Markeri kvaliteta Cistanches Herba zasnovani na odnosu antioksidativnog spektra i efekta

Sažetak: Cilj: Uspostaviti metod istraživanja za markere kvaliteta (Q-markere) zaCistanches Herba(CH)zasnovano naodnos spektra i efekta antioksidansa, pružajući osnovu za proučavanje njegovih farmakoloških supstanci i kontrolu kvaliteta. Metode: Tečna hromatografija ultra visokih performansi (UPLC) je korištena za uspostavljanje profila otiska prsta za 10 serija CH. Model oksidativnog oštećenja ćelija uspostavljen je korišćenjem H2O2, a antioksidativni kapacitet CH određen je na osnovu polumaksimalne inhibitorne koncentracije reaktivnih vrsta kiseonika, kao i nivoasuperoksidizmutazaikatalazeasfarmakološki pokazatelji. Odnos spektra i efekta konstruiran je analizom glavnih komponenti, Pearsonovom korelacijskom analizom i parcijalnom regresijskom analizom najmanjih kvadrata. Theaktivne komponentebili podvrgnutifarmakološka validacija. 

Rezultati:Profili otiska prsta za CH su uspostavljeni pomoću UPLC-a, identifikujući 17 uobičajenih pikova. Na osnovu analize korelacije spektra i efekta odabrano je devet komponenti. Rezultati farmakološke validacije su pokazali da geniposidna kiselina, 8-epiloganska kiselina,echinacoside,acteoside, izoakteozid, itubulozid Apokazuju antioksidativno djelovanje na način ovisan o koncentraciji.

Zaključak: Ova studija je istraživala Q-markere za CH na osnovu odnosa spektra i efekta, pružajući referentne informacije za osnovu njegove farmakološke supstance i poboljšanje standarda kvaliteta.

Ključne riječi:Cistanches Herba; Q-marker;odnos spektra i efekta; antioksidans

Cistanche deserticola je osušena mesnata stabljika sa ljuskavim listovima Cistanche deserticola YCMa ili Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, biljke koja pripada porodici Cistanche deserticola orbaceae. Tople je prirode, slatkog i slanog ukusa; vraća se u meridijane bubrega i debelog crijeva; ima efekte hranjenja janga bubrega, obnavljanja esencije i krvi, vlaženja crijeva i laksativa, te je važan lijek za toniziranje bubrega i obnavljanje esencije [2-3]. Bubrezi pohranjuju esenciju, a esencija i krv dolaze iz istog izvora. Ako esencija i krv nedostaju, to će uticati na ukupne životne aktivnosti ljudskog tijela; srž koja proizvodi esencija je pohranjena u kostima, a mozak je more srži. Ako je bubrežna esencija nedovoljna, kosti će izgubiti svoju ishranu i mozak će imati nedostatak, što će rezultirati degenerativnim promjenama kostiju kao što su labava tekstura, gubitak zuba, gubitak pamćenja, demencija i smanjena imunološka funkcija [4-6]. Cistanche deserticola sadrži feniletanoidne glikozide, iridoide, lignane i druge strukturne komponente, uključujući ehinakozid, verbaskozid, verbaskozid, genipinsku kiselinu i 8-epistrijansku kiselinu. , tubulin A, itd. [7]. Trenutna kontrola kvalitete Cistanche deserticola u izdanju "Farmakopeje Narodne Republike Kine" iz 2020. propisuje samo sadržaj ehinakozida i verbaskozida, koji ne može u potpunosti odražavati višekomponentne i višeciljne karakteristike djelovanja tradicionalne kineske medicine. , što nije pogodno za njegovu kontrolu i evaluaciju kvaliteta.

U cilju poboljšanja nivoa kontrole kvaliteta tradicionalne kineske medicine i optimizacije evaluacije kvaliteta tradicionalne kineske medicine, akademik Liu Changxiao je predložio novi koncept markera kvaliteta (Q-marker) tradicionalne kineske medicine [8]. Među njima, "efektivnost" je ključni element u "Pet principa" Q-markera [9] i također je srž evaluacije kvaliteta tradicionalnih kineskih lijekova.

S obzirom na trenutni istraživački status slabe korelacije između standarda kvaliteta i efikasnosti lijekova, istraživanje Q-markera tradicionalnih kineskih lijekova i uspostavljanje naučnih i razumnijih standarda kvaliteta od velikog je značaja za poboljšanje kvaliteta tradicionalnih kineskih lijekova. Odnos spektra i efekta povezuje hromatografske vrhove otiska prsta tradicionalne kineske medicine sa specifičnim farmakodinamičkim podacima kako bi se pronašle efikasne supstance tradicionalne kineske medicine, odražavajući na taj način inherentni kvalitet tradicionalne kineske medicine [10]. Uspostavljanje matematičkog modela spektralne efikasnosti može razjasniti QMarker tradicionalne kineske medicine iz perspektive "holističkog pogleda", pružajući više reference za kasniju kontrolu kvaliteta tradicionalne kineske medicine, formulaciju standarda kvaliteta i skrining aktivnih sastojaka. Ova studija koristi otiske prstiju u kombinaciji sa stopom poluinhibicije reaktivnih vrsta kisika (ROS IC50), sadržajem superoksid dismutaze (SOD) i katalaze (CAT) za proučavanje odnosa spektra i efekta tradicionalne kineske medicine, te koristi analizu glavnih komponenti. (PCA) ), Pearsonova korelacija (PCC) i parcijalna regresijska analiza najmanjih kvadrata (PLS) za sveobuhvatnu analizu Q-markera Cistanche deserticola kako bi se pružila osnova za njegovu kontrolu kvaliteta.

1 materijal

1.1 Uzorak

Cistanche deserticola je ubrana iz okruga Yutian, Xinjiang, i baze za sadnju Cistanche deserticola dobre poljoprivredne prakse (GAP) u Unutrašnjoj Mongoliji. Identificirao ga je istraživač Zhang Tiejun iz Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. kao Cistanche tubulosa (Schenk) Wight i Cistanche deserticola.

YC Ma, detaljne informacije su prikazane u tabeli 1.

1.2 Test lijek

Echinaceaside (broj serije: 111670-201907, čistoća: 91,8%) i verbaskozid (broj serije: 111530-201914, čistoća: 95,2%) oba su kupljena od Kineskog instituta za kontrolu hrane i lijekova; izoreskozid (serijski broj: 61303-13 -7), salidrozid (serijski broj: 10338-51-9), 8-epistrihnoična kiselina (broj serije: 82509-41-9), genipinska kiselina (serijski broj: Z24A10X95926) , tuberoza B (serijski broj: 112516-04-08), 2-acetil eugenol glikozid (serijski broj: 94492-24-7) kupljeni su od Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., čistoća veća ili jednaka 98%; Cistanche glikozid A (broj serije: MUST -20062806, čistoća: 98,51%), floridin A (broj serije: MUST19110102, čistoća: 98,57%) su kupljeni od Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; hromatografski čisti acetonitril i mravlja kiselina su kupljeni od kompanije Tianjin Concord Technology Co., Ltd.; Pročišćena voda (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Vitamin E (VE, V8010, Peking Solarbio Company); dimetil sulfoksid (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company of United States); CellTiter 96® AQueous komplet za detekciju proliferacije ćelija sa jednim rastvorom (G3580, Promega Company iz Sjedinjenih Država); CAT detekcija Komplet (S0051), komplet za detekciju SOD aktivnosti (S0101M) i komplet za detekciju ROS (S0033S) kupljeni su od Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Instrumenti

Waters H-klasa-PDA tečni hromatograf ultra-visokih performansi (Waters Company, SAD); Sartorius BT25S elektronska vaga (Sartorius Company, Njemačka); H1650 brza stolna centrifuga (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Čitač mikroploča (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); WYS-41XDY biološki mikroskop (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1.4 ćelije

Ćelije ljudskog embriona bubrega HEK 293 ćelije su korištene u ovom eksperimentu i kupljene su od banke ćelija Kineske akademije nauka.

2 metode

2.1 Uspostavljanje karte otiska prsta

2.1.1 Priprema otopine za ispitivanje: Izvagati 2 g ljekovitog materijala Cistanche deserticola, dodati 10 puta veću količinu vode, zagrijati i refluksirati 3 puta, svaki put po 1 h, centrifugirati na 1.0 ×105r·min-1 15 min (centrifugalni radijus je 300 mm), pomešati supernatante i koncentrovati da se dobije osnovni rastvor masene koncentracije od 100 mg·mL-1, razblažiti 10 puta, i filtrirajte ga kroz mikroporoznu filter membranu od 0,22 µm da biste ga dobili.

2.1.2 Priprema miješanog referentnog rastvora

Uzmite 8-epistrihničnu kiselinu, salidrozid, ehinaceaside, cistanche glikozid A, genipinsku kiselinu, verbaskozid, antocijanozid A, izsorbaskozid i 2'-acetil eugenol. Referentne supstance glikozida i angiozida B su izmjerene u odgovarajućim količinama i precizno izvagane. Dodajte 50% rastvor metanola da se rastvori i pripremite mešani rastvor referentne supstance masene koncentracije od 20 µg·mL–1.

2.1.3 Uslovi hromatografije

ACQUITY UPLC®BEH C18 kolona (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm); mobilna faza je acetonitril (A) ~ 0.1% rastvor mravlje kiseline (B), program eluiranja gradijenta (0 ~ 6 min, 5% ~ 8% A; 6~10 min, 8%~15%A 10~13 min, 15%~19%A, 13~20 min, 19%~25%A); talasna dužina detekcije je 237 nm; brzina protoka je 0,4 mL·min –1; temperatura kolone je 40 stepeni; zapremina injekcije je 3 µL.

2.1.4 Izbor referentnog vrha

U hromatogramu tečne hromatografije ultra-performanse (UPLC) Cistanche deserticola, pik sa najvećim omjerom površine vrha, umjerenim vremenom zadržavanja i dobrim odvajanjem odabran je kao referentni vrh spektra otiska prsta. 2.1.5 Metodološko ispitivanje Test preciznosti: Uzeti uzorak T1 i pripremiti ispitni rastvor prema metodi pod 2.1.1. Ubrizgajte uzorak 6 puta neprekidno i snimite otisak prsta. Rezultati pokazuju da je relativna površina pika RSD svakog vrha 0.10%~4.61%. , RSD relativnog vremena zadržavanja je 0,08%~1,32%, što ukazuje da instrument ima dobru preciznost.

Test ponovljivosti: Uzmite uzorak T1 i pripremite 6 uzoraka rastvora za ispitivanje paralelno prema metodi pod 2.1.1, i ubrizgajte uzorak kontinuirano. Rezultati pokazuju da je relativna površina pika RSD svakog hromatografskog pika 1,35%~4,80%, a relativno vreme zadržavanja RSD 0,10%~1,80%, što zadovoljava zahteve otiska prsta i pokazuje da je ponovljivost instrument je dobar.

Test stabilnosti: Uzmite uzorak T1 i pripremite otopinu za ispitivanje prema metodi pod 2.1.1, ubrizgajte uzorke za testiranje u 0, 2, 4, 8 i 12 sati i snimite otisak prsta. Izračunati RSD relativne površine pika svakog hromatografskog pika je 0,53%~4,82%, a RSD relativnog vremena zadržavanja je 0,09%~2,17%, što ispunjava uslove otiska prsta i pokazuje da je testni proizvod stabilan u roku od 12 sati.

2.2 Istraživanje antioksidativnog učinka Cistanche deserticola

2.2.1 Priprema matičnog likera Cistanche deserticola:Uzmite matičnu tečnost pod tačkom 2.1.1, filtrirajte i sterilišite, a pre upotrebe razblažite podlogom za kulturu do potrebne koncentracije.

2.2.2 Učinci Cistanche deserticola i pozitivne kontrole VE na održivost ćelija HEK 293

Postavite normalnu grupu (ćelijska suspenzija), grupu za davanje Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), VE grupu (20, 40, 60, 80, 100 µmol·L–1), svaki Set 6 duplih jažica pri svakoj koncentraciji i kulturi tokom 24 sata. Dodajte 20 µL reagensa CellTiter 96® AQueous sa pojedinačnim rastvorom u svaku jažicu da biste otkrili vitalnost ćelija. Nastavite sa uzgojem 2 sata. Koristite čitač mikroploče da detektujete vrednost apsorbancije (OD) svake jažice na 490 nm. Izračunajte stopu preživljavanja ćelija prema formuli (1). Stopa preživljavanja (%)=(OD eksperimentalna grupa/OD prazna grupa) × 100% (1)

2.2.3 Utjecaj Cistanche deserticola na ROS izazvan H2O2 u HEK 293 ćelijama

Ćelije su podijeljene u normalnu grupu (ćelijska suspenzija) i grupu za primjenu Cistanche deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola i 60 µm·L–1 H2O2) i kultivirane 24 h. Pratite korake kompleta za detekciju ROS-a za naredne operacije, direktno posmatrajte bojenje ćelije kroz mikroskop i koristite čitač mikroploče da detektujete intenzitet fluorescencije svake grupe. Postavke parametara koristile su talasnu dužinu ekscitacije od 488 nm i talasnu dužinu emisije od 525 nm. Eksperiment je ponovljen tri puta.

2.2.4 Učinak Cistanche deserticola na H2O2-indukovanu SOD ćelija HEK 293

Podijelite ćelije u normalnu grupu (ćelijska suspenzija) i grupu modela

(60 µm·L–1 H2O2), VE grupa (60 µm·L–1 VE i 60 µm·L–1 H2O2), grupa za davanje Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola i 60 µm·L–1 H2O2), sakupiti ćelije nakon 24 h kulture, dodati rastvor za pripremu uzorka SOD za lizu ćelija, centrifugirati na 4 stepena, 12000 r·min{19}} 5 min (centrifugalni radijus 300 mm), uzeti supernatant kao uzorak koji treba testirati, slijedite komplet za detekciju SOD-a Slijedite dolje navedene korake. Eksperiment je ponovljen tri puta.

2.2.5 Učinak Cistanche deserticola na H2O2-indukovanu CAT u HEK 293 ćelijama

Slijedite metodu pod 2.2.4 i grupnu primjenu, dodajte otopinu za lizu, centrifugirajte na 4 stepena, 12000 r·min-1 10 minuta (radijus centrifuge je 300 mm), uzmite supernatant i slijedite korake CAT komplet za detekciju. Prateće operacije. Eksperiment je ponovljen tri puta.

2.2.6 Statistička analiza

Za statističku analizu korišten je softver SPSS 26.0. Svaka grupa podataka je bila predstavljena sa (±±(). Jednosmjerna analiza varijanse je izvršena na podacima koji su odgovarali normalnoj distribuciji. Ako su varijanse bile jednake, korištena je metoda najmanje značajne razlike. Ako su varijanse bili neujednačeni, za crtanje je korištena Dunnettova T3 metoda GraphPad Prism 8, a P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Analiza korelacije spektra i efekta antioksidansa Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Područja vrhova uobičajenih pikova 10 serija Cistanche deserticola koje imaju uspostavljene otiske prstiju standardizirane su Z vrijednošću i pretvorene u matricu podataka reda veličine 10 × 17, koja je uvezena u softver SPSS 26.0 za PCA.

2.3.2 PCC Koristite SPSS 26.0 za provođenje bivarijatne analize za proučavanje odnosa spektralne efikasnosti između otisaka prstiju Cistanche deserticola i antioksidansa.

Testiranje značajnosti koristi dvostrani test (T) sa P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS Uvezite eksperimentalne rezultate standardizovane površine vrha i antioksidansa Cistanche deserticola u softver SIMCA-P 14.1, postavite površinu pika kao X varijablu i postavite farmakodinamički indeks kao Y varijablu za izvođenje PLS.

2.4 Provjera antioksidativne aktivnosti Q-markera Cistanche deserticola

2.4.1 Priprema aktivnog sastojka matične tečnosti

Precizno izmjerite odgovarajuće količine genipinske kiseline, 8-epistrinske kiseline, ehinaceasida, verbaskozida, izorebaskozida i antocijanozida A i dodajte DMSO da ih otopite u 10 mmol·L–1 za kontrolu. rješenje proizvoda.

2.4.2 Utjecaj aktivnih sastojaka na citotoksičnost HEK 293

Nakon što su ćelije HEK 293 inkubirane 24 sata, 100 µL rastvora aktivnog sastojka pod tačkom 2.4.1 (0,781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 µl·l) različite koncentracije su dodane u svaku jažicu, a stimulacija je nastavljena. CellTiter 96® AQueous reagens sa pojedinačnim rastvorom dodat je ćelijama 24 sata kasnije da bi se otkrila vitalnost ćelija.

2.4.3 Antioksidativni efekat aktivnih sastojaka na H2O2-indukovane HEK 293 ćelije

Ćelije su grupisane na sljedeći način: normalna grupa, model grupa, VE grupa su grupisane kao u 2.2.4, eksperimentalna grupa (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 aktivni sastojak i 60 µm·L–1 H2O2), kultivisan 24 h. Odredite intracelularne nivoe ROS, sadržaj SOD i CAT enzima prema metodama pod 2.2.3, 2.2.4 i 2.2.5.

Služba podrške Wecistanche

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/tel:+86 15292862950

Kupite za više detalja o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop