Alternativno, rapamicin modificira mitohondrijalnu dinamiku u dendritskim stanicama kako bi smanjio ishemijsku reperfuzijsku ozljedu bubrega
Feb 22, 2022
sažetak:Dendritične ćelije (DC) su jedinstvene imunološke ćelije koje mogu povezati urođene i adaptivne imunološke odgovore, a imunometabolizam uvelike utječe na njihov fenotip. Rapamicin je makrolidno jedinjenje koje ima imunosupresivne funkcije i koristi se za sprečavanje gubitka transplantata kod transplantacije bubrega. Trenutna studija procijenila je terapeutski potencijal DC tretiranih ex vivo rapamicinom za zaštitububreziu mišjem modelu akutnogpovreda bubrega (AKI). Za jednostruki (S) tretman rapamicinom (Rapa-S-DC), Veh-DC su tretirani rapamicinom (10 ng/mL) 1 h prije LPS-a. Nasuprot tome, višestruki (M) tretman rapamicinom (Rapa-M-DC) bio je izložen 3 tretmana tokom 7 dana. Samo višestruki ex-vivo tretmani rapamicinom kod DC-a izazvali su uporno reprogramiranje mitohondrijalnog metabolizma. Ovi DC su imali 18-put više mitohondrija, imali su skoro 4- puta veće stope potrošnje kiseonika i proizvodili više ATP-a u poređenju sa Veh-DC (kontrolni DC tretirani Veh). Analiza puteva je pokazala da je signalizacija IL10 glavni put koji doprinosi izmijenjenom imunofenotipu nakon tretmana Rapamicinom u poređenju sa nosačem sa značajno nižim citokinima Tnfa, Il1b i Il6, dok su regulatori mitohondrijalnog sadržaja Pgc1a, Tfam i Ho1 ostali povišeni. Kritično, usvajanje transfera DC-a tretiranih rapamicinom na primaoce WT 24 h prije bilateralnogbubregishemija značajno štitibubreziod ozljede sa značajnim 3-strukim poboljšanjem ufunkciju bubrega. Konačno, infuzija DC-a koji sadrže veći broj mitohondrija (tretiranih ex vivo zdravim izolovanim mitohondrijama (10 µg/mL) jedan dan prije) također je djelomično zaštitilabubreziod IRI. Ove studije pokazuju da preventivna infuzija ex-vivo reprogramiranih DC-a koji imaju veći sadržaj mitohondrija ima terapeutski kapacitet da izazove protuupalni regulatorni fenotip za zaštitububreziod povrede.
Ključne riječi:dendritska ćelija; rapamicin; mitohondrije; akutna povreda bubrega; ishemijska reperfuziona povreda
UvodPatobiologija akutnogpovreda bubregaje multifaktorski i uključuje zamršene interakcije izmeđububrežniparenhimske ćelije i imune ćelije [1,2]. Ububreg,konvencionalne dendritičke ćelije (DC) su glavna podskupina imunoloških ćelija i nalaze se intimno u intersticijskom prostoru širombubreg[3–5]. DC su jedan od primarnih tipova ćelija uključenih u urođeni imunitet i neophodni su u pružanju zaštite od patogena. Naš prethodno objavljeni rad koji koristi DC izvedene iz koštane srži pokazao je da terapija DC može regulisati različite urođene i adaptivne imune odgovore povezane s AKI [6,7].
DC-ovi su locirani u velikoj mjeri u svim tkivima, s podskupom DC-a (CD11c plus DC-i) koji se nalaze ububrežniparenhima. Međutim, ovi CD11c plus DC također igraju patogenu ulogu u pogoršanju stanjapovreda bubreganakon ishemijsko-reperfuzijske ozljede (IRI) [8]. IRI se definira kao ozljeda koja je rezultat ponovnog uvođenja oksigenirane krvi u organ nakon perioda ishemije i često se viđa kod infarkta miokarda, moždanog udara i transplantacije solidnih organa. Kao odgovor na IRI, CD11c plus DC sačinjavaju značajan dio infifiltrata upalnih stanica ububrežnitkiva.
DC-ovi su sposobni da prepoznaju molekularne obrasce povezane s patogenom (PAMP) kroz različite receptore za prepoznavanje uzoraka koji se nalaze na površini DC-a, kao što su tolllike receptori (TLR) i NOD-slični receptori. Vezivanje receptora za prepoznavanje uzoraka (PRR) za njihove specifične PAMP-ove rezultira aktivacijom nekoliko puteva, koji uključuju proinflamatorne odgovore, sintezu antimikrobnih peptida i indukciju adaptivnog imuniteta posredovanog limfocitima [9]. Značajna istraživanja posvećena su proučavanju promjena u ćelijskoj bioenergetici DC-a nakon aktivacije PAMP-ovima. Utvrđeno je da aktivacija DC s lipopolisaharidom (LPS; PAMP različit od gramnegativnih bakterija), putem vezivanja za njegov specifični receptor TLR4 dovodi do metaboličke promjene od visoko efikasne oksidativne fosforilacije do procesa vrlo sličnog Warburgovom metabolizmu ili aerobnoj glikolizi. . Varburgov metabolizam karakterizira preusmjeravanje piruvata nastalog glikolizom prema pretvaranju u laktat za proizvodnju energije i dalje od transporta u mitohondrije kako bi se podvrgao katabolizmu putem TCA ciklusa, unatoč dovoljnoj dostupnosti kisika. Jedno objašnjenje za ovu pojavu uključuje jedan od mnogih efekata aktivacije TLR4, a to je povećana aktivnost serin/treonin kinaze, mete rapamicina kod sisara (mTOR). Inhibicija mTOR-a rapamicinom čuva mitohondrijalnu funkciju u aktiviranim DC-ima smanjenjem iNOS-a, pri čemu su DC-ovi tretirani rapamicinom stimulirani u prisustvu LPS-a koji pokazuju smanjene razine aerobne glikolize [10]. mTORC1 inhibitori poput rapamicina se trenutno koriste u transplantaciji čvrstih organa kao moguća alternativa inhibitorima kalcineurina kako bi se izbjegla kroničnabubrežnioštećenje alografta jer takođe ima potencijal da proširi CD4 plus CD25 plus regulatorne T-ćelije [11,12]. Međutim, upotreba rapamicina u transplantaciji može dovesti do upalnih komplikacija koje uključuju periferni edem, povećanje kreatinina i trombocitopeniju. Prethodne studije su pokazale da su štetni efekti hipoksičnih stimulansa pojačani izlaganjem LPS-u i oslabljeni rapamicinom [8,13].
Cilj je razviti metode za korištenje FDA odobrenih lijekova kliničke kvalitete kao što je Rapamycin za induciranje regulatornih DC-a koji mogu kontrolirati neželjene urođene i adaptivne imunološke odgovore. Cilj ove studije bio je utvrditi potencijalni zaštitni mehanizam(e) BMDC-a stimuliranih rapamicinom u pretkliničkom mišjem modelububregIRI. Tretman BMDC ex-vivo rapamicinom izbjegava sve štetne efekte izvan cilja i upalne komplikacije povezane sa sistemskim injekcijama lijekova. Optimalna doza i vrijeme primjene većine farmakoloških spojeva ili lijekova ovise o različitim parametrima. U ćelijama raka niske doze rapamicina u poređenju sa visokim dozama različito inhibiraju mTORC1 i mTORC2 što dovodi do delimičnog ili potpunog inhibicije progresije ćelijskog ciklusa [14]. Za sve naše ex-vivo studije kondicioniranja BMDC-a u trenutnom rukopisu odabrali smo nisku dozu od 10 ng/mL rapamicina na osnovu prethodno prijavljenih studija sa tolerogenim BMDC-ima [15,16]. Vremenski broj doza (tri ili jedna) bio je baziran na našem prethodno objavljenom radu sa razmnožavanjem mišjih BMDC i dodanim GMCSF-om [17,18]. Naši trenutni podaci pokazuju da i pojedinačni i višestruki tretman(i) DC-a rapamicinom izazivaju manje robusne imunogene odgovore (niži citokini i kostimulacijski molekuli) nakon LPS stimulacije. Prijenos jednog ili više DC tretiranih rapamicinom jednako štitibubreziiz IRI u singene (C57BL/6 BMDC→C57BL/6 miševi) ili alogene (BALB/c BMDC→C57BL/6 miševi) modela IRI. Međutim, višestruki ex-vivo tretman rapamicinom (3 tretmana tijekom 7 dana), osim smanjenja imunogenih odgovora, također je povećao broj i funkciju mitohondrija (Seahorse Analyzer) u usporedbi s DC-ovima tretiranim vehikulom. Ova eksperimentalna zapažanja sugeriraju da DC s većim brojem mitohondrija imaju potencijal da postanu regulatorni, a prijenos teza DC-ovi mogu zaštititibubreziod ishemijske povrede. Kao što je pokazala naša nedavna studija koja je koristila DC tretirane FTY720 [18], farmakološke ili mitohondrijalne transplantacije koje induciraju veći broj mitohondrija u imunim stanicama (DC ili makrofagi) također uzrokuju da ove stanice imaju protuupalni fenotip, što je moguće zbog održavanja mitohondrija. oksidativna fosforilacija (OXPHOS) i sa smanjenim prelaskom na glikolizu za energiju nakon stimulacije. Za ove efekte, egzogeno smo povećali broj mitohondrija u DC-ima kako bismo testirali da li veći broj mitohondrija može inducirati regulatorni fenotip korištenjem mitohondrijalnih transplantacija. Prijenos ovih Mito-DC-ova zaštićenbubreziod IRI; međutim, za razliku od Rapa-DC, ovi Mito-DC nemaju smanjene imunogene odgovore (MHCII, kostimulacijski molekuli i citokini) nakon LPS stimulacije, što možda ukazuje da povećanje broja kopija mitohondrija može nadjačati funkcionalne promjene izazvane egzogenom LPS stimulacijom. U ovoj studiji i kao što je prethodno pokazano [6,7,18], sistemski ubrizgani DC (tretirani vozilom, rapamicinom ili mitohondrijama) u dozi od pola miliona uglavnom se nalaze samo u slezeni i malo ili nimalo signala. ububrezi. U slezeni kao što je FTY720-DCs, DC-ovi bogati rapamicinom i mitohondrijama mogu izazvati protuupalni odgovor koji rezultira zaštitom odbubregIRI. Ovi nalazi sjemena pružaju nove dokaze koji sugeriraju da povećanje broja mitohondrija (egzogeno putem transplantacije mitohondrija ili putem farmakološke intervencije (FTY720 ili rapamicin)) u imunološkim stanicama može biti novi terapeutski modalitet za konačno reguliranje njihovih imunoloških odgovora za prevenciju i/ili rano liječenjepovreda bubrega.
Materijali i metode
MiševiSvi postupci i rukovanje životinjama obavljeni su u skladu sa Vodičem Nacionalnog instituta za zdravlje za njegu i upotrebu laboratorijskih životinja, a broj protokola Bajwa UTHSC, 18-080, datum odobrenja 28.09.2018. Tennessee Health Science Center (UTHSC) Institucionalni odbori za negu i upotrebu životinja. Politika njege laboratorijskih životinja slijedi politiku javne zdravstvene službe o humanoj njezi i korištenju laboratorijskih životinja. Svi rezultati se izvještavaju na način u skladu sa smjernicama ARRIVE [19]. Za sve studije transfera C57BL/6J i BALB/c miševi su kupljeni od The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, SAD). Miševi su držani u standardnom vivarijumu sa 12-sat ciklusom svjetlo/mrak na dijeti za jelo i voda je bila slobodno dostupna.
Bubrežna ishemija-reperfuzijska povreda Praćene su sve detaljne hirurške procedure kao što je prethodno objavljeno [18]. C57BL/6 mužjaci miševa (stari 8-12 sedmica) bili su podvrgnuti 26-minutnoj bilateralnoj ishemiji praćenoj reperfuzijom u trajanju od 20-24 sata. Ukratko, svi mužjaci miševa su anestezirani intraperitonealnom (ip) injekcijom mješavine ketamina i ksilazina, uz subkutanu injekciju buprenorfina i stavljeni na topli jastučić kako bi se održala tjelesna temperatura na 34,5–36 ◦C. Miševi su zatim randomizirani na lažno ili IRI operativno stanje. Urađena je bilateralna incizija sa strane. Tjelesna temperatura je kontrolirana i održavana tokom cijelog ishemijskog perioda. Šamoperisani miševi su podvrgnuti istom postupku osim stezanja krvnih sudova i zatvaranja hirurških rana. Miševi koji su ga imalibubregbez reperfuzije 24 h nakon ishemije isključeni su iz svih analiza.
Procjena funkcije bubrega i histologijaKrv je uzeta pod anestezijom iz retroorbitalnog sinusa, a kreatinin u plazmi (mg/dL) određen je enzimskom metodom uz manje modifikacije protokola proizvođača (Diazyme Laboratories, Poway, Kalifornija, SAD) i dušik u urinu (BUN) ) i mjerenje kreatinina je izvršeno korištenjem QuantiChrom Urea Assay Kit-a (DIUR-100, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) kao što je prethodno opisano [18,20]. Za histologiju,bubrezifiksirani su preko noći u 4 posto PLP ili 10 posto formalina i ugrađeni u parafin.Bubrezipripremljeni su za H&E bojenje kao što je prethodno opisano [18], a fotografije su snimljene sa podešavanjem svjetline/kontrasta napravljenim pomoću EVOS mikroskopa (Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, SAD). Za kvantifikaciju rezultata tubularne ozljede, presjeci su procijenjeni brojanjem procenta tubula koji su pokazali nekrozu ćelija, gubitak ruba četkice, formiranje gipsa i proširenje tubula kako slijedi: 0=normalno; 1=Manje ili jednako 10 posto; 2=10 do 25 posto; 3=26 do 50 posto; 4=51 do 75 posto; 5=Veće ili jednako 75 posto . Pet do 10 polja iz svake vanjske moždine je procijenjeno i bodovano na slijepi način. Histološka promjena je izražena kao akutna tubularna nekroza (ATN), ocijenjena kao što je prethodno opisano [7,21]. Apoptotične ćelije su otkrivene TUNEL testom (in situ komplet za otkrivanje smrti ćelija, TMR Red; Roche, Basel, Švajcarska) prema uputstvima proizvođača.
Kultura koštane srži (BM)-izvedene-dendritske ćelije (DC) i adaptivni transfer8–10 sedmica stari C57BL/6J ili BALB/c WT mužjaci miševa korišteni su za generiranje DC-a iz cijelih prekursora BM [22]. Supernatant bogat GMCSF-om izveden je iz J558L ćelija koje su stabilno transfektovane mišjim GMCSF-om. Ćelijska linija je velikodušan poklon dr. Ira Mellman (Odjel za biologiju, Yale University, New Haven, CT, SAD). Ukratko, svježe izolirani BM kultiviran je sa 6 ng/mL rekombinantnog mišjeg GMCSF-a (ukupno 3 tretmana) tokom 8 dana u RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Optimalna doza od 10 ng/mL rapamicina je određena nakon testiranja različitih doza (0,1-10 ng/mL). BMDC su tretirani sa 10 ng/mL rapamicina (Sigma, St. Louis, MO, SAD) za ukupno tri tretmana ili 1-tretman preko noći). BMDC su tretirani lipopolisaharidom TLR4 agonistom (LPS; Escherichia coli serotip 0111:B4: 100 ng/mL; Sigma-Aldrich); ili vehikulum (1 × PBS) tokom 24 h u medijumu kulture za singene studije (C57BL/6J BMDCs→C57BL/6J miševi) i ostavljen netretiranim za alogene studije (BALB/c BMDCs→C57BL/6J miševi). Ćelije su isprane i 0,5 × 106 ćelija po mišu je intravenozno (iv) ubrizgano naivnim miševima 1 dan prije bilateralnogbubregIRI. BMDC-ovi su označeni sa MitoTracker CMXRos Red ili MitoTracker Deep Red (100 nM, 30 min pri 37 ◦C, Invitrogen) ili Mitosoxom (5 µM; 10 min pri 37 ◦C; Invitrogen).
Kvantitativni PCR u realnom vremenuRelativni nivo ekspresije mitohondrijalne DNK (mtDNA) mjeren je kako je prethodno opisano [23]. Ukratko, ukupna genomska DNK je izolirana i jednake količine (5 ng) korištene su za RTPCR korištenjem ND1 kao surogat prajmera za mtDNA i HK2 prajmera za nuklearnu DNK (nDNK) za miša i ND6 za ljudsku mtDNK kao što je prethodno opisano [23,24]. Ukupna RNK je izolovana i reverzno transkribovana u cDNK, a RT-PCR je izveden kao što je prethodno opisano [7,25,26].
Izolacija i kvantifikacija mitohondrijaMitohondrije su izolovane iz ćelija HEK293 kao što je prethodno opisano [18]. Ukratko, 60 cm ploče sa HEK293 ćelijama sakupljene su dodavanjem 5 mL pufera za homogenizaciju (300 mmol/L saharoze, 10 mmol/L HEPES-KOH, 1 mmol/L EGTA-KOH, pH 7,4) sa 1 mg subtilizin A proteaze iz Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich). Detaljan protokol za izolaciju mitohondrija može se naći u našem prethodno objavljenom rukopisu [18].
2Bioanalizator fluksa SeahorseSedam dana stari BMDC su prebačeni u ploče za kulturu tkiva Seahorse 24-, izmjerena je stopa potrošnje kiseonika (OCR), a parametri su izračunati kako je prethodno opisano [25] sa sljedećom modifikacijom. Nakon mjerenja bazalne brzine disanja, oligomicin (Sigma; 2 µM), FCCP (Sigma; 1,5 µM; karbonil cijanid 4- (triffluorometoksi)-fenilhidrazon (FCCP)) i inhibitori lanca transporta elektrona (kompleks I i III), rotenon (Sigma; 0.5 µM) i antimicin A (Sigma; 0.5 µM)) su ubrizgavani uzastopno tokom testa. Bazalno mitohondrijsko disanje, ATP-vezano disanje, curenje protona (potrošnja kisika koja nije vezana za ATP), maksimalno disanje, ne-mitohondrijsko disanje, rezervni respiratorni kapacitet, omjer kontrole disanja i efikasnost spajanja određeni su u cijelim ćelijama prema Brandu i sur. . [27]; N=4–5 bunara je korišteno za svaku eksperimentalnu grupu i eksperimenti su ponovljeni najmanje 3 puta.
Protočna citometrijska analiza, Western blot i ELISAPrikupljanje podataka protočne citometrije izvedeno je na FACS Caliburu (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornija, SAD) sa Cytek {{0}} nadogradnjom protočne citometrije u boji (Cytek Development, Inc., Fremont, CA, SAD). Podaci su analizirani pomoću FlowJo softvera 9.0 (Tree Star, Ashland, OR, SAD) kao što je prethodno opisano [6,7,28]. Za ELISA medijum je sakupljen iz BMDC-a 24 h nakon tretmana sa 100 ng/mL LPS. Nivoi TNF, IL6 ili IL10 mjereni su korištenjem mišjih ELISA kompleta (Invitrogen) prema protokolu proizvođača i kao što je prethodno opisano [18]. Veh- ili Mito-DC tretirani sa i bez LPS-a tokom 6 ili 24 sata korišteni su za izolaciju ukupnog proteina korištenjem RIPA pufera za lizu dopunjenog koktelom inhibitora proteaze i fosfataze (Thermo Fisher Scientifific, Vernon Hills, IL, SAD). Za GAPDH lizat supernatanti su ili prokuvani (10 min na 100 ◦C) i lizati su ostavljeni na sobnoj temperaturi 10 min za OXPHOS koktel glodara (Abcam, Cambridge, MA, USA) [18]. Detaljnije metode su prethodno opisane [18].
Podaci i statistička analizaZa analizu i prezentaciju podataka korišten je GraphPad Prism 8 (GraphPad Inc., San Diego, CA, SAD). Podaci su analizirani, nakon transformacije ako je potrebno da se generiše normalna distribucija, 2-tailed t testom ili 1-way ANOVA sa post-hoc analizom prema potrebi. Dvostrani nespareni t test je korišten za analizu dvije grupe. p Manje ili jednako 0.05 je korišteno za označavanje značaja.
Rezultati
Višestruki tretmani rapamicinom (Rapa-M) izazivaju veći broj mitohondrija i manje imunogenih DC-aC57BL/6 WT DC izolovani su i razmnožavani 8 dana u prisustvu GMCSF i vehikuluma (1X PBS) ili rapamicina (10 ng/mL), ukupno tri tretmana. DC su tretirani sa 100 ng/mL LPS preko noći. DC-ovi tretirani LPS-om su korišteni za RNASeq ili označeni raznim mitohondrijskim bojama. Podaci RNASeq potvrdili su prethodne podatke da liječenje rapamicinom inducira manje imunogenih DC sa nižim pro-upalnim citokinima koji reguliraju urođene i adaptivne imune odgovore s IL10 kao glavnim promjenjivim putem (Slika S1A, B i Tablica S1 u dodatnom materijalu). U poređenju sa tretmanom vehikulom, tretman rapamicinom povećao je sadržaj mitohondrija u BMDC-ima (Slika 1A) kao što je provereno sa MitoTracker CMXRos Red (50 nM) sa i bez LPS. Slično tome, bilo je značajno veće označavanje sa MitoTracker Deep Red (100 nM) i značajno niže označavanje sa MitoSoxom (5 µM) i nakon noćne LPS stimulacije u Rapa-M-DC u poređenju sa Veh-DC (Slika 1B,C). Polukvantifikacija histograma MFI za sve mitohondrijske boje (slika 1D). Osim toga, Veh- i Rapa-M-DC su bojeni korištenjem JC-1 kako bi provjerili je li tretman Rapamycinom promijenio potencijal membrane mitohondrija. Višestruki tretman rapamicinom ne mijenja bazni potencijal mitohondrijske membrane u usporedbi s kontrolnim BMDC-ovima tretiranim nosačem, kao što je prikazano imunofluorescencijom (Slika S2A dopunskog materijala) i protočnom citometrijom (Slika S2B,C dopunskog materijala).
(Veh) i označen sa (A) MitoTracker CMXRos (50 nM) ili (B) MitoSox (5 µM) ili (C) MitoTracker tamnocrvena (100 nM) . (D) Polukvantifikovana analiza MFI mitohondrijskih boja označenih podataka protočne citometrije. (E) DC-ovi su zasijani u analizator Seahorse XF-24e, stimulirani sa i bez LPS-a tokom 24 h, a brzina potrošnje kiseonika (OCR) je određena tokom sekvencijalnih tretmana oligomicinom (1), FCCP (2) i antimicin A/rotenon (3). (F) Kvantifikacija bazalne proizvodnje OCR-a i ATP-a. (G) Nivoi mRNA Pgc1a i Tfam u Veh-DC i Rapa-M-DC tretirani sa 100 ng/mL LPS ili ostavljeni nestimulirani 24 h. (H) Analiza protočne citometrije MHC II, kostimulacijskih molekula (CD40/80/86) i ekspresije PDL1 određena je sa i bez LPS stimulacije. (I) ELISA IL10, IL6 i TNF iz Veh-DC i Rapa-M-DC tretiranih sa 100 ng/mL LPS tokom 24 h. (J–L) nivoi mRNA Il10, Tnfa i Il6 u Veh-DC i Rapa-M-DC tretirani sa 100 ng/mL LPS ili ostavljeni nestimulirani 24 h. * p Manje ili jednako 0,05, ** p Manje ili jednako 0,01 i *** p Manje ili jednako 0,001, jednosmjerna ANOVA praćena Tukeyjevim post-testom. Podaci predstavljaju srednje vrijednosti ± SEM od tri primjerka.
Promijenjena mitohondrijska funkcija, bioenergetska analiza je procijenjena korištenjem Seahorse Bioanalyzer. Kao što je ranije objavljeno [18], LPS je smanjio potrošnju kiseonika u poređenju sa Veh kontrolama u Veh-DC kao što se i očekivalo (Slika 1E, plava do crna linija). Zanimljivo je da rapa-M DC sa ili bez LPS-a imaju viši bazalni OCR (Slika 1E, zelena do plava linija u trenutku nula). Rapa-M-DC je pokazao neuspjeh u povećanju maksimalnog respiratornog kapaciteta nakon FCCP injekcije u nestimulisane ćelije koje je održavano LPS stimulacijom, pokazujući da rapamicin ablatira rezervni respiratorni kapacitet, kao što je naš prethodno objavljen rad sa FTY-DC [18]. DC-ovi tretirani LPS-om su smanjili proizvodnju ATP-a mjereno OCR-om (plavo do crno) u poređenju sa Veh-DC-ovima. Rapa-M-DC je pokazao značajno veću proizvodnju ATP-a u poređenju sa Veh-DC iu nestimulisanim i LPS-stimulisanim DC-ima (Slika 1F). Rapa-M-DC su pokazali povišene nivoe mRNA za gama koaktivator receptora aktiviranog proliferatorom peroksizoma 1-alfa (Pgc1a) u poređenju sa Veh-DC (slika 1G) i ekspresiju gena za Pgc1a i mitohondrijski transkripcijski faktor A (Tfam ) su održavani u Rapa-M-DC nakon LPS stimulacije. Ovi podaci ukazuju da je razmnožavanje BMDC-a u prisustvu rapamicina povećalo sadržaj mitohondrija, bazalni OCR i proizvodnju ATP-a.
Testirati da li je rapamicin osim povećanja broja i funkcije mitohondrija također izazvao promjenu u DC kostimulacijskim molekulima nakon testiranja LPS-a. Zanimljivo je da nakon LPS tretmana, Rapa-M-DC ima značajno niže nivoe ekspresije kostimulativnih molekula prezentacije antigena (CD80, CD86 i CD40), MHCII i PDL1 u poređenju sa Veh-DC (Slika 1H, plava naspram crvene). Zanimljivo je da su Rapa-M-DC imali slične nivoe ekspresije za PDL1 u poređenju sa Veh-DC, ali su imali značajno povećanje omjera PDL1/CD86 nakon LPS stimulacije u poređenju sa Veh-DC tretiranim LPS gdje je PDL1/CD{{ 18}} smanjeno (Veh/Veh 0.59 ± 0.03 vs. Veh/LPS 0.43 ± 0.{{33 }}02, p < 0.001="" i="" rapa/veh="" 0,56="" ±="" 0,001="" naspram="" rapa/lps="" 0,73="" ±="" 0,02,="" p="">< 0,05).="" nisu="" primijećene="" nikakve="" značajne="" promjene="" u="" ekspresiji="" cd11c="" između="" veh-="" i="" rapa-m-dc,="" iako="" je="" rapa-m-dc="" imao="" niži="" bočni="" scatter="" signal="" što="" ukazuje="" na="" manju="" veličinu="" ćelija="" nakon="" lps="" stimulacije="" (podaci="" nisu="" prikazani).="" rapa="" m-dc="" su="" imali="" više="" relativne="" nivoe="" mtdna/ndnk="" u="" poređenju="" sa="" veh-dc="" (105,7="" ±="" 8,7="" naspram="" 196,8,9="" ±="" 49,3),="" što="" pokazuje="" da="" tretman="" rapamicinom="" povećava="" broj="" dc="" mitohondrija.="" rapamicin="" je="" značajno="" smanjio="" ekspresiju="" gena="" lps-indukovanih="" il6,="" il10="" i="" tnfa="" i="" koncentracije="" proteina="" tnf="" i="" il6,="" ali="" je="" zadržao="" više="" nivoe="" il10="" u="" poređenju="" sa="" veh-dc="" tretiranim="" lps-om="" (slika="" 1i–l).="" drugi="" geni="" za="" koje="" se="" zna="" da="" su="" regulirani="" rapamicinom="" (autofagija="" ili="" upala)="" navedeni="" su="" u="" tablici="" s2="" dodatnog="" materijala.="" geni="" nakon="" lps-a="" označeni="" zelenom="" bojom="" su="" bili="" smanjeni,="" a="" crvenom="" regulacijom="" naviše="" u="" poređenju="" sa="" odgovarajućim="" tretmanom="">
Transfer Rapa-M-DC štiti bubrege od ishemijske ozljedeSvi DC su aktivirani sa 100 ng/mL LPS prije transfera u svim singenetičkim studijama (C57BL/6 BMDC→C57BL/6 miševi). Pola miliona DC je ubrizgano 1 dan prije 26-min bilateralnobubregIRI. Šema dizajna studije (slika 2A). Kao kontrola, miševima je ubrizgan 1 × PBS kao kontrola bez ćelija (NC). U poređenju sa miševima tretiranim NC i Veh-DC, miševi tretirani Rapa-M-DC značajno su štitilibubreziod povrede, kreatinin u plazmi (Slika 2B); slične promjene u BUN-u uočene su kod ovih miševa [Sham 41,30 ± 3,4 vs NC 159,75 ± 3,2 vs Veh-DC 151,82 ± 1,5 vs Rapa-M-DC 114,68 ± 16,3; p < 0,05="" nc="" ili="" veh-dc="" vs="" rapa-m-dc].="" morfološke="" promjene="" (slika="" 2c,d)="" paralelne="" su="" funkcionalnim="" studijama.="" miševi="" tretirani="" rapa-m-dcs="" imaju="">bubregNivoi mRNA Kim1 [Veh DC 0.016 ± 0.009 vs Rapa-M-DC {{2{{23} }}}.001 ± 0.002], Ngal [Veh-DC 2,14 ± 1,2 vs Rapa-M-DC 0,12 ± 0,09] i Tnfa [Veh-DC 0,19 ± 0,15 vs Rapa-M-DC 0,0005 ± 0,0002] u poređenju sa miševima tretiranim Veh-DC. U ovim studijama, i kao što je prethodno pokazano [6,7,17,18], miševi tretirani Veh-DC u dozi od pola miliona imaju uporedive promjene ufunkciju bubregaibubregcitokinski profil. U studijama singenog transfera, miševi tretirani Rapa-M-DC su imali smanjenu apoptozu (terminalna deoksinukleotidil transferaza posredovana digoksigenin deoksiuridin nick-end označavanje [TUNEL]) u poređenju sa miševima tretiranim Veh-DC (Veh-DC 3,8 ± 1,4 u odnosu na Rapa- M-DC 1.1 ± 0.6; p < 0.05);="" reprezentativne="" slike="" iz="" tunel="" analize="" prikazane="" su="" na="" dodatnom="" materijalu="" slika="" s3.="" zanimljivo="" je="" da="" nije="" bilo="" značajnih="" promjena="" u="" broju="" infifiltrirajućih="" neutrofila="" kod="" miševa="" tretiranih="" rapa-m-dc="" u="" poređenju="" sa="" veh-dc="" (podaci="" nisu="" prikazani),="" što="" sugerira="" da="" miševi="" tretirani="" rapa-m-dc="" možda="" neće="" imati="" nikakve="" promjene="" u="" hemokinima,="" iako="" funkcija="" ovih="" infiltrirajućih="" ćelija="" urođenog="" imuniteta="" može="" biti="">
Pojedinačni tretman rapamicinom (Rapa-S) izaziva manje imunogenih DC-a bez promjene mitohondrijalne dinamikeZatim smo testirali da li je jedan tretman rapamicinom bio dovoljan za indukciju regulatornog fenotipa, čime je izvodljivost induciranja regulatornog fenotipa DC-a bila klinički relevantnija. WT DC su izolovani i razmnoženi 8 dana u prisustvu GMCSF-a, ukupno tri tretmana. Sedmodnevni DC su tretirani rapamicinom (10 ng/mL) prije tretmana sa 100 ng/mL LPS-a za inkubaciju preko noći i označeni sljedeći dan sa MitoTracker CMXRos Crvena (50 nM). U poređenju sa tretmanom nosačem, tretman Rapa-S ne menja sadržaj mitohondrija u BMDC (slika 3A) sa i bez LPS. Slično, nije bilo promjene u označavanju sa MitoTracker Deep Red (100 nM) i MitoSoxom (5 µM) i nakon noćne LPS stimulacije u Rapa-S-DC u poređenju sa Veh-DC (Slika 3B,C). Polukvantifikacija histograma MFI za sve mitohondrijske boje (slika 3D). Slično, u analizi višestrukog tretmana, Veh- i Rapa-S-DC-ovi su bojeni korištenjem JC{{20}} kako bi se provjerilo da li pojedinačni tretman rapamicinom mijenja potencijal membrane mitohondrija. Pojedinačni tretman rapamicinom ne mijenja bazni potencijal mitohondrijske membrane u usporedbi s kontrolnim BMDC-ovima tretiranim nosačem, kao što je prikazano imunofluorescencijom (Slika S2A dopunskog materijala) i protočnom citometrijom (Slika S2B,C dopunskog materijala). LPS je smanjio potrošnju kiseonika u poređenju sa Veh kontrolama u Veh-DC kao što se i očekivalo (Slika 3E, plava do crna linija). Rapa-S-DC nisu imali promjene u bazalnom OCR-u (slika 3E, zelena do plava linija u nultom vremenu). Kada je proizvodnja ATP-a kvantificirana, LPS je smanjio proizvodnju ATP-a mjereno OCR-om (plavo do crno) u Veh-DC i Rapa-S-DC (slika 3F). Međutim, Rapa-S-DCs su pokazali povišene nivoe mRNA za Pgc1a u poređenju sa Veh kontrolama, i ovi nivoi su održani u Rapa-S-DCs nakon LPS-a (Slika 3G), uočena je mala ili nikakva promjena u nivoima transkripta Tfam. Zatim smo testirali je li jedno liječenje rapamicinom izazvalo promjenu u DC kostimulacijskim molekulima nakon LPS-a. Zanimljivo je da nakon tretmana LPS, Rapa-S-DC ima značajno niže nivoe ekspresije kostimulativnih molekula prezentacije antigena (CD80, CD86 i CD40), MHCII, i PDL1 u poređenju sa Veh-DC (Slika 3H). Rapa-S-DC su imali sličan nivo ekspresije za PDL1 u poređenju sa Veh-DC i imali su slično značajno smanjenje omjera PDL1/CD86 nakon LPS stimulacije u poređenju sa Veh-DC (Veh/Veh 0). 59 ± 0,03 vs Veh/LPS 0,43 ± 0,002, p < 0,001="" i="" rapa-s/veh="" 0,69="" ±="" 0,02="" vs="" rapa-s/lps="" 0,56="" ±="" 0,008,="" p="">< 0,05).="" pojedinačni="" tretman="" rapamicinom="" značajno="" je="" smanjio="" ekspresiju="" gena="" il6,="" il10="" i="" tnfa="" izazvane="" lps-om,="" zajedno="" sa="" nižim="" koncentracijama="" proteina="" il10="" sa="" malom="" ili="" nikakvom="" promjenom="" u="" tnf-u="" i="" nakon="" liječenja="" lps-om="" (slika="" 3i–l).="" drugi="" poznati="" geni="" koje="" treba="" regulisati="" rapamicinom="" (autofagija="" [beclin,="" atg7,="" atg9,="" lc3b="" i="" lamp2]="" ili="" upala="" [il1b,="" il12p40,="" tlr4,="" nos2,="" hif1a="" i="" ho1])="" samo="" su="" djelomično="" regulirani="" u="" usporedbi="" s="" dc-ovima="" sa="" dodatkom="" vozila="" nakon="" stimulacije="" lps-a.="" tabela="" materijala="">
Transfer Rapa-S-DC štiti bubrege od ishemijske ozljedeSvi DC su aktivirani sa 100 ng/mL LPS ili tretirani rapamicinom (10 ng/mL) prije transfera u svim singenim studijama (C57BL/6 BMDC→C57BL/6 miševi). Pola miliona DC je ubrizgano 1 dan prije bilateralnebubregIRI. Šema dizajna studije (Slika 4A). Kao kontrola, miševima je ubrizgan 1 × PBS kao kontrola bez ćelija (NC). U poređenju sa miševima tretiranim Veh-DC, miševi tretirani Rapa-S-DC značajno su štitilibubreziod povrede kreatinina u plazmi (slika 4B); slične promjene u BUN-u uočene su kod ovih miševa [Veh-DC 151,82 ± 1,5 vs Rapa-S-DC 139,53 ± 3,8]. Morfološke promjene (Slika 4C,D) uporedile su funkcionalne studije. Miševi tretirani Rapa-S-DCs imaju nižebubregNivoi mRNA Kim1 [Veh-DC 0.016 ± 0.{{10}}{{20}}9 vs Rapa -S-DC 0.004 ± 0,002], Ngal [Veh DC 2,14 ± 1,2 vs Rapa-S-DC 0,14 ± 0,008] i Tnfa [Veh-DC 0,196 ± 0,15 vs Rapa-S-DC 0,0017 ± 0,001] u poređenju sa miševima tretiranim Veh-DC.
Alogeni BMDC prijenos Rapa-M-DC ili Rapa-S-DC jednako štiti bubrege od ishemijske ozljedePola miliona DC je ubrizgano 1 dan ranije bilateralnobubregIRI za alogene (BALB/C BMDC→C57BL/6 miševi) studije transfera. Šema dizajna studije (Slika 5A). Kao kontrola, miševima je ubrizgan 1x PBS kao kontrola bez ćelija (NC). U poređenju sa miševima tretiranim Veh-DC, miševi tretirani Rapa-M-DC ili Rapa-S-DC značajno su štitilibubreziod povrede (Slika 5B). Morfološke promjene (Slika 5C,D) paralelne su funkcionalnim studijama. Miševi liječeni rapamicinom DC imaju nižebubregNivoi mRNA Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.{{10}}2 vs Rapa-M-DC 0. 005 ± 0.0{{30}}2 protiv Rapa-S-DC 0.{{37} 05 ± 0.0002], Ngal [Veh-DC 0,57 ± 0,3 vs RapaM-DC 0,19 ± 0,11 vs Rapa- S-DC 0,05 ± 0,01] i Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 vs Rapa-M-DC 0,007 ± 0,003 vs Rapa-S-DC 0,008 ± 0,005] u poređenju sa miševima tretiranim Veh-DC. U studijama alogenog transfera, miševi tretirani Rapa-M-DC ili Rapa-S-DC su imali smanjenu apoptozu TUNEL u poređenju sa miševima tretiranim Veh-DC (Veh-DC 16,7 ± 8,2 naspram Rapa-M-DC 7,2 ± 2,5 vs Rapa- S-DC 9,1 ± 0,1).
DC napunjeni egzogenim mitohondrijama (Mito-DC) s višom mitohondrijskom dinamikom i više imunogenog fenotipa nakon LPS stimulacijeWT DC su izolovani i razmnoženi 8 dana u prisustvu GMCSF, ukupno 3 tretmana. Sedmodnevni DC su tretirani preko noći sa ljudskim egzogenim mitohondrijama (10 µg/mL). U poređenju sa tretmanom nosačem, DC tretirani mitohondrijama Mito-DC imaju veće mitohondrije. Mitohondrije su izolovane iz ljudske ćelijske linije HEK293. BMDC-ovi su analizirani na prisustvo ljudskih mitohondrija u mišjim WT DC-ovima korištenjem humanih mtDNA prajmera za NADH dehidrogenazu (ND). Relativni ljudski sadržaj [mtDNA] u Veh-DC bio je {{10}}.26 ± 0.10 naspram 16.8 ± 0.59; p < 0,001,="" povećanje="" 63-puta="" u="" genomskoj="" dnk="" izolovanoj="" iz="" bmdc.="" ograničenje="" trenutnog="" testa="" je="" to="" što="" mjeri="" ljudsku="" ili="" mišju="" mtdnk="" u="" odnosu="" na="" nuklearnu="" dnk,="" a="" mala="" količina="" ljudske="" mtdnk="" otkrivena="" u="" veh-dc="" mogla="" bi="" biti="" posljedica="" manjeg="" preklapanja="" u="" sekvenci="" nd="" u="" pcr="" testu="" ili="" mogućnosti="" jer="" smo="" pokazujući="" relativnu="" ekspresiju="" mišje="" nuklearne="" dnk.="" kako="" bi="" se="" utvrdilo="" da="" li="" veći="" sadržaj="" mitohondrija="" također="" mijenja="" funkciju="" mitohondrija,="" bioenergetska="" analiza="" je="" poduzeta="" korištenjem="" seahorse="" bioanalyzer.="" lps="" je="" smanjio="" potrošnju="" kiseonika="" u="" poređenju="" sa="" veh="" kontrolama="" u="" veh-dc="" kao="" što="" se="" očekivalo="" (slika="" 6a,="" plava="" do="" crna="" linija).="" mito-dc="" imaju="" viši="" bazalni="" ocr="" (slika="" 6a,="" zelena="" do="" plava="" linija="" u="" trenutku="" nula).="" nakon="" tretmana="" fccp-om="" za="" odvajanje,="" mito-dc="" je="" pokazao="" neuspjeh="" u="" povećanju="" maksimalnog="" respiratornog="" kapaciteta="" u="" nestimuliranim="" stanicama="" koji="" je="" održavan="" lps="" stimulacijom,="" pokazujući="" da="" tretman="" s="" izolovanim="" mitohondrijama="" umanjuje="" rezervni="" respiratorni="" kapacitet="" (vjerovatno="" zato="" što="" je="" već="" pri="" maksimalnom="" ocr-u="" u="" bazalnom="" stanju).="" kada="" je="" proizvodnja="" atp-a="" kvantificirana,="" lps="" je="" smanjio="" proizvodnju="" atp-a="" mjereno="" ocr-om="" (plavo="" do="" crno)="" u="" veh-dc-ovima.="" mito-dc="" je="" pokazao="" značajno="" veću="" bazalnu="" proizvodnju="" ocr-a="" i="" atp-a="" u="" poređenju="" sa="" veh-dc="" kod="" lps-stimuliranih="" dc-a="" (slika="" 6b).="" mito-dcs="" su="" pokazali="" povišene="" nivoe="" mrna="" za="" pgc1a="" i="" zanimljivo="" značajno="" niži="" tfam="" u="" poređenju="" sa="" veh="" kontrolama="" (slika="" 6c).="" razlike="" u="" pgc1a="" i="" tfam="" u="" ovom="" skupu="" eksperimenata="" nakon="" lps="" stimulacije="" u="" poređenju="" sa="" podacima="" na="" slikama="" 1="" i="" 3="" su="" vjerovatno="" posljedica="" upotrebe="" balb/c="" bmdc.="" u="" poređenju="" sa="" c57bl/6="" bmdc,="" dc="" iz="" balb/c="" imaju="" značajne="" promjene="" u="" proizvodnji="" mitohondrija="" i="" citokina="" nakon="" stimulacije="" [29,30].="" mogućnost="" zbog="" ovih="" promjena="" u="" dc-ima,="" istorijski="" smo="" koristili="" duže="" ishemijsko="" vrijeme="" kod="" balb/c="" miševa="" u="" poređenju="" sa="" c57bl/6="" da="" imamo="">bubregpovreda [6,18]. Ovi podaci pokazuju da prijenos egzogenih zdravih mitohondrija dovodi do povećanog sadržaja mitohondrija, bazalnog OCR-a i proizvodnje ATP-a. Ovo sugerira potencijal za protuupalni fenotip u DC nakon tretmana egzogenim mitohondrijama, kao što je prikazano u našoj prethodnoj studiji [18]. Zatim, testiramo jesu li DC tretirani egzogenim mitohondrijima koji rezultiraju povećanim brojem i funkcijom mitohondrija također inducirali promjenu u DC kostimulacijskim molekulima nakon LPS-a. Zanimljivo je da sa i bez LPS stimulacije, Mito-DC ima značajno više nivoe ekspresije kostimulativnih molekula prezentacije antigena (CD80, CD86 i CD40), MHCII i PDL1 u poređenju sa Veh-DC (slika 6D). Štaviše, Mito-DC su imali viši nivo ekspresije za PDL1 u poređenju sa Veh-DC; međutim, oni su također imali povećanje omjera PDL1/CD86 nakon LPS stimulacije u odnosu na Veh-DC tretirane LPS (podaci nisu prikazani). Mito-DC je imao značajno smanjenu ekspresiju gena LPS-induciranog Tnfa, ali veću ekspresiju gena Il6 i Il10 u poređenju sa Veh-DC i niže koncentracije proteina TNF i IL10, ali je održavao više nivoe IL6 u poređenju sa Veh-DC tretiranim LPS (slika 6E –H). Drugi geni za koje se zna da su regulirani mitohondrijama (autofagija [Beclin, Atg7, Atg9, Lc3b i Lamp2] ili upala [Il1b, Il12p40, Tlr4, Nos2, Hif1a i Ho1]) bili su djelomično regulirani nakon LPS stimulacije materijala (Sup3). Veh-DC i Mito-DC su tretirani LPS tokom 6 i 24 sata. Izmjerene su relativne promjene u mitohondrijskom kompleksu. Mito-DC tretirani sa i bez LPS-a imaju značajno više nivoe proteina mitohondrijalnih kompleksa IV, II i I i značajno niže nivoe kompleksa V i III u poređenju sa Veh-DC (Slika 6I). Semi-kvantitativna analiza relativne ekspresije proteina mitohondrijalnih kompleksa u GAPDH (slika 6J). Mrlje pune dužine date su kao dodatne slike (slike dodatnog materijala S4-S7).
Slika 6. DC napunjeni mitohondrijama (Mito-DC) imaju veću mitohondrijalnu funkciju i imunogenost nakon LPS stimulacije u poređenju sa Veh-DC. Sedam dana stari Veh-DC i inkubirani su sa 10 µg/mL HEK293 mitohondrija jedan dan prije tretmana sa 100 ng/mL LPS dodatnih 24 h ili ostavljeni nestimulirani ( Veh). (A) 24 h nakon dodavanja mitohondrija, DC-ovi su zasijani u Seahorse XF{10}}e analizator, stimulirani sa i bez LPS-a tokom 24 h, a brzina potrošnje kisika (OCR) je određena tokom uzastopnih tretmana oligomicinom (1 ), FCCP (2) i antimicin A/rotenon (3). (B) Kvantifikacija bazalne proizvodnje OCR-a i ATP-a. (C) Nivoi mRNA Pgc1a i Tfam u Veh-DC i Mito-DC tretirani sa 100 ng/mL LPS ili ostavljeni nestimulirani 24 h. (D) Analiza protočne citometrije MHCII, kostimulacijskih molekula (CD40/80/86) i ekspresije PDL1 određena je sa i bez LPS stimulacije. (E) ELISA IL10, IL6 i TNF iz Veh-DC i Mito-DC tretiranih sa 100 ng/mL LPS tokom 24 h. (F–H) nivoi mRNA Tnfa, Il6 i Il10 u Veh-DC i Mito-DC tretirani sa 100 ng/mL LPS ili ostavljeni nestimulirani 24 h. Podaci predstavljaju srednje vrednosti ± SEM, * p manje ili jednako 0,05, ** p manje ili jednako 0,01 i *** p manje ili jednako 0,001, jednosmerna ANOVA praćena Tukeyjevim post-testom. Podaci predstavljaju srednje vrijednosti ± SEM od tri primjerka.
Alogeni BMDC prijenos Mito-DC štitiBubreziod ishemijske povrede Pola miliona DC je ubrizgano 1 dan prije bilateralnebubregIRI za Mito-DC alo genetičke (BALB/C BMDC→C57BL/6 miševi) studije transfera. Šema dizajna studije (Slika 7A). Kao kontrola, miševima je ubrizgan 1x PBS kao kontrola bez ćelija (NC). U poređenju sa miševima tretiranim Veh-DC, miševi tretirani Mito-DC značajno su štitilibubreziod povrede (Slika 7B). Morfološke promjene (slika 7C,D) paralelne su funkcionalnim studijama. Miševi tretirani Mito-DC imaju nižebubregNivoi mRNA Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.02 vs Mito-DC 0.02 ± 0.01], Ngal [Veh-DC 0.57 ± 0.3 vs Mito-DC 0.39 ± {{29} },20] i Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 vs Mito-DC 0,0028 ± 0,0013] u poređenju sa miševima tretiranim Veh-DC. U studijama alogenog transfera, miševi tretirani Mito-DC imaju smanjenu apoptozu TUNEL u poređenju sa miševima tretiranim Veh-DC (Veh-DC 16,7 ± 8,2 naspram Mito-DC 3,0 ± 1,2).
Diskusija U trenutnoj studiji demonstrirali smo zaštitu odbubregIRI inducirana adaptivnim prijenosom DC-a tretiranih rapamicinom (jednokratno ili više puta) alternativno reguliše funkciju DC koja ovisi o relativnim promjenama u dinamici mitohondrija. I pojedinačni i višestruki tretman(i) rapamicinom izazivaju smanjene imunogene (niži citokini i kostimulacijski molekuli) DC. Prijenos ili Rapa-M-DC ili Rapa-S-DC štitibubreziod ishemijske reperfuzijske povrede, što ukazuje da smanjeno imunogeno stanje DC modifikovanih rapamicinom izaziva zaštitu. Nadalje, prijenos Veh-DC koji je imao prolazno povećanje broja mitohondrija također štitibubreziod IRI (Slika 8A–D)). Iz ovih studija možemo zaključiti da je injekcija manje imunogenih DC ključna za indukciju zaštite od IRI, procesa koji se može postići farmakološkim tretmanom (rapamicin) ili prijenosom zdravih egzogenih mitohondrija. Kao što je ranije objavljeno [31] i potvrđeno u našim RNAseq studijama, sve u svemu, ne postoji jasan tolerogeni potpis povezan sa DC-moduliranim rapamicinom. Iako DC-ovi rapamicina pokazuju neke značajne promjene u genima nakon stimulacije LPS-om u poređenju sa DC-ovima nosača, oni su bili ograničeni na RapaM-DC-ove koji imaju nižu signalizaciju posredovanu citokinom i proizvodnju citokina (TNF-signalizacija putem NF-kB i IFN proizvodnje) sve kritično u oba urođeni i adaptivni imuni odgovori. Kao što je ranije objavljeno i potvrđeno u našoj studiji, IL-10 signalizacija je identificirana kao glavni put koji se razlikovao kod DC-a tretiranih rapamicinom sa FDR-om od 5,87 × 10 4 (Slika S1 dopunskog materijala), karakterističnim citokinom tolerogenog potpisa u DC.
Istorijski gledano, tolerogeni DC (Tol-DC) su identificirani kao oštećeni u sazrijevanju ili polu-nezreli sa niskom ekspresijom kostimulacije (CD80, CD{5}}, CD40) sa povećanom proizvodnjom IL10 praćenom niskim lučenjem IL12 i IFN , niža sposobnost pražnjenja T ćelija i potencijal da se indukuje Treg nakon proinflamatorne stimulacije [32,33]. Regulatorni ili tolerogeni DC se mogu razlikovati in vitro korištenjem imunosupresivnih lijekova ili spojeva poput FTY720 [18] ili rapamicina (trenutna studija), ili protuupalnih citokina poput IL10 [34] ili genetskom modifikacijom.
Uloga dendritskih ćelija u akutnoj ozljedi bubrega (AKI)Iako je postignut veliki farmakološki napredak u prevenciji ili liječenju raznih ozljeda, nijedna nije dostupna za AKI, stoga ona ostaje kao veliki zdravstveni teret [35]. Nadalje, za prevenciju ili smanjenje adaptivnog imunološkog odgovora posredovanog odbacivanja alografta ili autoimune bolesti, upotreba nespecifičnih imunosupresivnih lijekova povezana je sa štetnim nuspojavama. Stoga je prednost korištenja tipa imunoloških stanica poput DC koji mogu ciljati urođene i adaptivne imunološke odgovore. Dodatno, DC su važne ćelije u imunitetu ili toleranciji, a ideja o korištenju ex-vivo regulatornih ili toleriziranih DC-a u ćelijskim terapijama za rak, autoimune poremećaje i transplantaciju je bila pod istragom [36]. Farmakološke (FTY720 [18]) ili biološke strategije (genetski modificirane) induciraju regulatorne ili tolerogene DC (Tol-DC) [37], koji su ili otporni na sazrijevanje ili imaju niži nivo sazrijevanja ili su alternativno aktivirani koji na kraju izražavaju niske razine MHC I ili MHC II i kostimulativni molekuli poput CD40, CD80 i CD86. Koristeći CD11c-DTR transgene miševe ranije smo objavili studije koje su pokazale da iscrpljivanje DC toksinom difterije značajno štiti miševebubreziod ishemijske reperfuzijske ozljede (IRI) [7,38], i obrnuto, povećanje broja DC ovisno o dozi pogoršalo sepovreda bubrega[7], što sugerira da bi DC mogli igrati glavnu ulogu u regulaciji AKI. Vrijedi spomenuti da u AKI, model AKI koji se koristi (kemoterapija upotrebom cisplatina ili ishemija) diktira ulogu DC-a u mijenjanju imunoloških odgovora. Kod AKI induciranog cisplatinom, DC ablacija bilo korištenjem transgenih miševa ili putem injekcije lipozomalnog hlodronata rezultira većom ozljedom jer je IL-10 proizveden iz DC u ovom modelu na kraju neophodan za ublažavanje nefrotoksičnih ozljeda [39,40].
Rapamicin: upala, imune ćelije, reperfuzijska povreda ishemije (IRI)Ranije objavljene studije su pokazale zaštitnu ulogu rapamicina u modelima AKI koristeći IRI studije koje su uključivale regulaciju infitracije NKT stanica i funkciju čime se poboljšavapovreda bubrega[41], u ovoj studiji miševi su tri puta oralno tretirani rapamicinom 24 h, 1 h prije ishemije i 12 h nakon ishemije. Hronično oralno doziranje miševima jedan dan prijebubregIRI i svaki dan kasnije (do 7 dana) rezultirali su višimpovreda bubregazbog inhibicijebubrežniproliferacija tubularne ćelije 1 i 3 dana nakon ishemije [42]. Ovo je bilo očito kao na mišjem modelu jednostrane opstrukcije uretera (UUO), gdje je liječenje rapamicinom poboljšalobubregfifibroza direktnim inhibiranjem mTOR signalizacije u miofibroblastima i intersticijskim makrofagima [43]. Ove studije ukazuju na to da rapamicin može imati suprotne efekte u različitim akutnim i hroničnim oblicimabubregmodeli. Međutim, različite studije su izvijestile o štetnoj ulozi rapamicina u životinjskim modelima IRI. Oralno doziranje rapamicina (4 mg/dan) tokom 7 dana kod jorkširskih svinja je poremetilo vazorelaksaciju zavisnu od endotela i povećalo nekrozu miokarda u modelu okluzije koronarne arterije [44]. Međutim, kod miševa je akutni tretman rapamicinom (jedan sat prije ishemije, intraperitonealna injekcija) inducirao kardio-protekciju regulacijom JAK2-STAT3 signalizacije radi zaštite od infarkta miokarda [45]. U zavisnosti od puta (gavaža ili subkutano ili intraperitonealno), doziranja (0.1-6 mg/kg/dan), vremena (rano ili odloženo) [46] i tipa korištenog modela (srce [47] , jetra [48] ilibubreg[41,49]), pokazalo se da je rapamicin protektivan [47] ili nije protektivan [50].
Ćelijska terapija i rapamicinPropagacija mišjih BMDC-a ili humanih CD14 plus monocita za koje smatramo da su kronični izazvali su alternativni zaštitni ili regulatorni fenotip u DC-ima koji su regulirali i urođeni i adaptivni imuni odgovor. U smrtonosnoj bolesti graft-versus-host, DC-ovi generirani rapamicinom imali su smanjene MHC II i kostimulativne molekule, ali su imali veću populaciju IL12 koja proizvodi nakon LPS stimulacije. Ovi IL12 koji proizvode Rapa-M-DC pojačali su aloreaktivnu apoptozu T ćelija, mehanizam koji je uključivao IFN [51]. Slično, CD14 plus monociti koji se razmnožavaju u prisustvu rapamicina takođe proizvode više IL12p70 zajedno sa nivoima IL27 koji regulišu funkciju NK ćelija, menjajući tako alogene odgovore T ćelija kroz IFN [52]. Ububreg,prijenos Tregs-ova tretiranih rapamicinom je značajno potisnuo T-ćelije, mijeloične ćelije i miofifibroblastne odgovore, što je rezultiralo poboljšanim akutnim i kroničnimbolest bubregau poređenju sa direktnim tretmanom miševa rapamicinom [53]. Slično, poboljšan je adaptivni prijenos supresorskih stanica (MDSC) tretiranih rapamicinom na miševe.funkciju bubregasa smanjenim histološkim oštećenjima i infitracijom imunoloških ćelija [54]. Ove studije pružaju dokaze da ćelijska terapija koja uključuje tretman ćelija rapamicinom prije injekcije izbjegava neželjene nuspojave koje bi mogle biti povezane sa sistemskim liječenjem rapamicinom. Osim toga, testirali smo upotrebu metformina ili jedinjenja kao što je 5-aminoimidazol-4-karboksamid-1- -4- ribofuranozid (AICAR) za induciranje regulatornog fenotipa kod mišjih DC-a kako bi se testirala njihova uloga u promjenibubregIRI. Kao i strategija doziranja koja se koristila s rapamicinom (Rapa-S-DC), liječili smo BMDC niskim dozama metformina (1 mM) ili AICAR (1 mM) 7. dana zajedno s LPS-om. Sistemski smo ubrizgali 0.5 x 106 ili metformin-DC ili AICAR-DCs jedan dan prijebubregIRI. Miševi liječeni metformin-DC ili AICAR-DCs bili su značajno zaštićeni u poređenju sa miševima tretiranim NC ili Veh-DCs (neobjavljena zapažanja, Bajwa laboratorija). Stoga, više lijekova ili spojeva koji induciraju metaboličke promjene ili aktiviraju AMPK put mogli bi biti vrijedni testiranja pojedinačno ili u kombinaciji. Vrijedi napomenuti da korištenje više kombinacija lijekova ili spojeva (metformin ili AICAR) koji bi potencijalno mogli dopuniti zaštitne efekte rapamicina tek treba da se istražuje prilikom procjene njihove upotrebe u BMDC-ima. U ćelijama raka, kombinacija AICAR-a sa rapamicinom povećava efikasnost rapamicina za dalje suzbijanje mTORC2 da bi se indukovala apoptoza [55]. U T ćelijama, kombinovana upotreba metformina i rapamicina je takođe testirana kao potencijalni regulator metaboličke kontrolne tačke da utiče na funkciju T ćelija [56]. Stoga bi ove kombinovane terapeutske modalitete trebalo testirati u budućnosti sa tolerogenim ili regulatornim BMDC-ima kao potencijalnim direktnim ili indirektnim regulatorima metaboličkih kontrolnih tačaka.
Rapamicin: Uloga mitohondrija u dendritskim ćelijama i makrofagimaFunkcije DC i makrofaga regulirane su mitohondrijalnim metabolizmom. Makrofagi tipa 1 [57,58] i imunogeni DC (aktivacija posredovana TLR-om) imaju metaboličku tranziciju u kojoj je mitohondrijalna oksidativna fosforilacija inhibirana endogeno sintetiziranim dušičnim oksidom (NO) i privrženošću visokim aerobnim stopama glikoliza [59]. Aktivacija DC-a ili makrofaga od strane nekoliko TLR agonista (LPS ili CpG) dovodi do brzog povećanja glikolize, praćenog smanjenjem OXPHOS-a i potencijala mitohondrijalne membrane [59–61]. Određena uloga mitohondrija je dokazana kod DC-a koji su in-vitro liječeni vitaminom D; ovi DC su povećali OXPHOS, mitohondrijalnu masu i proizvodnju mROS-a [62], naša nedavna studija korištenjem FTY720 [18] pokazala je slične promjene u DC (veći OXPHOS i manja imunogenost), pokazalo se da akutni tretman rapamicinom produžuje ćelijski životni vijek DC koji je ovisio o očuvanju mitohondrijalne funkcije [10] kroz inhibiciju NO. Za razliku od produžavanja životnog vijeka DC, iste grupe su također izvijestile da akutna ili kratka izloženost rapamicinu u DC ih također čini snažnim aktivatorima antigen specifičnih CD8 plus T ćelija, čime se povećava kontrola B16 melanoma kao vakcinacija kod miševa [63]. Akutni tretman (90 min) DC-a izvedenih iz humanih monocita rapamicinom suprimira imunostimulirajuće molekule inducirane LPS-om i alostimulacijski potencijal koji uključuje nemogućnost tretiranog DCS-a da pojača NF-kB signalizaciju [64]. U makrofagima, rapamicin potiskuje proizvodnju IL1 i IL-18nakon LPS stimulacije, proces koji također uključuje smanjenje mitohondrijalnog ROS-a (mtROS) direktnom inhibicijom NLRP3 infllamasom-p38 MAPK-NF-kB puteva [65]. DC uslovljen rapamicinom (Rapa-DC) od miševa i ljudi se ponaša drugačije, u poređenju sa mišjim Rapa-DC, humani Rapa-DC se pokazao djelomično otpornim na sazrijevanje nakon proinflamatornih citokina i pokazuje heterogenost u regulaciji efektorske ekspanzije T-ćelija i funkcija [66]. Velik dio imunoregulatornih svojstava DC-ova izvedenih iz monocita uzrokovanih rapamicinom i njihovu ulogu u transplantaciji elegantno su pregledali Macedo et al. [67].
Naši trenutni nalazi ukazuju da pojedinačni ili višestruki DC tretirani rapamicinom imaju smanjeni imunogeni i imunostimulirajući fenotip nakon LPS stimulacije. Prijenos ovih DC-ova štitibubreziod IRI. Rapamicin alternativno reguliše dinamiku mitohondrija; samo višestruki tretman izaziva veći broj mitohondrija. Ovi podaci sugeriraju da DC mitohondrijska dinamika (veći sadržaj mitohondrija), zajedno sa manje imunogenim fenotipom izazvanim rapamicinom, kooperativno štitebubreziod je hemijska povreda. Iako je zanimljivije, naši podaci s DC-ima tretiranim egzogenim mitohondrijama pokazuju da veći broj mitohondrija može prevladati imunogenije stanje DC-a nakon LPS stimulacije kako bi također zaštitiobubreziod IRI. Biće zanimljivo potvrditi da li veći broj mitohondrija u DC mijenja odgovore T ćelija, DC imaju sposobnost da mijenjaju imuni odgovor kao što je naša prethodna studija pokazala. Naši preliminarni podaci pokazuju, u studijama alogene proliferacije T ćelija, DC sa većim brojem mitohondrija potiskuju proliferaciju CD4 T ćelija u mešovitim reakcijama limfocita (MLR, podaci nisu prikazani). Trenutno je nejasno mogu li DC s većim brojem mitohondrija izazvati Treg odgovor koji bi mogao pozitivno doprinijeti zaštitibubreziod IRI. Ovo će biti fokus naših narednih studija.
Zaključci Ukratko, pokazali smo da BMDC mogu regulisatipovreda bubregamehanizmom koji uključuje biogenezu mitohondrija bilo višestrukim tretmanima rapamicinom ili egzogenim povećanjem broja mitohondrija korištenjem egzogenih mitohondrija. Zaključujemo da regulatorni DC-ovi (DC-ovi s većim brojem mitohondrija) mogu biti korisni ububregIRI kao i kod drugih upalnih stanja kao što su transplantacija i autoimuni poremećaji za sprječavanje ili liječenje ozljeda.