjenja, a anti-FER2 antitijela se vezuju za FER2 unutar crijevnih stanica krpelja ili hemolimfe, čime se sprječava FER2. sklop i/ili funkciju.

Nedavno je otkriveno da su predviđene antigenske regije na proteinu FER2 očuvane kod različitih vrsta krpelja. Ovaj protein se stoga može koristiti za proizvodnju vakcine za zaštitu među vrstama [77]. U nedavnoj studiji, okarakterisani su ortolozi FER2 kod O. moubata (OMFER2) i O. erraticus (OEFer2), a istraživači su otkrili da imaju visoku sličnost sekvenci (85,3 posto). Rekombinantni oblik O. moubata Fer2 (tOMFER2) može izazvati jake humoralne odgovore kod zečeva. Međutim, kod O. erraticus, ovaj protein ne pokazuje nikakav zaštitni efekat, uprkos velikoj sličnosti sekvenci, što sugeriše da mala razlika u njihovim sekvencama može odrediti da li imaju zaštitni efekat ili ne. Uprkos tome, rezultati ove studije potvrđuju da OMFER2 ima potencijal da posluži kao kandidat za antigen za vakcine [78].

TROSPA je receptor krpelja koji je neophodan za kolonizaciju spirohete u I. scapularis. Protein A vanjske površine B. burgdorferi (OspA) se u izobilju proizvodi na ovim spirohetama i kritičan je za adheziju na vektor putem specifičnog vezivanja za TROSPA [79,80]. U različitim vrstama krpelja, uključujući R. microplus, I. scapulars i R. annulatus, TROSPA može igrati ulogu u mehanizmima infekcije i umnožavanju patogena Babesia. Osim toga, eksprimirani su proteini vanjske površine OspA i OspB kada spirohete uđu i borave u krpeljima [81]. Međutim, njihova ekspresija je potisnuta tokom prenosa do domaćina, dok su ekspresije OspC i bba52 pojačane. BBA52, zajedno s OspC proteinom borelija, ima komplementarnu, ali nebitnu ulogu u procesu prijenosa, jer su svi ovi antigeni lokalizirani u vanjskoj membrani i ko-eksprimirani u hranjenju krpelja [82-84].

Biološka funkcija receptora je nepoznata, ali vezivanje OspA za TROSPA je neophodno da bi krpelji mogli kolonizirati bakteriju B. burgdorferi u crijevima krpelja, što podržava bakterijsku infekciju u vektoru [79]. Infekcija B. burgdorferi inducira proizvodnju određenih gena krpelja (TROSPA i salp15), koji mogu biti ciljani da inhibiraju prijenos Borrelia spiroheta i drugih mikroba koje se prenose krpeljima [80,85]. Blokiranje TROSPA sa TROSPA antiserumima ili putem RNAi smanjuje prianjanje B. burgdorferi na crijeva I. skapulara, i na taj način smanjuje bakterijsku kolonizaciju vektora i potencijalni prijenos patogena na domaćina [79]. Kao rezultat ove interakcije, rekombinantna TROSPA je analizirana kod goveda kao antigen vakcina za kontrolu infestacije krpelja i prijenosa patogena, ali nije utjecala na hranjenje krpelja ili plodnost [14].

Akvaporini (AQP) ili transmembranski vodeni kanali igraju glavnu ulogu u homeostazi vode i krioprotekciji [86,87]. Oni su evolucijski visoko konzervirani članovi veće porodice glavnih intrinzičnih proteina. Oni formiraju pore u ćelijskoj membrani koje transportuju vodu ili druge otopljene tvari [86,88,89]. Osim transporta vode i malih neutralnih otopljenih tvari, AQP su uključeni u brojne fiziološke procese [90].

Kod krpelja, AQP su prijavljeni u digestivnom traktu, Malpigijevim tubulima, kao i u pljuvačnim žlezdama [91]. AQP smanjuju volumen krvi domaćina u crijevima krpelja, što je važna fiziološka funkcija budući da krpelji gutaju velike količine krvi u odnosu na njihovu veličinu i težinu [62]. Fragment akvaporina iz R. micro plus natopljenih ženki je izolovan i naknadno proizveden rekombinantno i označen kao RmAQP1 vakcina [62]. Ova vakcina je testirana u dva pokusa sa stočarima na efikasnost protiv R. microplus, pokazujući 68% i 75% efikasnosti. Ovo sugerira da RmAQP1 može biti potencijalni antigen vakcine [62] i da se akvaporini mogu koristiti u vakcinama protiv krpelja [62]. U nedavnoj studiji o RmAQP2 iste vrste, pokazano je da su goveda vakcinisana sintetičkim peptidom ekstracelularnih domena RmAQP2 bila u stanju da smanje broj krpelja koji se hrane do potpunog zasićenja za 25 posto, što sugerira da je ovaj cilj (RmAQP2) može biti korisna komponenta koktela vakcine protiv ujeda krpelja [92].

Druga studija na I. ricinus potvrdila je efikasnost antigena AQP krpelja za kontrolu infestacije krpelja pokazujući efekat vakcinacije IrAQP i CoAQP na larve krpelja I. ricinus kod zečeva. Efikasnost vakcine koja sadrži AQP konzerviranu regiju prisutnu u CoAQP antigenu bila je veća od one IrAQP vakcine [93]. Nadalje, vakcinacija sintetičkim imunogenim peptidima izvedenim iz Ornithodoros erraticus AQP (OeAQP i OeAQP1) pružila je značajnu zaštitu govedima protiv homologne vrste O. erraticus, ali je međuvrstna zaštita od Ornithodoros moubata bila niža [94]. Osim toga, neke druge studije su također identificirale AQP iz različitih vrsta, uključujući O. moubata i Ixodid krpelja, a bioinformatičke analize sugeriraju da ovi AQP imaju dobar potencijal za korištenje kao vakcina. Stoga su potrebni daljnji eksperimentalni dokazi da bi se potvrdio antigenski potencijal ovih AQP [95,96].

I. ricinus je jedna od vrsta krpelja odgovorna za rastuću prevalenciju bolesti koje prenose krpelji kod kućnih ljubimaca u Evropi [4]. Učinak vakcina baziranih na AQP na infestaciju i linjavanje larvi I. ricinus mogao bi rezultirati smanjenjem infestacije krpeljima kod vakcinisanih životinja i podržava da bi CoAQP mogao biti kandidat zaštitni antigen za kontrolu različitih vrsta krpelja koje se hrane istim domaćinom.

Studija koja je koristila imunizaciju ekspresijske biblioteke protiv mišjeg modela infestacije krpeljima pokazala je da je protein 4D8, kasnije nazvan podzakup (SUB), potencijalni antigen koji bi se mogao koristiti kao vakcina protiv I. scapularis [97]. Utvrđeno je da su sekvence gena i proteina SUB očuvane kod beskičmenjaka i kičmenjaka. Osim toga, ovaj gen je identificiran i okarakteriziran u različitim vrstama krpelja i utvrđeno je da je izražen u različitim razvojnim fazama iu različitim tkivima odraslih krpelja [98]. Zbog široke distribucije SUB-a, predloženo je da bude dobar kandidat za antigen vakcinu. Potencijal antigena SUB-a je prethodno istražen kod goveda koristeći rekombinantne proteine, i ustanovljeno je da SUB može zaštititi (51 posto efikasnosti) od krpelja.

Nadalje, kombinacija SUB vakcinacije i autocidne kontrole krpelja nakon uništavanja SUB gena kod krpelja koji su se hranili govedom radi kontrole R. microplus, postigla je efikasnost od 75 posto nakon tretmana [99,100]. Nadalje, Shakya i saradnici su proizveli rekombinantni SUB R. microplus i koristili ovaj rekombinantni protein za imunizaciju goveda. Ovi preživari su potom bili izazvani larvama R. microplus. Osim toga, procijenjena je efikasnost ovog proteina protiv drugog geografski različitog soja krpelja. Efikasnost rekombinantnog SUB kretala se od 32,7 posto do 44,1 posto i ukazala je na visoku homologiju sekvence između sojeva krpelja iz Meksika i Indije [101]. U drugoj studiji, rekombinantni SUB je sintetizovan kao himerni protein sa MSP1a i zatim primenjen na goveda za kontrolu R. microplus.

Iznenađujuće, ovaj himerni protein pokazao je efikasnost od 81 posto [102]. Kao rezultat uspješnih i obećavajućih rezultata SUB primjene, kombinacija ovog antigena sa Bm86 je testirana i pretpostavljeno je da daje bolje rezultate, ali ukupna efikasnost nije podržala upotrebu ove kombinacije kao vakcine. Iako je pokazano da se visoki nivoi specifičnih antitela aktiviraju za svaki antigen kada se dva antigena daju istovremeno, oni se razdvajaju u različite formulacije i koriste na različitim mestima inokulacije kod životinje [103,104].

Ranije poznate kao ligandini, glutation S-transferaze (GST) čine porodicu multifunkcionalnih proteina široko rasprostranjenih u životinjskom carstvu. Ovi enzimski proteini igraju ulogu u unutarćelijskom transportu, probavi, proizvodnji prostaglandina, detoksikaciji endogenih i egzogenih supstanci i odbrani od oksidativnog stresa. Nivoi ekspresije GST-a su povećani u organizmima kada su izloženi insekticidima i akaricidima [105]. Zečji serum koji sadrži poliklonska antitijela protiv GST-a iz R. microplus-a reagirao je s rekombinantnim GST-om H. longicornis i R. appendiculatus, sugerirajući da bi GST-ovi krpelja mogli biti sastavni dio univerzalne vakcine koja štiti od više od jedne vrste krpelja [106] .

Na osnovu ove preliminarne studije, Parizi i saradnici (2011) izolovali su GST iz H. longicornis i proizveli rekombinantni GST, te ga koristili za vakcinaciju goveda protiv R. microplus [107]. Ovo je štitilo goveda od R. micro plus sa efikasnošću od 57 posto. Rekombinantni GST protein je obezbijedio djelomični unakrsni zaštitni imunitet kod domaćina, što sugerira da zaštitni kapacitet GST proteina nije dovoljan, te se stoga čini da upotreba ovog proteina u vakcini s jednim antigenom nije efikasna u sprječavanju infestacije krpelja [ 107].

For more information:1950477648nn@gmail.com