Kvercetin ublažava oksidativne promjene u mozgu izazvane nanočesticama željeznog oksida kod pacova

Kontakt:tina.xiang@wecistanche.comza više detalja

Abstract: Terapija nanočesticama željeznog oksida (IONP) ima različite zdravstvene prednosti, ali visoke doze ili produžena terapija mogu izazvati oksidativne ćelijske ozljede, posebno u mozgu. Stoga smo sproveli trenutnu studiju kako bismo istražili zaštitnu ulogukvercetinsuplementacija protiv oksidativnih promjena izazvanih u mozgu štakora zbog IONP-a. Četrdeset odraslih mužjaka albino pacova raspoređeno je u jednakih pet grupa; kontrolna grupa je primala normalnu bazalnu ishranu, IONP grupa je intraperitonealno ubrizgana IONP od 50 mg/kg tjelesne težine (BW), a grupe liječene kvercetinom imale su IONP plus Q25, IONP plus Q50 i IONP plus Q100 koji su oralno zamijenjeni kvercetinom dozama od 25, 50 i 100 mg kvercetina/kg BW dnevno, respektivno, primijenjene sa istom dozom IONP-a tokom 30 dana. IONP-i su izazvali značajno povećanje malondialdehida (MDA) i značajno smanjili redukovani glutation (GSH) i oksidirani glutation (GSSG). Posljedično, IONP su značajno inducirali teške ozljede moždanog tkiva zbog taloženja željeza što je dovelo do oksidativnih promjena sa značajnim povećanjem kreatin fosfokinaze (CPK) i acetilkolinesteraze (AChE) u mozgu. Nadalje, IONP-i su izazvali značajno smanjenje epinefrina, serotonina i melatonina u mozgu uz smanjenje regulacije receptora-gama koaktivatora aktiviranog proliferatorom peroksizoma 1-alfa (PGC-1a) i mitohondrijalnog transkripcionog faktora A (mtTFA)mRNA izrazi. IONP-i induciraju apoptozu u mozgu praćenu povećanjem kaspaze 3 i smanjenjem nivoa ekspresije B-ćelijskog limfoma 2(Bcl2). Dodatak kvercetina značajno je porazio mozakoksidativna oštećenjana način ovisan o dozi. Stoga se suplementacija kvercetina tokom IONP-a visoko preporučuje kako bi se stekle prednosti IONP-a uz manje opasnosti po zdravlje.

Ključne riječi: nanočestice željeznog oksida; oksidativni stres; kvercetin; antioksidans

1. Uvod

Nanočestice željeznog oksida (IONP) koriste se za ciljanje lijekova, isporuku gena, obilježavanje stanica, kontrastno sredstvo u magnetnoj rezonanciji i terapiju hipertermije[1]. Također se koristi kao aditiv za hranu u pićima obogaćenim željezom i žitaricama za ljudsku prehranu [2] pored brojnih industrijskih primjena u tretmanu otpadnih voda, senzorima plina i poluvodičkim sorbentima za podmazivanje, pigmente i premaze [3]. Međutim, raznovrsna upotreba IONP-a izaziva preopterećenje gvožđem i kasnije pokretanje oksidativnog stresa u različitim organima[4]. Gutanje, udisanje i dermalna penetracija su glavni putevi ulaska IONP-a[5]. U krvotoku, IONP se vezuju za proteine ​​plazme i distribuiraju u različita tijela

organa uključujući jetru, slezenu, bubrege, pluća i srce, i prodiru kroz krvno-moždanu barijeru (BBB), izazivajući oksidativne povrede [6,7]. Gvožđe koje se oslobađa iz IONP-a izaziva stvaranje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) dovodi do ozbiljnih oksidativnih promena u lipidima, proteinima i DNK [8,9].

kvercetin(3,3',4',5,7-pentahidroksiflavon) jeflavonoidaprisutan u voću (jabuke, bobičasto voće, trešnje i crveno grožđe) i povrću (luk i brokula) pored mnogih sjemenki, heljde, orašastih plodova, cvijeća, kore, zelenog čaja i maslinovog ulja[10]. Kvercetin ima brojne vrijedne efekte koji uključuju protuupalne, antioksidativne, anti-mutagene, antiishemične, antivirusne i anti-age efekte [11-17]. Kvercetin je lipofilan i može prodrijeti kroz krvno-moždanu barijeru (BBB)[18]. Nadalje, kvercetin pokazuje potencijalnu antioksidativnu ulogu povećanjem reduciranog glutationa (GSH) i regulacijom bakar-cink superoksid dismutaze (SOD1)[17]. Kvercetin može kelirati željezo, inhibirajući Fentonovu reakciju i inhibirajući stvaranje ROS-a [19]. Posljedično, kvercetin je potencijalni terapeut za višestruke neurodegenerativne bolesti i neuronske ozljede [20]. TheantioksidansPotencijal kvercetina podstakao nas je da sprovedemo ovu studiju kako bismo istražili zaštitni potencijal kvercetina protiv oksidativnih promjena izazvanih IONP-ima na moždanim tkivima.

Kliknite da saznate više o proizvodima

2. Rezultati

2.1. Veličina i naplata IONP-a

SEM slika IONP-a, kao što je prikazano na slici 1, otkrila je sferni oblik prosječne veličine 16.34-22.88 nm dok je posjedovao pozitivnu vrijednost zeta potencijala plus 22,8 mV (Slika 2).

2.2. Oksidativni stres u mozgu i antioksidativni status

Nivoi produkta peroksidacije lipida malondialdehida (MDA) su značajno povećani u grupi IONP (p<0.05) while="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps="" +="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" (figure="" 3a).mda="" levels="" in="" ionps+="" q25=""><0.01), ionps+=""><0.01) and=""><0.01) were="" significantly="" decreased="" compared="" with="">

Nivo GSH u homogenatu mozga značajno je smanjen u IONP (str<0.001), ionps+=""><0.001),ionps+o50><0.001) and="" ionps+="" o100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.in="" ionps+q100,="" the="" gshlevels="" were="" significantly="" increased="" than=""><0.001) and="" ionps+="" q25(p=""><0.01), as="" represented="" in="" figure="">

Nivoi oksidiranog glutationa (GSSG) značajno su povećani u IONP (str<0.001), ionps+q25=""><0.001),><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="">

Na osnovu podataka GSH i GSSG, vrijednosti omjera GSH/GSSG su značajno smanjene u IONP (p<0.001), ionps+="" q25,ionps+="" q50="" and="" ionps+="" o100="" compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 3d).="" in="" ionps+="" q100,="" gsh/gssg="" ratio="" values="" were="" significantly="" increased="" in="" comparison="" with=""><0.01)and ionps+q25=""><>

2.3. Aktivnosti kreatin fosfokinaze (CPK) i acetilholinesteraze (AChE) mozga

Aktivnosti CPK su značajno povećane u IONP (str<0.001), ionps="" +="" q25=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+="" q100=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" in="" comparison="" with="" the="" ionp="" groups,="" cpk="" activities="" were="" significantly="" decreased="" in=""><0.01),><0.01) and="" ionps+q100=""><0.001)(figure>

Na slici 4B, aktivnosti AChE su značajno povećane u IONP (str<0.001), ionps=""><0.001), ionps+="" q50=""><0.001) and="" ionps+=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group.="" they="" significantly="" decreased="" in="" ionps+q25=""><0.01), ionps+q50=""><0.001)and ionps+q100(p=""><0.001) than="" ionps.in="" addition,="" ache="" activities="" were="" significantly="" decreased=""><0.001) in="" ionps+="" q100="" compared="" with="" ionps+="">

2.4. Hormoni adrenalina, serotonina i melatonina u mozgu

Nivo adrenalina u homogenatima mozga značajno je smanjen u IONP (str<0.001), ionps+="" q25=""><0.001) and=""><0.05) compared="" with="" the="" control="" group(figure="" 4c).in="" the="" ionps+="" q25=""><0.05),ionps+><0.001)and ionps+q100=""><0.001)groups, the="" epinephrine="" levels="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" ionps.="" furthermore,="" the="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps="" +="">

Kao što se može vidjeti na slici 4D, nivoi serotonina su značajno smanjeni u IONP (str<><0.001),><0.01) and=""><0.05)compared with="" the="" control="" group.="" in="" ionps+="" q100,="" the="" levels="" significantly="" increased=""><0.05) than="" ionps="" +="">

Nivo melatonina u homogenatima mozga značajno je smanjen u IONP (str<0.001), ionps+=""><0.001) and="" ionps+="" q50=""><0.01) compared="" with="" the="" control="" group="" (figure="" 4e).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" levels="" in="" the=""><0.01) and="" ionps="" +=""><0.001)groups were="" significantly="" increased.="" it="" significantly="" increased=""><0.001)in ionps="" +="" q100="" compared="" with="" ionps="" +="">

2.5. Ekspresija PGC-1a i mtTFA mRNA mozga

Peroksizomski proliferator aktiviran receptor gama koaktivator 1-alfa(PGC-1a) mRNA ekspresijske promjene puta su značajno smanjene u IONPs(p<0.001) and="" ionps+q25=""><0.05) and="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q100=""><0.001)compared with="" the="" control="" group="" (figure="" 5a).in="" comparison="" with="" ionps,="" the="" pgc-1a="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased="" in="" ionps+="" q50=""><0.05) and="" ionps+q100=""><0.001).in addition,="" pgc-1a="" expression="" levels="" in="" ionps+="" o100="" were="" significantly="" increased="" (p=""><0.001)compared with="" the="" ionps="" +="" q25="" and="" ionps="" +="" q50="">

U IONP-ima (str<0.001), ionps+="" q25="" (p=""><0.001)and ionps+=""><0.05), the="" mrna="" expression="" levels="" of="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a="" (mttfa)="" were="" significantly="" decreased="" than="" in="" the="" control="" group="" while="" they="" significantly="" increased="" in="" ionps+q50=""><0.01) and="" ionps+=""><0.05)compared with="" ionps+="" q25.mttfa="" expression="" levels="" were="" significantly="" increased=""><0.05) in="" ionps+o100="" in="" comparison="" with="" ionps+q50="" (figure="">

2.6. Procjena bojenja moždanih dijelova hematoksilinom (H) i eozinom (E)

Histološke procene moždanog tkiva otkrile su da je kontrolna grupa pokazala normalnu histološku strukturu slojeva malog mozga (slika 6A). U IONP grupi, mali mozak je pokazao ozbiljno iscrpljivanje sloja Purkinjeovih ćelija (slika 6B), dok je ovo iscrpljivanje Purkinjeovih ćelija sloj zbog IONPs je ublažen u grupama IONP plus Q25 (Slika 6C), IONPs plus Q50 (Slika 6D) i IONPs plus Q100 (Slika 6E) na način ovisan o dozi.

Štakori u kontrolnoj grupi pokazali su normalnu histološku strukturu moždanih ovojnica i korteksa velikog mozga (Shema 1A), dok su moždane ovojnice pacova tretiranih IONP-om pokazale zagušenje submeningealnih krvnih sudova (Shema 1B). U IONP grupama, mozak mozga pacovi su pokazali satelititozu, neuronofagiju (Shema 1C), gliozu (Shema 1D) i spongiozu (Shema 1E) pored kongestije horoidnog pleksusa (Shema 1F).

Kao što se može vidjeti na Shemi iF, mozak pacova u grupi IONP plus Q25 pokazao je spongiozu (kratke strelice) i zagušenje submeningealnih krvnih sudova. Štaviše, cerebrum pacova u grupi IONP plus Q50 pokazao je blagu spongiozu i zagušenje krvnih sudova (Shema 1H). Mozak pacova u grupi IONP plus Q100 pokazao je relativno normalnu histološku strukturu moždanih ovojnica i korteksa velikog mozga (Shema 1I).

2.7. Procjena boja mozga pruskom plavom bojom

Sekcije mozga kontrolne grupe su pokazale negativno prusko plavo bojenje (Slika 7A). U grupi IONPs, pruske plave mrlje su prepoznate u dijelovima mozga (Slika 7B). Naprotiv, intenzitet pruskih plavih mrlja na dijelovima grupe IONPs je oslabljen kvercetinom u grupama IONP plus Q25 (slika 7C), IONP plus Q50 (slika 7D) i IONP plus Q100 (slika 7E) u način ovisan o dozi.

2.8. Nivoi proteina kaspaze 3 i Bcl2 u dijelovima mozga

Kontrolna grupa je pokazala negativnu ekspresiju nivoa proteina kaspaze 3 (slika 8A), dok su oni bili visoko eksprimirani u IONPs (slika 8B).Tretirani kvercetinomgrupe (Slika 8C-E) pokazale su nisku ekspresiju kaspaze 3 u poređenju sa IONP. Naprotiv, Bcl2 je bio značajno izražen u IONP plus Q25 (slika 9C), IONP plus Q50 (slika 9D) i IONP plus Q100 (slika 9E) u poređenju sa IONPs (slika 9B) i kontrolnom grupom (slika 9A).

3. Diskusija

Izloženost IONP-ima dovela je do željeza i njegovog taloženja u mekim tkivima, posebno u mozgu [21]. U ovoj studiji prepoznali smo taloženje gvožđa u mozgu o čemu svjedoči prusko plavo bojenje i promjene morfologije praćene procjenom H i E bojenja. Dhakshinamoorthy et al. [22] su pokazali da je sadržaj gvožđa značajno povećan u moždanom tkivu grupa tretiranih IONP-om u poređenju sa kontrolom. Ovo je procijenjeno pruskim plavim bojenjem regija mozga i dokazano plavim mrljama u frontalnom korteksu, hipokampusu i malom mozgu. El-Sayed et al. [23] je također naveo značajan porast nivoa željeza u moždanom tkivu zbog primjene IONP kod pacova.

IONP bi mogli imati veću sposobnost prodiranja u BBB i induciranja ozljeda moždanih stanica nego druge ćelije organa [24,25]. Drugo objašnjenje može biti povećanje nivoa gvožđa

u mozgu zbog vezivanja željeza za transferin pokreće regulaciju željeznih receptora u mozgu i, posljedično, transportira željezo kroz BBB [26].

Slobodni feioni reaguju sa H2O2 i stvaraju ROS u Fentonovom reakcijskom procesu [27]. Povišeni ROS je povećao permeabilnost vanjske mitohondrijalne membrane, lipidnu peroksidaciju, oštećenje proteina i prekid lanca DNK [28]. Theoksidativni stresROS-a je dovela do povećanja nivoa produkta peroksidacije lipida, MDA, u mozgu, kao što je navedeno u trenutnoj studiji na štakorima tretiranim IONP-om. Slično, Dhakshinamoorthy et al, [22] su prijavili značajno povećanje nivoa MDA u moždanim tkivima miševa tretiranih IONP-om. Reddy et al.[26] također je naveo da su nivoi MDA značajno povećani u moždanom tkivu u visokoj dozi, ali beznačajno povećanje u niskoj dozi kod pacova tretiranih IONP-om. Gaharwar i Paulraj [5] su otkrili da su nivoi MDA značajno povišeni kod pacova tretiranih IONP-om. Slično, IONP-i su izazvali oksidativno oštećenje kardiomiocita praćeno visokom proizvodnjom MDA i smanjenim koncentracijama GSH [29].

Autori u nekoliko studija su istraživali zaštitni učinak prirodnih proizvoda ili njihovih ekstrakata protiv nuspojava povezanih s IONP-ima, uključujući ekstrakte Echinacea purpurea [30] i Antlriscus sulvestris [31]. U trenutnoj studiji, istraživali smo zaštitnu ulogu kvercetina protiv toksičnosti IONP-a u mozgu štakora. Dodatak kvercetinu štakorima tretiranim IONP smanjio je nivoe MDA u moždanom tkivu i naši rezultati su bili u skladu s onima koje su dobili Dong et al. [32] koji su izjavili da kvercetin smanjuje peroksidaciju lipida snižavanjem nivoa MDA u moždanom tkivu kod pacova. Ovo se može objasniti sposobnošću kvercetina da smanji ROS, dakle, inhibirajući peroksidaciju lipida i sprječavajući stvaranje MDA [33]. Ovo se pripisuje kateholnoj grupi (B prsten) i OH grupi na poziciji 3 A i C prstena, koje imaju optimalno uklanjanje slobodnih radikala [17].

GSH je esencijalni dio ćelijske antioksidativne odbrane koja direktno reaguje sa ROS i drugim reaktivnim vrstama [34]. U ovoj studiji, nivoi GSH u mozgu su značajno smanjeni kod pacova tretiranih IONP, ali su nivoi GSSG značajno povećani. Reddy et al.[26]naveli su smanjenje nivoa GSH u moždanom tkivu pacova tretiranih IONP-om i sugerirali da bi to moglo biti posljedica povećane upotrebe GSH u reakcijama konjugacije kao dijela mehanizma detoksikacije, pa je stoga smanjeni GSH smanjio i oksidirao GSSG. povećana. Zajednička primjena kvercetina kod pacova tretiranih IONP-om to je vratila povećanjem GSH i smanjenjem nivoa GSSG u moždanom tkivu. Ovi rezultati su bili u skladu sa Singh et al. [35] koji su prijavili povišenje nivoa GSH u moždanom tkivu što ukazuje na antioksidativni potencijal kvercetina. Dong et al. [32] je također otkrio da kvercetin mijenja ekspresiju gena eritroidnog 2-srodnog faktora 2(Nrf2) nuklearnog faktora. Nrf2 je posljedično stimulirao proizvodnju antioksidativnih enzima u moždanim tkivima.

U ovoj studiji, CPK je značajno povećan u moždanom tkivu pacova tretiranih IONP-om. U puferiranju ćelijske energije i prijenosu energije, CPK/fosfokreatin igra glavnu ulogu, posebno u stanicama s visokim i promjenjivim energetskim potrebama kao što su neuroni [36]. Stoga, aktivacija sistema CPK/fosfokreatin i promjene ekspresije CPK mogu biti raniji pokazatelj oksidativnog i bioenergetskog stresa u ćeliji [37] kao kompenzacija za smanjenje proizvodnje energije zbog oksidativnog stresa. Istodobna primjena pacova tretiranih IONP-om s kvercetinom smanjila je CPK u moždanom tkivu, Lemmens et al. [38] pokazao smanjenje aktivnosti CPK zbog suplementacije kvercetinom.

Aktivnost AChE u nervnom tkivu odgovorna je za hidrolizu acetilholina (Ach) u holin na sinapsama i neuromišićnom spoju [39]. U ovoj studiji, AChE je značajno povećan kod pacova tretiranih IONP-om i ovaj rezultat je bio u skladu s Dhakshinamoorthy et al. [22] koji su prepoznali značajno povećanje aktivnosti AChE u moždanom tkivu pacova tretiranih IONP-ima kod kojih je akumulacija željeza od strane IONP-a promijenila holinergički sistem.

Neurotransmiteri su endogene hemijske supstance koje omogućavaju neuronima da komuniciraju po celom telu; omogućavaju mozgu da obavlja različite funkcije u hemijskom sinaptičkom prijenosu [40]. U trenutnoj studiji, koncentracije epinefrina, serotonina i melatonina u moždanim tkivima značajno su smanjene kod pacova tretiranih IONP-om.

Yousef et al. [41] izvijestili su da su nivoi serotonina i dopamina značajno smanjeni u moždanom tkivu kod pacova tretiranih IONP-om. Nasuprot tome, kvercetin je povećao koncentraciju epinefrina, serotonina i melatonina u moždanim tkivima u poređenju sa IONP. Singh et al. [35l je naveo da kvercetin povećava serotonin, norepinefrin i dopamin.

Mitohondrijalna biogeneza preuzima glavnu ulogu u održavanju mitohondrijalne homeostaze kako bi se zadovoljile stanične fiziološke potrebe neuralnih ćelija [42]. PGC-1a je ko-transkripcijski regulacijski faktor koji inducira mitohondrijalnu biogenezu i promovira ekspresiju mtTFA [43]. U ovoj studiji, nivoi ekspresije PGC-1a i mtTFA su značajno smanjeni u moždanom tkivu kod pacova tretiranih IONP-om. Naši rezultati bili su u skladu s onima koje su dobili Yousef et al. [44]. Oni su ilustrirali da mitohondrijalna biogeneza predstavljena PGC-la i mtTFA značajno smanjuje njihovu ekspresiju u moždanom tkivu kod pacova izloženih IONP-u, što ukazuje na smanjenu biogenezu mitohondrija i replikaciju i transkripciju mtDNA što može dovesti do mitohondrijalne disfunkcije. Zajednička primjena kvercetina kod pacova tretiranih IONP-om vratila je ovo smanjenje podizanjem ekspresije i PGC-1a i mtTFA u moždanom tkivu i naši rezultati su bili u skladu sa Sharma et al.[45] koji su prijavili da je kvercetin povećao ekspresiju PGC-1a, NRF-1, NRF-2 i mtTFA. Oni su predložili da zbog smanjenja ROS-a od strane PGC-a izazvanog kvercetinom{{17 }}podizanjem, ovo je dovelo do aktivacije NRF-1 i NRF-2 stimulirane ekspresije mtTFA.

Kvercetin je oslabio apoptotički efekat IONP-a kroz značajno smanjenje kaspaze 3 i povećanje nivoa ekspresije Bcl2 u imunohistohemijskim delovima mozga. Ovaj nalaz podržavaantioksidanspotencijal kvercetina. Slično, tretman kvercetinom je umanjio povećanje kaspaze 3 kod ishemijske ozljede mozga kod pacova [46,47] i Bcl2 kod miševa tretiranih lipopolisaharidom [48].

4. Materijali i metode

4.1. Reagensi i hemikalije

Prašak nanočestica gvožđe (ⅡI) oksida dobijen je od Sigma-Aldrich (Louis, Mo, SAD), koji je pre upotrebe rastvoren u dejonizovanoj vodi. Kvercetin je u obliku praha takođe dobijen od Sigma-Aldrich, koji je prije upotrebe otopljen u dimetil sulfoksidu (DMSO) i destilovanoj vodi u omjeru 1:20. DMSO Veći ili jednaki 99,6 posto kupljen je od Sigma-Aldrich. Ostale hemikalije i dejonizovana voda kupljene su od Centra za postdiplomske studije i istraživanja na Univerzitetu u Aleksandriji.

4.2. Etička izjava

Studija je odobrena kao odgovor na smjernice "NIH Vodiča za njegu i upotrebu laboratorijskih životinja" Etičkog komiteta Fakulteta veterinarske medicine Univerziteta Aleksandrija, Egipat.

4.3. Karakterizacija IONP-a

Morfologija i veličina čestica IONP-a ispitani su skenirajućim elektronskim mikroskopom (SEM). Naboj čestice je također određen zeta potencijalom korištenjem ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK).

4.4. Životinje, nastambe i eksperimentalni dizajn

Četrdeset zdravih odraslih mužjaka albino pacova težine 150±20 tjelesne težine (TW) kupljeno je od Jedinice za uzgoj životinja, Instituta za medicinska istraživanja Univerziteta Aleksandrija, Egipat. Životinje su držane u metalnim kavezima u kontrolisanim uslovima okoline sa optimalnom temperaturom (23±2), vlažnošću (55±5) i ciklusom tamno/svetlo (12 h) i slobodnim pristupom osnovnoj ishrani (Tabela 1) i pijacu vodu. Sve životinje su bile smještene dvije sedmice prije eksperimenta radi aklimatizacije. Pacovi su nasumično raspoređeni u pet grupa (po osam pacova); kontrola je primala normalnu bazalnu ishranu i vodu ad libitum, IONPs grupa je intraperitonealno ubrizgavana sa IONPs 50 mg/kg TM tri puta nedeljno[49], IONP plus Q25 mg grupa je davana istom dozom

IONPs i davana sa 25 mg kvercetina/kg BW dnevno, IONPs plus Q50 grupa je davana istom dozom IONPs i davana je sa 50 mg kvercetina/kg BW dnevno, a IONPs plus Q100 grupa je davana sa istom dozom IONPs i gava sa 100 mg kvercetina/kg TM dnevno [17]. Svi tretmani su održavani 30 dana.

4.5. Uzorkovanje

Na kraju eksperimenta, štakori su gladni 12 h i anestezirani intraperitonealnom injekcijom ketamina/ksilazina (100 mg/kg/10 mg/kg), zatim eutanazirani i mozak je odmah seciran, isprati ohlađenom fiziološkom otopinom 0,9 posto i podijeliti na tri dijela; prvi je korišten za biohemijske analize. Drugi dio je držan na -80 stepenu za ekstrakciju mRNA i RT-PCR procjenu dok je posljednji dio ispran fiziološkom otopinom fosfatnog pufera (PBS, pH 7,4) i fiksiran u 4 posto paraformaldehida otopljenog u PBS-u 48 h za fiksacija uzorka.

4.6. Biohemijske analize

Dijelovi mozga svakog pacova su homogenizirani u hladnom fosfatnom puferu (PBS) i centrifugirani 10 minuta na 4 stepena pri 1435×g. Malondialdehid (MDA), GSH, oksidirani glutation (GSSG) i kreatin fosfokinaza (CPK) određeni su komercijalnim setovima Biodiagnostic Co. (Giza, Egipat). Aktivnosti enzima acetilholinesteraze (AChE) u homogenatima mozga određivane su pomoću kompleta za kolorimetrijsku analizu (BioVision Co., Milpitas, Kalifornija, SAD). Nivoi adrenalina, serotonina i melatonina u homogenatima mozga su takođe određeni korišćenjem ELISA kompleta (BioVision Co., Milpitas, Kalifornija, SAD).

4.7. Ekstrakcija mRNA i RT-PCR

Ukupna RNA je ekstrahirana iz uzoraka korištenjem proizvođača easy-RED kompleta za ekstrakciju ukupne RNA (iNtRON Biotechnology, Inc., Gyeonggi-do, Južna Koreja). Prvi lanac cDNK je postignut korištenjem HiSen Script cDNA (iNtRON Biotechnology, Inc.) paketa. Specifični prajmeri su korišteni za amplifikaciju odabranih gena sa gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazom (GAPDH) kao stabilnim genom za održavanje kuće (Tabela 2). Ekspresija mRNA je postignuta korištenjem Strata gena MX3005P PCR u realnom vremenu (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SAD) i TOP real TM PreMIX SYBR Green qPCR master mješavina (kat. RT 500, Enzynomics, Daejeon, Južna Koreja) prema uputama proizvođača. Relativna koncentracija gena je procijenjena korištenjem 2-AAct metode kako je opisao Pfaffl [50].

4.8. Histopatološki pregled

Koristeći tradicionalnu tehniku ​​ugradnje parafina, fiksirani uzorci su dehidrirani uzlaznim stupnjevima etanola, očišćeni u tri ksilenske smjene, a završeni su ugrađivanjem parafina na 65 stepeni C. Presjeci debljine 4 um su obojeni hematoksilinom i eozinom (H i E) [51].

Presjeci mozga su hidrirani nizom opadajućih koncentracija alkohola i stavljeni u 20-postotni rastvor kalij-ferocijanida sa 20-postotnim rastvorom HCl na 30 minuta. Stakalca su oprana, dehidrirana, očišćena ksilenom i posmatrana pod mikroskopom na plavo bojenje sadržaja gvožđa [52].

4.9.Imunohistohemijski pregled

Standardna imunohistohemijska tehnika peroksidaze hrena (HRP) primijenjena je na pozitivno nabijene pločice parafinskih tkiva. Prema uputama proizvođača, korištena je zečja anti-pacova kaspaza 3 (Lab Vision, Fremont, Kalifornija, SAD) i Bcl2 (DAKO, Glostrup, Danska). Pet um-debljinih dijelova velikog mozga, malog mozga, kičmene moždine i išijadičnog živca je deparatirano, rehidrirano i prethodno tretirano sa 3 posto vodikovog peroksida (H2O2) kako bi se blokirala aktivnost endogene peroksidaze. Povlačenje antigena je postignuto stavljanjem stakalca u mikrotalasnu pećnicu na 10 min u 10 mM natrijum citratnom puferu (pH6,0). Stakalca su inkubirana sa primarnim antitelom, a zatim isprana sa Tris-pufer fiziološkim rastvorom i sekundarnim antitelom. Stakalca su inkubirana sa rastvorom hromogena supstrata 3,3/-diaminobenzidina (DAB), a zatim su obojena Mayerovim hematoksilinom. Slike 10 različitih polja su snimljene pri uvećanju od ×400.

4.10. Statistička analiza

Jednosmjerna ANOVA sa Tukeyjevim post hoc testovima višestrukog opsega korištena je za analizu podataka korištenjem GraphPad Prism v.5 https://www.graphpad.com/, pristupljeno 10. marta 2021. (GraphPad, San Diego, Kalifornija, SAD) . Sve izjave o značaju zavisile su od str<0.05. 5.="">

Nanočestice željeznog oksida (IONP) intraperitonealno ubrizgane dozom od 50 mg/kg BW izazvale su oksidativne promjene u mozgu dok je kvercetin u dozama od 25, 50 i 100 mg/kg B ublažio oksidativne povrede mozga izazvane IONP. Stoga je kvercetin obećavajući dodatak hrani uz IONP terapiju.

Reference

1. Mazdeh, M.; Rahiminejad, ME; Nili-Ahmadabadi, A.; Ranjbar, A. Neurološki poremećaji i oksidativni toksični stres: uloga metalnih nanočestica. Jundishapur J. Nat. Pharm. Prod. 2016, 11, e27628. [CrossRef]

2. Fidler, MC; Walczyk, T.; Davidsson, L.; Zeder, C.; Sakaguchi, N.; Juneja, LR; Hurrell, RF Mikronizirani, disperzibilni feri pirofosfat sa visokom relativnom bioraspoloživošću kod ljudi. Br. J. Nutr. 2004, 91, 107–112. [CrossRef]

3. Ramimoghadam, D.; Bagheri, S.; Hamid, SBA Napredak u elektrohemijskoj sintezi magnetnih nanočestica željeznog oksida. J. Magn. Magn. Mater. 2014, 368, 207–229. [CrossRef]

4. Gaharwar, SAD; Kumar, S.; Rajamani, P. Hematopoetski i imunološki odgovor kod pacova izazvan nanočesticama željeznog oksida. RSC Adv. 2020, 10, 35753–35764. [CrossRef]

5. Gaharwar, SAD; Paulraj, R. Nanočestice željeznog oksida izazvale su oksidativna oštećenja u stanicama periferne krvi pacova. J. Biomed. Sci. inž. 2015, 8, 274–286. [CrossRef]

6. Feng, Q.; Liu, Y.; Huang, J.; Chen, K.; Huang, J.; Xiao, K. Upijanje, distribucija, klirens i toksičnost nanočestica željeznog oksida različitih veličina i premaza. Sci. Rep. 2018, 8, 1–13. [CrossRef] [PubMed]

7. Gaharwar, SAD; Meena, R.; Rajamani, P. Biodistribucija, klirens i morfološke promjene intravenozno primijenjenih nanočestica željeznog oksida kod mužjaka Wistar pacova. Int. J. Nanomed. 2019, 14, 9677–9692. [CrossRef] [PubMed]

8. Palmieri, B.; Sblendorio, V. Testovi oksidativnog stresa: Pregled pouzdanosti i upotrebe, Dio II. EUR. Rev. Med. Pharmacol. Sci. 2007, 11, 383–399.

9. Naqvi, S.; Samim, M.; Abdin, MZ; Ahmed, FJ; Maitra, AN; Prashant, CK; Dinda, AK Toksičnost ovisna o koncentraciji nanočestica željeznog oksida posredovana povećanim oksidativnim stresom. Int. J. Nanomed. 2010, 5, 983–989. [CrossRef]

10. David, AVA; Arulmoli, R.; Parasuraman, S. Pregledi biološke važnosti kvercetina: bioaktivni flavonoid. Pharmacogn. Rev. 2016, 10, 84–89.

11. Wu, W.; Li, R.; Li, X.; He, J.; Jiang, S.; Liu, S.; Yang, J. Quercetin kao antivirusni agens inhibira ulazak virusa influence A (IAV). Virusi 2015, 8, 6. [CrossRef]

12. Akdemir, FNE; Gülçin, ˙I.; Karagöz, B.; Soslu, R. Kvercetin štiti skeletne mišiće pacova od ishemijsko-reperfuzijske ozljede. J. Enzym. Inhib. Med. Chem. 2016, 31, 162–166. [CrossRef] [PubMed]