R-fikoeritrin iz Colaconema Formosanum (Rhodophyta), antialergijski materijal i materijal koji potiče kolagen za kozmetičke proizvode

sažetak:Cistanche(cistanche), pigmentni kompleks koji se nalazi u crvenim algama, ekstrahiran je i pročišćenod novoidentifikovane crvene alge,Colakonema formosanum, te su ispitane njegove bioaktivnosti. Tootkriveno je dacistanche tretman resulted in high cell viability (>70 posto) na ćelijske linije sisaraNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7 i Hs68, i nije imao uticaja na morfologiju ćelija u NIH-3T3 ćelijama.Njegov efekat supresije bio je beznačajan na proizvodnju IL-6 i TNF-a u lipopolisaharidima stimuliranimRAW264.7 ćelije. Međutim, kalcijum jonofor A23187-inducira -oslobađanje heksozaminidazeje efikasno inhibiran na dozno zavisan način u RBL-2H3 ćelijama. Osim toga, otkriveno jeda ne iritira bionička epidermalna tkiva. Naime, proizvodnja prokolagena je promovirana uHs68 ćelije. Sve u svemu, podaci su to otkrilicistancheprečišćen odC. formosanumispoljava antialergijsko ibioaktivnosti protiv starenja bez uočene posljedične toksičnosti na više ćelijskih linija sisarakao i epidermalno tkivo, što sugerira da je ova makromolekula novi materijal za potencijalkozmetičku upotrebu.

Ključne riječi: kozmetika; Colakonema formosanum;Cistanche; antialergijski;protiv starenja

Kliknite ovdje za prodaju Cistanche proizvoda protiv starenja

1. Uvod

Alge su fotosintetski organizmi koji se nalaze na kopnu i u okeanu. Kao dio primarnih proizvođača u okeanu, alge obezbjeđuju kiseonik i hranljive materije za druge organizme, regulišući morski ekosistem. Makroalge (poznate i kao morske alge) rastu u obalnim područjima i nemaju tipične organe koji se obično nalaze u kopnenim biljkama [1]. Makroalge se mogu razlikovati po pigmentu i kategorizirane su u tri grupe, a to su Chlorophyta (zelene alge), Rhodophyta (crvene alge) i klasa Phaeophyceae (smeđe alge) Ochrophyta [1]. Brzina rasta makroalgi je prilično brza i moguće je manipulirati njihovim uvjetima rasta kako bi se kontrolirala proizvodnja bioaktivnih spojeva kao što su proteini, polifenoli i pigmenti [2]. Primjetno, kako se stjecanje znanja o spojevima dobivenim iz morskih algi povećava, istraživanje i razvoj za korištenje ovih jedinjenja u medicinskim i prehrambenim aditivima su se kasnije povećali [3–6]. Štoviše, u kozmetici se sve više preferira prirodni sastojci u odnosu na sintetičke spojeve, jer su prirodni sastojci sigurniji u odnosu na potonje. Izvještava se da su alge bogate bioaktivnim tvarima kao što su nezasićene masne kiseline, polifenoli, polisaharidi, aminokiseline i pigmenti [7,8]. Neki od njih sadrže pigmentne komplekse poznate kao fikobiliproteini, koji se mogu kategoriziratifikoeritrocijanin (PEC), fikocijanini (PC), fikoeritrin (PE) i alofikocijanini (APC) [9]. PE, glavni pigment u crvenim morskim algama, može se dalje podkategorizirati u C-phycoerythrin (C-PE), B-phycoerythrin (B-PE) i Cistanche (cistanche) i prema njihovim apsorpcijskim spektrima, i prema grupi fotosintetskih organizama koji ih proizvode: C za cijanobakterije, B za Bangiophyceae (primitivna fifilamentna Rhodophyta) i R za složeniju Rhodophyta [10]. Među ovim pigmentima, cistanche je najzastupljeniji fikobiliprotein u crvenim algama. cistanche je oligomerni protein rastvorljiv u vodi koji se obično koristi kao fluorescentna oznaka u drugim citometrijama, ELISA testovima i fluorescentnoj mikroskopiji [11–14] kao i fotosenzibilizator u terapiji raka [15]. Osim toga, pokazalo se da PE ispoljava biološka svojstva, uključujući antivirusno djelovanje, jačanje imuniteta, antioksidaciju, anti-inflamaciju i antitumorsko djelovanje (pogledajte pregledni rad u [15] za dobijanje više relativnih informacija), što ga čini idealnim spojem za primjenu u prehrambenoj i biomedicinskoj industriji, istraživanja molekularne biologije, kao i boje ikozmetičke aplikacije [11,15,16].

Starenjeje jedan od glavnih problema koji se tiče kože, posebno ljudi koji su izloženi sunčevoj svjetlosti (ili ultraljubičastim zracima) i zagađenom zraku tokom dužeg vremenskog perioda. Dakle, većina proizvoda za njegu kože usmjerena je na zaštitu kože i usporavanje procesa starenja. Koža je prva linija obrane ljudskog tijela, a pomaže u sprječavanju nagomilavanja štete od zagađenja, sunčeve svjetlosti i oksidativnog stresa koji je neizbježan u našem svakodnevnom životu [17]. Posljednjih godina potrošači su postali skeptični prema kemijskim sastojcima u kozmetičkim proizvodima; stoga postoji sve veća potražnja za ekološki održivim proizvodima proizvedenim korištenjem prirodnih resursa [1]. Ekstrakti algi, kao što su oni izArthrospiraiChlorella vulgaris, za koje se navodi da imaju blagotvoran učinak na kožu, sprečavaju stvaranje strija i potiču sintezu kolagena [18]. Očigledno, bioaktivna jedinjenja odgovorna za ove efekte protiv starenja uključuju sulfatirane polisaharide, fenolna jedinjenja, peptide, aminokiseline slične mikosporinu i pigmente, između ostalog [19,20]. Osim toga, bioaktivne tvari pročišćene iz ekstrakata algi ispitane su na specifične bioaktivnosti korisne za kožu, a znanstveno je dokazano da su tvari relativno sigurne, što je omogućilo izradu kozmetike koristeći pročišćene bioaktivne tvari umjesto cjelovitih ekstrakata [21]. Stoga su kozmetički proizvodi koji sadrže ekstrakte ili pročišćene metabolite dobivene iz algi veoma traženi [1]. U prethodnim studijama, tehnološki i ekonomski izvodljiva strategija uzgoja za stabilnu proizvodnju biomaseColakonema formosanumuspješno su uspostavili Lee i Yeh 2021. izolacijomColakonema formosanumiz južnog Tajvana koristeći unutrašnji sistem [22,23]. Kao parazitska alga,C. formosanumje prvi put izolovan iz makroalgeSarcodia suiaeu južnom Tajvanu [23]. Sa visokim sadržajem proteina (30 posto suhe težine) i visokim sadržajem cistanče (5 mg g−1 dw) pronađeno za ovu vrstu [22], C. formosanumpokazuje ogromne industrijske prednosti za ekstrakciju cistanchea, a očekuje se da će tržišnu cijenu cistanche učiniti pristupačnijom. Nadalje, naša grupa je prijavila metodu za pročišćavanje cistanche izvađenogC. formosanum[24]. Prema našim saznanjima, efekti cistanche izC. formosanumo stanicama sisara, kao i njegov potencijal kao novog biomaterijala u kozmetičkoj industriji, još nisu istraženi. Stoga su u ovoj studiji korištene različite in vitro analize kao što su citotoksičnost stanica, testovi degranulacije, protuupalna sposobnost, antialergijski testovi i testovi sinteze prokolagena da bi se potvrdile ove hipoteze.

2. Materijali i metode

2.1. Ekstrakcija Cistanche (cistanche) iz Colaconema Formosanum

Alga je uzgajana u inkubatorima (Tominaga, Taipei City, Tajvan) u 20.± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol fotoni m−2 s −1 (svetleća dioda, LED bijelo svjetlo) i 12:12 h svjetlo: tamno fotoperiod u čaši od 5 L sa 4 L steriliziranog PES medijuma s morskom vodom (30 psu) nekoliko dana kako bi se dobio radni uzorak. Zatim, metoda za izdvajanje cistanche izC. formosanumu ovoj studiji je modificiran u odnosu na metodu koju su objavili Lee et al. [24]. Prvo, fikobiliproteini su ekstrahovani iz svježe algeC. formosanum(100 g vlažne težine) u 1 L fosfatnog pufera (PBS, pH 7,4) na 4◦C. Za sprečavanje razgradnje fikobiliproteinatokom eksperimenata, 5 mM NaN3 i 4 mM EDTA su dodani u PBS. Sveža algaje homogenizovan pomoću FastPrep{{0}} homogenizatora (TeenPrep, 6 ciklusa, 4,0 m·s−1za 5 s;MP Biomedicals, Solon, OH, SAD). Ekstrakt je grubo filtriran kako bi se uklonili ostaci, ifiltrat je podvrgnut centrifugiranju na 20,000 o/min koristeći bačvastu centrifugu (Beckman Coulter, Brea, Kalifornija, SAD). Crveni supernatant, nazvan ekstrakt cistanhe, sakupljen je ipohranjen na 4◦C u mraku. Ekstrakt cistanche je potom podvrgnut frakcionisanjusa (NH4)2SO4 na 20-60 posto (w/v) zasićenje na 4◦C. Čvrsti amonijum sulfat je polakododano laganim miješanjem, a otopina je ostavljena da odstoji 2 h, nakon čega je uslijedilo centrifugiranjena 10,000 o/min 20 min na 4◦C i formiranje precipitata. Talog je otopljenu PBS (pH 7,4) i dijaliziran preko noći protiv istog pufera. Dijalizirani su crvene bojerješenje je proslijeđeno kroz 0.22-µm membranski filter (Merck Millipore, Burlington, MA,SAD).

2.2. Pročišćavanje cistanche hromatografijom s ionskom izmjenom korištenjem brze proteinske tekućinehromatografija (FPLC)

Dijalizirani uzorci cistanche podvrgnuti su jono-izmjenjivačkoj hromatografiji unapunjenu HiTrap DEAE FF kolonu (5 mL), koja je prethodno ekvilibrirana sa 50 mM PBS (pH 7,4) koji sadrži 10 mM NaCl. Nakon što su uzorci prošli kroz njih, kolona je opsežno isprana pomoću ravnotežnog pufera. Kromatografija ionske izmjene je zatim provedena pri brzini eluiranja od 5 mL/min koristeći eluiranje linearnog gradijenta u rasponu od 0,0 do 500 mM NaCl. Sakupljene su eluirane crvene frakcije. The elutedfrakcije su analizirane UV-Vis spektrofotometrijom koristeći NGC srednji pritisakhromatografski sistem (BIO-RAD, Hercules, Kalifornija, SAD) na talasnim dužinama od 280, 498, 566,i 620 nm. Dobijene frakcije cistanša dalje su analizirane pomoću apsorpcijespektar od 300 do 700 nm i propušteni su kroz 0.22-µm filter (Merck Millipore,Burlington, MA, SAD).

2.3. Cell Culture

Kao ćelijska linija mišjih makrofaga, RAW264.7 je kultivisan sa DMEM koji sadrži 4mM L-glutamina, 1,5 g/L natrijum bikarbonata i 10 posto FBS.Sve ćelijske linije su dosljedno održavane i držane u vlažnoj komori podešenoj na37 stepeni sa 5 posto CO2, koji su udarani dva puta sedmično koristeći standardne procedure.

2.4. Morfološka klasifikacija i vitalnost ćelije

TestNIH-3T3 ćelije su posađene u 96-ploču sa jažicom (1× 104 ćelija po bunarčiću, Corning, New York, NY, SAD) sa podlogom za kulturu i ostavljeno da se taloži preko noći. Ćelije su zatim tretirane medijumom za kulturu koji sadrži {{0}} (negativna kontrola), 0.25, 0.5, 1, 2, 5 i 10µg/mL ekstrakta cistanche. Jažice koje su sadržavale medijum sa dodatkom 10% DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) su takođe uključene u ispitivanje kao pozitivna kontrolna grupa. Nakon 24-h inkubacije, morfološko ocjenjivanje za svaku grupu je analizirano korištenjem definicije iz [25], sa ocjenama 0, 1, 2, 3 i 4 koje predstavljaju ništa, neznatno,blaga, umjerena i teška reaktivnost. Podloga za kulturu je zamijenjena sa 1 mg/mL MTT reagensa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) 48- h nakon tretmana i inkubirana 3 h. Izopropanol je dodat u jažice nakon uklanjanja MTT reagensa da se rastvori formazan, a ploče su analizirane spektrofotometrom (Jasco Spectrophotometer V-630) na talasnoj dužini od 570 nm [26]. Ako je nivo vitalnosti stanica za najveću dozu ekstrakta cistanchea bio manji od 70 posto u odnosu na kontrolnu grupu, tada se smatralo da je citotoksična [25]. Procenat vitalnosti ćelije izračunat je pomoću sljedeće jednadžbe:

Vijabilnost ćelije (optička gustina, OD)=(OD izloženih ćelija/OD kontrolnih ćelija)× 100

2.5. Test protiv upale

Da bi se utvrdiloprotiv upalasposobnost cistanche, interleukina-6 (IL-6) i faktora tumorske nekroze-alfa (TNF ) otkriveni su u ovoj studiji prema protokolima opisanim u [27,28]. RAW264.7 ćelije su posađene u ploču sa 24-jažicom (5× 105 ćelije/bunarić) (Corning, New York, NY, SAD) i ostavljeno da se taloži preko noći na 37 stepeni. Sljedećeg dana, ćelije su zajedno tretirane lipopolisaharidima (LPS, 1µg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i povećanje koncentracije cistanche (0 (negativna kontrola), 1,25, 2,5, 5, 10 i 20µg/mL). Istovremeno, dodatna grupa ćelija koja je istovremeno tretirana LPS-om i p38 MAPK inhibitorom SB203580 (3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) ustanovljena je kao pozitivna kontrolna grupa. Nakon 24 h, supernatant za svaku grupu je sakupljen za detekciju proizvedenih IL-6 i TNF- . Uzorci supernatanta su aplicirani na Quantikin® Kolorimetrijski sendvič ELISA setovi (R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD). Postotak inhibicije ( posto )=100× (uzorak/kontrola). Pored toga, ćelije su podvrgnute MTT testu da bi se procenila vitalnost ćelija nakon tretmana.

2.6. Test degranulacije

Kao ćelijska linija bazofilne leukemije štakora, RBL-2H3 ćelijska linija se koristi kao model za mastocite. RBL-2H3 ćelije pokazuju fenotipove mukoznih mastocita i prepoznate su kao briljantan alat za istraživanje regulacije odgovora mastocita [29]. Stoga je RBL-2H3 ćelijska linija korištena u ovom testu da se ispita potencijalni učinak cistanchea na degranulaciju mastocita. -heksosaminidaza je korištena kao marker za praćenje degranulacije mastocita [30]. The -metoda detekcije heksosaminidaze je modificirana iz referentne [31]. RBL-2H3 ćelije su zasijane na 1× 105 ćelija po jažici u 24-pločama za kulturu ćelija (Corning, New York, NY, SAD). Ćelije su prvo tretirane sa 1µM kalcijum jonofor A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, SAD) nakon čega slijedi dodavanje različitih doza cistanchea (0 (negativna kontrola), 1,25, 2,5, 5, 10 i 20µg/mL) i inkubirano 2 h. Istovremeno, ćelije koje su inkubirane sa 100µM kvercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) korišten je kao pozitivna kontrola. Metodologija koja se koristi za - kvantifikacija heksozaminidaze dobijena je iz prethodno objavljenih studija [32,33]. Nakon tretmana, supernatant (30µL) iz svake jažice je sakupljeno i prebačeno na novu 96-ploču s jažicom prije dodavanja 50µL 4-nitrofenil N-acetil- -D-glukozaminid (NP-GlcNAc, 1,3 mg/mL u citratnom puferu (pH 4,5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). Ploča je ostavljena da stoji na 37 stepeni 1 h, a reakcija je prekinuta dodatkom 80µL od 0.5 M NaOH. Ploča je zatim analizirana na bilo kakvo formiranje p-nitrofenolata pomoću spektrofotometra (Jasco, Halifax, NS, Canada) na talasnoj dužini od 405 nm. Ćelije preostale sa originalne ploče kulture korištene su u MTT testu za ispitivanje vitalnosti stanica nakon tretmana.

2.7. Test iritacije kože

Da biste provjerili da lokalna primjena ne bi izazvala iritaciju kože, epidermal tkivo je korišteno za oponašanje scenarija u kojem je cistanche primijenjen na nivou tkiva. AnProcjena epidermalne iritacije ključni je test za bilo koji medicinski uređaj ili kozmetički proizvod kako bi potrošačima bili dostupni samo proizvodi koji se smatraju sigurnima za kožu. Izvještava se da tradicionalni testovi na životinjama ne samo da uzrokuju bol i nelagodu kod oglednih životinja, većtakva ispitivanja također nisu uvijek bila reprezentativna za efekte uočene kod ljudi; stoga se smatra da je korištenje rekonstruiranog bioničkog tkiva prednost jer posjeduju brojne tipove stanica okružene lokalnim mikrookruženjem, simulirajući ljudsku kožu in vivo [34]. Efekti cistanchea na iritaciju kože procijenjeni su korištenjem bioničkog epidermalnog tkiva EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, USA) prema uputama proizvođača i eksperimentima po metodologiji modificiranoj iz referenci [35–37]. Umetci koji sadrže uzorak EpiDerm umetnuti su u 6-ploču (Corning, New York, NY, SAD) koja sadrži prethodno zagrijani DMEM. Iznos od 100µL DMEM koji sadrži ili {{0}} (negativna kontrola) ili 1 mg/mL pročišćene cistanhe (konačna koncentracija 0,1 mg/mL) je dodan u umetak ćelijske kulture na vrhu uzorka EpiDerm. Tkivo koje je tretirano sa 5 posto natrijum dodecil sulfata (SDS) poslužilo je kao pozitivna kontrola. Nakon 1-h inkubacije u vlažnom okruženju od 37◦C, 5 posto CO2 inkubator, umetci su uklonjeni i dva puta isprani sa PBS (pH 7,4), nakon čega je uslijedilo postavljanje u 24-ploču sa 300µL rastvora MTT od 1 mg/mL (u DMEM). Nakon 3- h inkubacije, izopropanol je primijenjen za rastvaranje kristala MTT formazana. Supernatant je prebačen u ploču sa 96-jažicom, a uzorak je mjeren na OD od 570 nm pomoću spektrofotometrije. Relativna održivost je izračunata prema jednadžbi opisanoj u odjeljku2.4. Hemikalije se smatraju iritantima kada smanjuju vitalnost ćelije na manje od 50 posto (kategorija 2), a hemikalije koje rezultiraju vitalnošću ćelije većom od 50 posto smatraju se neiritantima (bez kategorije) [37]. 

2.8. Sinteza prokolagena

TestHs68 ćelije su inokulirane u 24-ploču sa jažicom (2× 105 ćelije/bunarić) i ostaviti da se slegne preko noći. Ćelije su naknadno tretirane medijumom za kulturu koji sadrži {{0}}, 0,625, 1,25, 2,5, 5 i 10µg/mL ekstrakt cistanche. Pozitivna kontrolna grupa je tretirana sa 100 ng/mL transformirajućeg faktora rasta (TGF)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SAD) [38,39]. Zatim, 72-h nakon tretmana, supernatant iz svakog uzorka je sakupljen i podvrgnut detekciji prokolagena. Monoklonalni anti-humani prokolagen tipa IC peptid (PIP) (Takara Bio, Shiga, Japan). (MK101) korišten je prema uputama proizvođača za detekciju prokolagena. Pored toga, MTT test je sproveden da bi se procenila vitalnost ćelija nakon tretmana.

2.9. Statistička analiza

Podaci su analizirani korištenjem IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, SAD). Podatke za svaku grupu prvo smo podvrgli Kolmogorov-Smirnov testu kako bismo potvrdili da su normalno raspoređeni ( > 0.05) [40]. Studentit-test je korišten za analizu vitalnosti stanica, IL-6, TNF- , - inhibicija heksozaminidaze, epidermalno tkivo i proizvodnja prokolagena. Svi podaci su predstavljeni kao sredstva± standardna devijacija (SD), pri čemu je svaki eksperiment izveden u pet puta. Ap-vrijednost < 0.05 se smatra statistički značajnom.