Proteini su pronađeni sa učestalošću od najmanje 2 u svakom ispitivanom stanju

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Nadalje, kao što je prikazano na grafikonima sa trakama na slikama 5B i 6B, karakteristična distribucija proteina prema hipoksičnom predkondicioniranju ćelija koje izlučuju je primjetna. U ovom slučaju, radi potpune informacije, prijavljeni su i proteini koji ne prelaze prag DAve i DCI skupa. Fetal ima rezultate sekretoma obogaćene proteinom toplotnog šoka od 60 kDa (HSPD1, slika 5B, lijevi panel) u svojoj hipoksičnoj formulaciji, dok je perinatalni pandan izrazito ekspresirao kontraktilni miozin stanica glatkih mišića [52] svjetlosni polipeptid 9 (MYL9, slika 5B, desni panel). Čini se da značajan dio razlike između gestacijskih faza više ovisi o hipoksičnom predkondicioniranju u hAFS. EVs; f-have-EV dobijeni iz hipoksične ćelije su obogaćeni faktorima uključujući Perlecan (HSPG2), Agrin (AGRN), Laminin Subjedinicu -5 i -1(LAMA5 i LAMB1), Trombospondin{{17 }} (THBS1, slika 6B, lijevi panel). Hipoksični p-hAFS-EV sadržavali su teški lanac feritina (FTH1), proteine ​​kao što su Flotillin-1(FLOT1), Fascin (FSCN1), Annexin A6(ANXA6), Rab GDP inhibitor disocijacije beta (GDI2), zajedno sa Thy -1 membranski glikoprotein (THY1), neuropilin-1(NRP1) i matrični metaloprotein 14 (MMP14, Slika 6B, desni panel).

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Proteini su pronađeni sa frekvencijom od najmanje 2 u svakom ispitivanom stanju u f-hAFS. EV i p-hAFS-EV su dalje upoređeni sa Vesciclepedia bazom podataka [53]. Kao što se i očekivalo, većina identificiranih proteina (96 posto) je prethodno opisana u EV-ima i egzosomima u referentnoj bazi podataka (slika S3A).cistanche benefitsU tom smislu, analiza obogaćivanja genske ontologije (GO) izvršena je pomoću FunRich-a [54]. Obilje GO termina u skupu podataka upoređeno je s njihovom prirodnom količinom u referentnoj bazi podataka kako bi se pronašle statistički previše zastupljene grupe proteina, prema njihovoj uključenosti u biološke procese, molekularne funkcije i ćelijske komponente (za ovaj posljednji aspekt podaci nisu prikazano, ali dostupno na zahtjev). Što se tiče analize molekularnih funkcija povezanih sa identifikovanim proteinima, frakcije hAFS-CM su pokazale obogaćivanje strukturnog sastojka ekstracelularnog matriksa i citoskeleta, vezivanje proteina citoskeleta i aktivnost strukturnih molekula (slika S2), dok su hAFS-EV obogaćeni strukturnim sastojak citoskeleta i ribozoma, DNK i RNK vezivanje i GTPaza i faktori vezivanja šaperona (Slika S3C).

Analiza obogaćivanja bioloških procesa i za hAFS-CM i za have-EV pokazala je da većina proteina moduliranih u frakcijama fetalnog i perinatalnog hAFS sekretoma pripada rastu/održavanju ćelija i metabolizmu proteina (Slike 5C i 6C). Unutar hAFS-EVs primijetili smo da je izraz "strukturni sastojci ekstracelularnog matriksa" isključivo povezan sa hipoksičnim f-hAF-EV; termini "vezivanje jona kalcijuma" i "strukturna molekularna aktivnost" uglavnom su obogaćeni hipoksičnim f-hAFS i p-hAFS uzorcima (slika S3B).

Figure 6. Comparative proteomics analysis of fetal- and perinatal hAFS-EVs. (A)Venn diagram illustrating the distribution of proteins identified with a frequency of at least 2 within f-hAFS-EVSnormo (dark yellow),f-hAFS-EVSHypo (red), p-hAFS-EVSnormo (light green), and p-hAFS-EVShypo (dark green). (B)Differentially expressed proteins were identified in fetal hAFS-EVs (left panel) and perinatal hAFS-EVs (right panel) by label-free quantification with MAProMa software. Left panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between normoxic control (dark yellow bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (red bars and positive DAve values) of f-hAFS-EVs over p-hAFS-EVs. Right panel: histogram reporting the differential expression of proteins found upregulated between control normoxic (light green bars and negative DAve values) and hypoxic preconditioning (dark green bars and positive DAve values) of p-hAFS-EVs over f-hAFS-EVs. Proteins with DAve (ratio of protein expression)>10.4I i DCI (pouzdanost diferencijalne ekspresije) Veći ili jednaki I5I prošli su filtere i smatrani su diferencijalno izraženima; pogledajte Tabelu S3 za kompletnu listu i detaljne parametre prijavljenih proteina. (C) Analiza obogaćivanja bioloških procesa proteina identificiranih sa frekvencijom od najmanje 2 u f-hAFS-EVs (lijevi panel) i p-hAFS-EVs (desni panel) nakon hipoksičnog predkondicioniranja. Zasnovano na alatu FunRich, pojmovi ontologije gena su prikazani u trakastim grafikonima koji izvještavaju o postotku gena obogaćenih za svaku kategoriju (tamno žute trake za f-hAFS-EVsnormo, crvene trake za f-hAFS-EVShypo, svijetlozelene trake za p-hAFS -EVsnormo i tamnozelene trake za p-hAFS-EVShypo). Samo termini genske ontologije sa ispravljenim Bonferonijem*str<0.05 are="">

Cistanche može protiv starenja

2.6. Citokinsko i hemokinsko profiliranje fetalnog i perinatalnog has-CM i have-EVs otkrilo je različite obrasce distribucije

Prethodno smo potvrdili regenerativni kapacitet f-hAFS-CMhypo na oštećenim kardiovaskularnim ćelijama putem parakrinih efekata [34,35,49]. Ovdje smo uporedili sadržaj citokina i hemokina u f-hAFS-CMHypo sa odgovarajućim p-hAFS parom (slika 7A, slika S4A i tabela S4) i pronašli neke diskriminirajuće faktore.

ANGIOGENIN, induktor ekstracelularnog matriksa metaloproteinaze (EMMPRIN), interleukin 8 (IL-8) i monocitni hemoatraktantni protein-1 (MCP-1) pronađeni su isključivo obogaćeni inf-hAFS-CMNypo i nisu otkriven u p-hAFS-CMhypo. Inzulinu sličan faktor rasta vezujući protein 2 (IGFBP2) i osteopontin (OPN) značajno su povećani u f-hAFS-CMhypo u odnosu na p-hAFS-CMHypo za 3.5-i 3.{18}} puta (" str<0.05 and=""><0.01 respectively,="" figure="" 5a).="" plasminogen="" activator="" inhibitor-1(pai-1)="" was="" strongly="" expressed="" in="" both="" f-hafs-cmhypo="" and="" p-hafs-cmnypo="" (figure7a).="" other="" cytokines="" were="" detectable="" at="" low="" levels,="" namely="" cystatin="" c(cst3),="" fibroblast="" growth="" factor="" 19="" (fgf-19)interleukin-17a="" (il-17a),="" macrophage="" migration="" inhibitor="" factor="" (mif),="" pentraxin="" 3="">

Dok su fetalni u odnosu na perinatalni has-CM pokazali diferencijalnu ekspresiju u svom profilu citokina i hemokina, odgovarajući fetalni u odnosu na perinatalni EV parnjaci su bili homogenije raspoređeni, iako sa nižim profilima ekspresije (Slika 7B, Slika S4B i Tabela S5). Ipak, neke razlike se mogu uvažiti: DiPeptidil-Peptidaza IV (DPPIV), Faktor rasta/diferencijacije 15 (GDF-15) i IL-8 su izraženi samo od strane f-hAFS-EVSHypo, iako na niskim nivoi; ANGIOPOIETIN2, CD40 LIGAND i vitamin D-vezujući protein (VDBP) pronađeni su samo u p-hAFS-EVShypo, uprkos tome što su ponovo otkriveni u malim količinama. Ostali citokini kao što su neurotrofni faktor iz mozga (BDNF)ENDOGLIN, FGF-19, inzulinu sličan faktor rasta vezujući protein 3 (IGFBP3), IL-17a, MIF OPN, PTX3, stromalni faktor{ {23}} alfa (SDF-1a), pronađeni su i u f-hAFS-EVShypo i p-hAFS-EVSHvpo, pri čemu su PAI-1 i EMMPRIN više izraženi (Slika 7B)

BDNF, ENDOGLIN, IGFBP3 i SDF-lo su bili isključivo obogaćeni svim hipoksičnim he-EV u poređenju sa odgovarajućim hAFS-CM, bez obzira na gestacijski stadij. Štaviše, dok EMMPRIN nije detektovan unutar p-hAFS-CMhypo, nađeno je da je obogaćen odgovarajućom frakcijom EV; obrnuto, OPN je bio zastupljeniji u f-have-CMhypo nego u f-have-EVShypo, dok je bio uporediv među odgovarajućim frakcijama sekretoma p-hAFS. FGF-19,MIF i PTX3 su slično eksprimirani u fetalnom i perinatalnom has-CM iu odgovarajućim hAFS-EVs. PAI{16}} je bio visoko obogaćen hipoksičnim frakcijama sekretoma.

Slika 7. Profiliranje citokina i hemokina unutar fetalnih i perinatalnih formulacija hAFS sekretoma. (A) Ekspresija citokina i hemokina otkrivena u hipoksičnom fetalnom nasuprot perinatalnog has-CM (f-hAFS-CMHypo vs p-hAFS-CMHypo) prikazana je u gustini piksela prema proizvoljnoj jedinici [AU]. Vrijednosti su izražene kao srednji ±sem nezavisnih eksperimenata i prikazane u Tabeli S4;*p=0.0485;**p=0.006.(B) Sadržaj citokina i hemokina otkriven u hipoksičnom fetalnom u odnosu na perinatalne hAFS-EVs (f-hAFS-EVSHypo vs p-hAFS-EVSHypo) i izraženo gustinom piksela u proizvoljnim jedinicama [AU].cistanche holesterolVrijednosti su izražene kao srednja vrijednost±sem od n=3 nezavisnih eksperimenata i prikazane u Tabeli S5. CST3: Cistatin C;EMMPRIN:Induktor metaloproteinaze ekstracelularnog matriksa;FCFF-19: Faktor rasta fibroblasta-19;IGFBP2:Faktor rasta sličan insulinu (IGF)vezujući protein 2;IL-8:Interleukin -8;IL-17a:Interleukin-17a; MCP-1: Monocitni hemoatraktantni protein-1;MIF: Faktor inhibicije migracije makrofaga; PTX3: Pentraxin 3; PAI-1: Inhibitor aktivatora plazminogena-1; BDNF: neurotrofni faktor iz mozga; DPPIV: Dipeptidil peptidaza IV; GDF-15: Faktor diferencijacije rasta-15;IGFBP3: Faktor rasta sličan insulinu (IGF) vezujući protein 3; SDF-1a: Stromalni izvedeni faktor-1 alfa; VDBP: Vitamin D-vezujući protein.

2.7.Fetalni i perinatalni imaju-EV obogaćeni su RNA informacijama u svom teretu

Budući da se male nekodirajuće RNK smatraju glavnim regulatorima EV parakrinog utjecaja na ciljne stanice [4,55], uglavnom smo fokusirali analizu sekvenciranja RNK na sadržaj mikroRNA (miRNA) unutar f-hAFS-EV i p-hAFS-EV. Mali RNK profil je pokazao obogaćivanje miRNA u fetalnim i perinatalnim hAFS-EVs (oko 35-36 posto) u poređenju sa ukupnom malom količinom RNK (Slika 8A). Komponenta miRNA je zaista bila među dvije najzastupljenije vrste RNK u obje EV formulacije, zajedno sa rRNA(***p) p < 0.0001).="" sljedeće="" mirna="" su="" bile="" najviše="" obogaćene="" u="" analiziranim="" uzorcima="" ev:="" mir-31-5p;="" mir-196a-5p;="" mir-93-5p;="" mir-100-5p;="" mir{18}}a-5p;="" mir-27b-3p,="" neka-7a-5p,="" neka-7b-5p,="" neka-7f{="" {27}}p,="" neka-7i-5p,mir-16-5p,mir-21-5p,mir-29a-3p,="" mir30a-5p,="" mir-125b-5p,mir-155-5p,mir-191-5p="" i="" mir-221-3p.="" treba="" napomenuti="" da="" fetalni="" i="" perinatalni="" imaju-ev="" dijele="" većinu="" takvih="" mirna="" (naime="" let-7a-5p,let-7b-5p,="" neka{{47="" }}f-5p,="" neka-7i-5p,="" mir-16-5p,="" mir-21-5p,="" mir{53}}a{{54="" }}p,mir30a-5p,="" mir-125b-5p,="" mir-155-5p,="" mir-191-5p="" i="" mir-221-3p,="" slika="" 7b).="" 15="" najbogatijih="" vrsta="" mirna="" pokrivaju="" više="" od="" 60="" posto="" ukupnog="" sadržaja="" mirna="" u="" svakom="" uzorku.="" s="" druge="" strane,="" oko="" 100="" mirna="" pronađeno="" je="" u="" preostalih="" 30="" posto="" sadržaja="" vezikularne="" mirna="" (slika="">

Da bismo dalje karakterizirali sadržaj miRNA unutar hAFS-EVs, istražili smo da li hAFS gestacijski stadij ili in vitro hipoksična predkondicioniranje stanica može utjecati na obogaćivanje specifičnih miRNA. Najjača modulacija je pronađena između gestacijskih faza, gdje su gotovo sve modulirane miRNA bile obogaćene f-hAFS-EV u odnosu na perinatalni par (Slika 9A i Tabela 1). Hipoksično predkondicioniranje imalo je blaži učinak na miRNA teret, dok je u ovom poređenju modulacija bila u oba smjera, pri čemu su neke miRNA obogaćene hipoksičnim, a druge u normoksičnim kontrolnim uvjetima (Slika 9A).

Kao komplementarnu analizu, fokusirali smo se na identifikaciju istraživanih miRNA sa najnižom varijabilnosti kod različitih donatora i predkondicioniranja kulture, za EV izvedene iz oba ispitivana gestacijske faze. miRNA koje su rezultat ove analize kretale su se od visokog do niskog nivoa ekspresije (Slika 9B). Unutar najstabilnijeg miRNA jezgra tereta hAFS-EV, identificirane su neke zajedničke miRNA između f-hAFS-EV i p-hAFS-EV (miR-21-5p, miR-29a-3 p, miR-16-5p na visokom nivou; miR-221-3p,miR-221-5p i miR-22-3p na nivou zatamnjenja, tabela 2).

Slika 9. Analiza diferencijalnog obogaćivanja miRNA u fetalnim i perinatalnim hAFS-EVs. (A) Vulkanski dijagrami za diferencijalno obogaćivanje tereta hAFS-EV miRNA prema gestacijskoj fazi (lijevi panel) i in vitro hipoksično predkondicioniranje ćelija koje izlučuju (desni panel). Za detalje o miRNA, molimo pogledajte Tabelu 1. (B) Dijagram rasipanja korelacije između varijabilnosti (X os) i nivoa obogaćivanja (Y osa) stabilnih miRNA unutar fetalnih hAFS-EVs (lijevi panel) i perinatalnih hAFS-EVs (desni panel) prema visokim (žute tačke), prigušeno (zelene tačke) i nisko (tamno ljubičaste tačke) obogaćivanje. Za detalje o miRNA, molimo pogledajte tabelu 2.RPM: čitanja na milion.

3. Diskusija

Ostaci odbačenih uzoraka ljudske amnionske tekućine identificirani su kao vrijedan izvor stromalnih ćelija sa obećavajućim potencijalom u regenerativnoj medicini i tkivnom inženjerstvu. Etički problemi povezani s njihovom izolacijom su minimalni, jer se mogu dobiti ili iz ostataka uzoraka rutinske prenatalne skrining amniocenteze, tokom II trimestra gestacije (fetalni hAFS), ili iz amnionske tekućine odbačene kao klinički otpad u III trimestru zakazanog carskog reza. procedure (perinatalni hAFS). Poslednjih godina, hAFS su predloženi kao potencijalni terapeutici za popravku i regeneraciju ljudskog tkiva s obzirom na ohrabrujuće dokaze dobijene iz eksperimentalnih modela bolesti. Zanimljivo je da su predloženi i za in utero terapiju fetalno-neonatalnih neuroloških bolesti; zaista, pretkliničke studije su sugerirale da hAFS primijenjen prenatalno putem intra-amnionske isporuke štiti kičmenu moždinu tijekom trudnoće putem parakrine aktivnosti kod pacovog modela mijelomeningocele [56-58], i smanjuje oštećenje izloženog crijeva kod eksperimentalne gastrošize glodara[59 ]. Iz translacijske perspektive, in utero transplantacija hAFS-a mogla bi se zamijeniti primjenom najprikladnijeg preparata njihovog sekretoma (hAFS-CM ili hAFS-EVs).nuspojave cistanche deserticolaOva strategija bi omogućila brzu i pravovremenu intervenciju tokom gestacije tako što bi se prevazišla ograničenja kanonske ćelijske terapije (tj. dugotrajna in vitro ćelijska ekspanzija) dok bi se osigurale farmaceutske formulacije koje su spremne za upotrebu.

Nedavni razvoj manje invazivnih tehnika prenatalne dijagnostike može dovesti do smanjenja procedura amniocenteze u bliskoj budućnosti, zagovarajući perinatalni hAFS kao pristupačniju opciju. Ipak, budući da su fetalni hAFS razvojno nezreliji, oni mogu imati efikasniji parakrini potencijal. U okviru ovog scenarija, ovdje smo uporedili fetalni i perinatalni c-KITt hAFS i fokusirali smo se na profiliranje njihovih frakcija sekretoma. Istaknuli smo relevantne razlike koje treba uzeti u obzir za mogući klinički prijevod njihovog parakrinog kapaciteta.

U skladu sa prethodnim nezavisnim studijama, pokazujemo da gestacijska faza nije uticala na heterogenu morfologiju hAFS-a i njihov mezenhimalni antigen profil [25,26]. Zatim smo procijenili parametre koji će vjerojatnije utjecati na sekretornu i parakrinu aktivnost stanica izvan kanonskog stromalnog imunofenotipa. Nedavno je pokazano da prisustvo CD146-pozitivne subpopulacije visoke CD107a unutar mezenhimalnih progenitora koštane srži korelira sa izuzetnom modulatornom i terapijskom parakrinom aktivnošću [47]. Ovdje smo otkrili da su i fetalni i perinatalni hAFS snažno obilježeni ovim molekularnim potpisom koji podržava njihovu sekretornu moć s relevantnim translacijskim implikacijama. Štaviše, fetalne hAFS karakteriše neefikasan aerobni metabolizam, dok zreliji perinatalni pokazuju veću potrošnju kiseonika i sintezu ATP-a. Ovo može ukazivati ​​na nezreliji metabolički profil hAFS-a u II tromjesečju koji podsjeća na stromalne ćelije pupčane vrpce nedonoščadi, koje su pokazale isti trend [60].

Da bi se pokrenuo parakrini potencijal, hAFS su bili izloženi hipoksičnom prajmingu bez seruma 24 sata, strategiji koju smo prethodno uspješno razvili [34,35,37] za fetalne ćelije i koju smo ovdje prvi put istražili na njihovom perinatalnom paru. Predkondicioniranje fetalnog i perinatalnog hAFS-a pod hipoksijom rezultiralo je pozitivnim trendom povećanja koncentracije njihovog sekretoma i količine oslobođenih EV, dok gestacijska faza nije imala nikakav utjecaj na prinos sekretoma ćelije niti na morfologiju i distribuciju EV-a.

Značajno, karakterizacija hAFS parakrinog tereta otkrila je neke specifične razlike, u skladu sa različitim uslovima koje smo procijenili. Proteomsko profilisanje fetalnog hAFS sekretoma otkrilo je uočljive distribucije faktora zasnovane na gestacijskom stadiju i hipoksičnom predkondicioniranju ćelija. Ovo ukazuje da hAFS parakrini potencijal može steći poseban identitet tokom sazrevanja od Ⅱ do Ⅲ trimestra gestacije koji se zauzvrat može modulirati stimulacijom sekretirajućih ćelija in vitro. Analiza obogaćivanja bioloških procesa hAFS-CM i hAFS-EV sugerirala je da većina moduliranih proteina može biti usklađena sa rastom/održavanjem ćelija i metabolizmom proteina, podržavajući tako korisne parakrine efekte na ćeliju o kojima se do sada govori. Konkretno, otkriveno je da je hipoksični fetalni hAFS ukupni sekretom obogaćen proteinom toplotnog šoka HSPD1 (HSP60), za koji je pokazano da podržava zacjeljivanje rana u modelu ozljede kože dijabetičkog miša i da promoviše iskrivljavanje makrofaga u fenotip M2 [61]. . Isto tako, hipoksični fetalni hAFS-EV obogaćeni su faktorima koji promovišu neurogenezu (HSPG2[62], samoobnavljanje ćelija i razvoj mozga i kardiovaskularnog sistema (LAMA5[63]i LAMB1[64]i migracija (THBS1 [2]).) Proteoglikan AGRN je također pronađen u EV nakon hipoksičnog prajminga fetalnog hAFS-a.cistanche dosage redditNaši nalazi su u skladu s prethodnim dokazima o povećanju regulacije AGRN-a u proteomu mezenhimalnih stromalnih stanica pod upalnim i hipoksičnim instruktivnim stimulansima[65]. Također se pokazalo da je AGRN uključen u signalizaciju imunoloških sinapsi [66] i da se slaže s regeneracijom srca novorođenčeta miša [67], podržavajući na taj način izraženu predispoziciju razvojno mladog fetalnog hAFS-a prema regenerativnim parakrinim efektima. Štaviše, potvrđeno je da fetalni hAFS bolje reaguje na hipoksično predkondicioniranje, što pokazuje obogaćivanje prediktora vaskularne regenerativne efikasnosti, kao što su ANGIOGENIN, EMMPRIM, IL-8 i MCP-1 citokin[68], u njihov uslovljeni medij. Ovo podržava prethodne dokaze o parakrinoj potenciji fetalnog hAFS-CM u jačanju endogene neoarteriogeneze u pretkliničkim modelima infarkta miokarda, ishemije stražnjih ekstremiteta i ishemijskog fasciokutanog režnja [34,69-71] Nadalje, fetalni fetus Utvrđeno je da je ukupni sekretom znatno više obogaćen IGFBP2 i OPN-om u poređenju sa perinatalnim, što ukazuje na izraženiji modulatorni profil za rješavanje problema i protiv starenja[72-75]. Perinatalni has-CM, iako je bio manje pojačan u parakrinim faktorima, bio je na sličan način dopunjen neurotrofnim i imunomodulatornim faktorima, kao što su CST3[76,77] i MIF[78].

U poređenju sa ukupnim hAFS-CM, odgovarajući hipoksični fetalni i perinatalni EV dvojnici su pokazali nižu ekspresiju citokina i hemokina, sa izuzetkom medijatora vaskularnog remodeliranja EMMPRIN [79], koji je uglavnom bio obogaćen u kompartmentu vezikula. Prethodno prijavljeni kardioaktivni i pro-regenerativni profil fetalnih hAFS-EV[34,37] je ovdje potvrđen dokazima o njihovoj isključivoj ekspresiji kardioprotektivnog IL-8 [80] i GDF-15, ključni parakrini faktor koji pokreće endogenu neurogenezu hipokampusa odraslih[81,82], kao i suprotstavljanje kardiotoksičnosti izazvanoj antraciklinom [78]. I fetalni i perinatalni hAFS-EV su pokazali sličnu ekspresiju za regulator trgovine progenitorima/matičnim ćelijama SDF-1 [83-85]. Proteomska analiza je pokazala povećanu ekspresiju proteina povezanih sa angiogenezom, kao što su NRP1 [86] i MP14[87] u hipoksičnim perinatalnim hAFS-EV; takav stimulativni profil može objasniti prethodne rezultate o endotelnim regenerativnim svojstvima hAFS-a u Ⅲ trimestra u pretkliničkom mišjem modelu ishemijske ozljede skeletnih mišića [25], uprkos dokazima da je njihov hAFS-CM manje pro-angiogen od odgovarajućeg fetalnog. Značajno je da je neuralni faktor rasta BDNF pronađen i u fetalnom i u perinatalnom EV teretu, iako u malim količinama, što ukazuje na pretpostavljenu neurotrofičku aktivnost za hAFS-EV u neuronskom preživljavanju i neurorazvojnim procesima, kao što je također uočeno za ekstracelularne vezikule koje luče ljudske kosti. krv iz srži i pupčane vrpce-MSC[8889]. Obje formulacije sekretoma iz fetalnog i perinatalnog hAFS-a koje su podvrgnute hipoksičnoj stimulaciji pokazale su se da su obogaćene PAI-1, fasilitatorom endotelne aktivacije [90] koji je također bio uključen u polarizaciju M2 makrofaga u srcu i obdaren kardioprotektivnim i antifibrozni potencijal [91].

MikroRNA (miRNA) su široko razmatrane kao ključni regulatori parakrine aktivnosti matičnih ćelija i mezenhimalnih stromalnih ćelija EV [92,93]. Ovdje smo otkrili da 15 najbogatijih vrsta miRNA unutar hAFS-EV pokriva više od 60 posto ukupnog sadržaja miRNA u svakom uzorku. Prijavljeno je da ove miRNA karakteriziraju molekularni teret mezenhimskih stromalnih stanica-EV (neka-7a-5p [4,95]), štite od ishemije miokarda utječući na vaskularnu regeneraciju i inhibirajući fibrozu (neka -7b-5p, let-7f-5p, miR-21-5p i miR-155-5p [96,97]), promovirati zacjeljivanje rana regulacijom funkcije keratinocita (miR-16-5p [98]) i suprotstavljanje smrti neurona nakon ishemije prednjeg mozga (miR-29a-3p [99,100]). S druge strane, oko 1000 miRNA pronađeno je u preostalih 30 posto sadržaja vezikularne miRNA. Takva neuravnotežena distribucija je u skladu s prethodnim studijama [4] i ističe uglavnom obogaćene miRNA kao one koji su navodno odgovorni za glavnu biološku aktivnost hAFS-EV. Zanimljivo je da su fetalni i perinatalni hAFS-EV dijelili većinu od 15 miRNA. Treba napomenuti da smo također primijetili da i fetalni hAFS-EV i perinatalni sadrže skup vrlo stabilnih miRNA na različitim nivoima obogaćivanja. Takvi dokazi mogu sugerirati širok spektar kandidata za "kućno održavanje" koji će se koristiti kao interna referentna kontrola u qPCR eksperimentima na hAFS-EV. Štaviše, konzistentan podskup takvih stabilnih miRNA (miR-16-5p,miR-21-5p,miR-22-3p,miR-29a-3p,miR{ {40}}y miR-221-5p) se dijeli između dvije gestacijske faze i preklapa se sa 15 uglavnom obogaćenih, sugerirajući još konstantnije ponašanje i pouzdani molekularni potpis prije rješavanja ([96,{{45 }}]). Treba napomenuti da je nekoliko kandidata unutar takvog karakterističnog jezgra nedavno prijavljeno kao referentne miRNA unutar neuroprotektivnih EV dobijenih iz mezenhimalnih stromalnih stanica iz amnionske tekućine iz II trimestra (miR-29a-3p i miR{{ 49}}str[95]). Ipak, također smo primijetili da gestacijska dob može više modulirati teret miRNA nego hipoksično predkondicioniranje. Razvojno više juvenilnih EV dobijenih iz fetalnog hAFS-a fetusa u III trimestru obogaćeni su miRNA za koje je ranije pokazano da podržavaju održivost embrionalnih matičnih stanica (miR-302-3p [101]), proliferaciju stanica i osteogenu diferencijaciju stromalnih stanica koštane srži (miR -217 [102]), a istovremeno ima potencijal supresije tumora (miR-302-3p[103,104]); miR-383-5p[105,106]).

Na osnovu naših rezultata, ovdje potvrđujemo da fetalni i perinatalni hAFS mogu predstavljati atraktivne parakrine izvore koji se mogu koristiti za regenerativnu medicinu. Iako su njihov fenotip i sekretorna aktivnost bili slični, mi smo istakli neke neobične aspekte u njihovim formulacijama sekretoma kao korisne uvide za njihov budući terapijski prijevod.

4. Materijali i metode

4.1. Izolacija matičnih ćelija ljudske amnionske tekućine i in vitro kultura

Matične ćelije ljudske amnionske tečnosti (hAFS) izolovane su iz zaostalih uzoraka amnionske tečnosti (AF) prikupljenih rutinskim prenatalnim skriningom putem amniocenteze u Ⅱ tromesečju (fetalni hAFS, f-hAFS) ili kao klinički otpad tokom planiranog porođaja carskim rezom tokom Ⅲ trimestra. (perinatalni hAFS,p-hAFS) u Jedinici za prenatalnu dijagnostiku i perinatalnu medicinu, IRCCS San Martino bolnica, u Odjeljenju za medicinu i hirurgiju za fetalne i perinatalne bolesti i Laboratoriju za humanu genetiku u bolnici IRCCS Istituto Gaslini (Genova, Italija). Informirani pismeni pristanak je dobijen od svih donatora prema ovlaštenju lokalnog etičkog odbora (protokol PR428REG2015) iu skladu sa smjernicama Helsinške deklaracije. Uzorci fetalne AF u drugom tromjesečju dobijeni su od donora prosječne starosti od oko 37,42±0,32 godine (n=15 u rasponu od 36-do 41 godine); Ⅲ trimestarski perinatalni AF uzorci su dobijeni od donorke prosječne starosti 34,25±1,31 godina (n=10 u rasponu od 26- do 42 godine). Fetalni i perinatalni hAFS su dobijeni iz uzoraka validiranih za normalan kariotip i izolovani imunomagnetnim sortiranjem za ekspresiju c-KIT (CD117 MicroBead Kit, Miltenyi Biotechnology, Bologna, Italija) iz adherentnih AF mezenhimalnih stromalnih ćelija[16].prednosti ekstrakta cistanchec-KIT* hAFS su uzgajani u minimalnom osnovnom mediju (MEM)-alfa sa 15 posto FBS (fetalni goveđi serum, Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), 18 posto Chang B i 2 posto Chang C medija (Irvine Scientific , Santa Ana, Kalifornija, SAD) sa 1 posto L-glutamina i 1 posto penicilina/streptomicina (Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), u inkubatoru na 37 stepeni sa 5 posto CO2 i 20 posto atmosfere Oz i kultivirano do 5 pasaža in vitro prije nego što se koriste za izolaciju njihovog sekretoma.

4.2.Biohemijska evaluacija metabolizma hAFS

Cell aerobic metabolism was evaluated in terms of oxygen consumption and ATP synthesis through the FI-Fo ATP synthase. Oxygen consumption rate (OCR) was measured at 37 ℃ in a closed chamber magnetically stirred using an amperometric electrode (Unisense-Microrespiration, Unisense A/S, Denmark). One hundred thousand (10>) ćelije su korištene za svaki eksperiment. Da bi se procijenilo bazalno disanje, hAFS je permeabiliziran sa 0.03 mg/mL digitonina u trajanju od 10 minuta i suspendiran u fiziološkom rastvoru fosfatnog pufera (PBS). 10 mM piruvata plus 5 mM malata ili 20 mM sukcinata je dodano da stimulira put -načini sastavljeni od kompleksa I, II i IV ili kompleksa Ⅱ i IV, respektivno [60].

Da bi se procijenio relativni doprinos respiraciji glutamina, dugolančane oksidacije masnih kiselina i glukoze, nakon permeabilizacije digitoninom, stanice su suspendirane u mediju za rast i 4 uM BPTES, 4 uM Etomoksira i 4 uM UK5{{22} }99 su dodani da inhibiraju glutaminazu, karnitin palmitoil-transferazu 1A(CPT1A), odnosno mitohondrijalni piruvatni nosač (MPC). Aktivnost Fi-F.ATP sintaze (ATP sintaze) je otkrivena mjerenjem proizvodnje ATP-a visoko osjetljivom metodom luciferin/luciferaze. Testovi su rađeni na 37 stepeni, u trajanju od 2 minute, a podaci su prikupljani svakih 30 s. U prvom setu eksperimenata, ćelije od 10 stepena su inkubirane 10 min u mediju koji sadrži 50mM KCl,1mMEGTA,2mMEDTA,5mMKH2PO4,2mMMgC12,0.6mMouabain,1mM P1P5- (adenozin-5')penta-fosfat, 0,040 mg/mL ampicilina i 10 mM Tris-HCl pH7,4. Nakon toga, sinteza ATP-a je inducirana dodatkom respiratornih supstrata (10 mM piruvata plus 5 mM malata ili 20 mM sukcinata) i 0,1 mM ADP. Reakcija je mjerena korištenjem kompleta za bioluminiscenciju luciferin/luciferaze ATP CLSII (Roche, Basel, Švicarska) u luminometru (GloMax 20/20 Luminometar, Promega, Milano, Italija) ATP standardnim otopinama (Roche, Basel, Švicarska) u rasponu {{ 42}}/M su korišteni za kalibraciju. U drugom setu eksperimenata, sinteza ATP-a je procijenjena u prisustvu 4 uM BPTES, 4 uM Etomoksira ili 4 uM UK5099. U ovom slučaju, 10 ćelija je inkubirano 10 minuta u mediju za rast u odsustvu ili prisustvu inhibitor metabolizma, a sinteza ATP-a je indukovana sa 0,1 mM ADP. Efikasnost OxPhos (oksidativne fosforilacije) (P/O odnos) izračunata je kao odnos između koncentracije proizvedenog ATP-a i količine utrošenog kiseonika u prisustvu respiratornog supstrata i ADP-a. Kada je potrošnja kisika u potpunosti posvećena proizvodnji energije, P/O omjer bi trebao biti otprilike 2,5 i 1,5 nakon dodavanja piruvata plus malata ili sukcinata, respektivno [48] Da bi se procijenio doprinos anaerobne glikolize metabolizmu hAFS-a, procijenjene su koncentracije glukoze i laktata u medijumu za rast. Potrošnja glukoze je procijenjena pomoću heksokinaze (HK) i glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (G6PD) sistema, nakon smanjenja NADP na 340 nm. Podloga za analizu je sadržavala 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM ATP, 10 mMNADP, 2 mMMgC12, 2 IU heksokinaze i 2 IU glukoza{69}}fosfat dehidrogenaze. Oslobađanje laktata je analizirano nakon redukcije NAD plus na 340 nm. Podloga za analizu je sadržavala 100 mM Tris-HCl (pH8), 5 mM NAD plus i 1 IU/mL laktat dehidrogenaze. Uzorci su analizirani prije i nakon dodavanja 4 ug pročišćene laktat dehidrogenaze. U oba slučaja, podaci su normalizovani na broj ćelija i izraženi kao mM glukoze/10 stepeni ćelija ili mM oslobođenog laktata/10 stepeni ćelija, respektivno[107].

4.3. Protočna citometrija Karakterizacija hAFS-a

Sto hiljada (105)fetalnih i p-hAFS ćelija je odvojeno i inkubirano sa mišjim anti-humanim-CD107a-Alexa Fluorom 647-i anti-humanim CD146-FITC- konjugirana antitijela (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija). Apoptoza ćelija je procenjena korišćenjem FITC kompleta za otkrivanje apoptoze Aneksina V (BD Pharmingen, Becton Dickinson, Mi-lan, Italija) prema uputstvima proizvođača. Događaji su prikupljeni na BD Bioscience FACS Aria II sorteru i analizatoru, opremljenom softverom FACS Diva (BD Bioscience, Bec-ton Dickinson, Milano, Italija). Podaci su analizirani korištenjem FlowJo V9.0 softvera (BD Bioscience, Becton Dickinson, Milano , Italija). 4.4. Bojenje starenjem

Fenotip starenja hAFS kultivisan do pasaža 5 u standardnim in vitro uslovima je procenjen sa kompletom za bojenje Senescence -Galactosidase (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, SAD): f-hand p-hAFS je fiksiran sa 1x rastvorom Fixative na 70 procenata konfluencije i obojen za SA- -gal na 37 stepeni preko noći, prema uputstvima proizvođača. Događaji starenja su snimljeni na Leica DMil mikroskopu (opremljen Leica Acquire softverom V3.4.4, Leica Microsystems, Milano, Italija) i procijenjeni kao postotak SA- -gal-pozitivnih ćelija u odnosu na ukupne ćelije po polju.

4.5. Odvajanje i koncentracija frakcija hAFS sekretoma

f-hAFS i p-hAFS su uzgajani 24 h u mediju bez seruma (SF) u 1 posto O2 hipoksije naspram 20 posto O2 normoksije (kontrola), od kojih je potonja korištena kao referentna vrijednost. Ova strategija predkondicioniranja korištena je za poboljšanje oslobađanja bioaktivnih parakrinih faktora, kao što smo ranije izvijestili [34,35,37,49]. hAFS su kultivirani 24 sata u mediju bez seruma (SF) (visokoglukozni Dulbecco modificirani Eagleov medij, DMEM, sa 1 posto L-glutamina i 1 posto penicilina/streptomicina, sve iz Gibco-Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), pod normo (20 procenata O2 i 5 procenata CO2 na 37 stepeni) ili hipoksičnim (1 procenat O2 i 5 procenata CO2 na 37 stepeni u inkubatorima CellXpert C170i i Galaxy 48R CO2, iz Eppendorfa, Milano, Italija).

f-hAFS-CM i p-hAFS-CM su sakupljeni i centrifugirani na 4 stepena na 300x g tokom 10 minuta i 2000×g tokom 20 minuta da bi se uklonili ćelijski ostaci; hAFS-CM je koncentriran korištenjem ultrafiltracijskih membrana sa 3kDa selektivnim graničnikom (Amicon Ultra-15, Merck Millipore Darmstadt, Njemačka) na 4 stepena na 3000× g tokom 90 minuta, a zatim dalje koncentriran na 4 stepen na 3000× g tokom 30 min. hAFS-EV su odvojeni i koncentrirani serijskim ultracentrifugiranjem iz hAFS-CM. Ukratko, hAFS-CM je sakupljen i centrifugiran na 4 stepena na 300× g tokom 10 minuta i 2000× g tokom 20 minuta da bi se uklonili ćelijski ostaci. Supernatant je zatim obrađen na 10,000 × g tokom 40 minuta. Pelet je odbačen, a supernatant je dalje obrađen ultracentrifugiranjem u Optima L-90K (Beckmann Coulter, Milano, Italija) na 10,000×g tokom 120 minuta koristeći Beckman Coulter-ove rotore centrifuge SW55Ti s okretnom kantom. Pelet koji sadrži heterogene hAFS-EVs je ispran u PBS-u uz finalno centrifugiranje na 100,000×g tokom 120 minuta, a zatim resuspendiran u PBS filtriran sa membranom za filter pora od 0,22 um. Koncentracije proteina u hAFS-CM i na površini hAFS-EV mjerene su korištenjem BiCinchoninic Acid (BCA) testa (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija). Uzorci su uzeti na Gen5 Microplate Reader na 570 nm da bi se procijenio prinos hAFS-CM i hAFS-EV u smislu ug rastvora/10 stepeni ćelija koje proizvode.

4.6. Karakterizacija hAFS-EV-a transmisijskom elektronskom mikroskopijom i analizom praćenja nanočestica

Analiza transmisijskom elektronskom mikroskopom (TEM) izvršena je na Hitachi TEM mikroskopu (serija HT7800, Hitachi High Technologies, Monza, Italija). Digitalne slike su snimljene kamerom Mega view 3 i softverom Radius (EMSIS, Muenster, Njemačka). f-hAFS i p-hAFS su fiksirani u 3,7 posto otopini paraformaldehida (PA) razrijeđenog 1:1 sa hAFS kompletnim medijumom, isprani u 0.1 M kakodilatnom puferu, a zatim odmah inkubirani 1 h na sobnoj temperaturi u 0,1 M kakodilatni pufer koji sadrži 2,5 posto glutaraldehida (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, SAD). Pelete ćelija su naknadno fiksirane u osmijum tetroksidu 1 h i u 1% rastvoru uranil acetata 1 h. Uzorci su dehidrirani 24 h na 42 stepena i 48 h na 60 stepeni kroz seriju etanola i ugrađeni u epoksidnu smolu (Poly-Bed; Polysciences Europe GmbH, Minneapolis, Nemačka). Ultratanki rezovi (50 nm) su isečeni Leica Ultracut mikrotomom (Leica Microsystems, Milano, Italija) i obojeni sa 5% uranil acetata u 50% rastvoru etanola. f-hAFS-EV i p-hAFS-EV su resuspendovani u 20 uL rastvora PBS i fiksirani dodavanjem jednake zapremine 2 procenta paraformaldehida u 0,1 M rastvoru fosfatnog pufera (pH7,4). EV-ovi su zatim adsorbirani 10 minuta na bakrene rešetke obložene formvar-ugljikom plutajući rešetke na kapi od 5 μL na parafilmu. Nakon toga, rešetke s prianjajućim EV su isprane u PBS-u i negativno obojene 2 posto otopinom uranil acetata 5 minuta na sobnoj temperaturi. Obojene rešetke su ugrađene u 2,5 posto metilceluloze radi boljeg očuvanja i osušene na zraku prije ispitivanja. Morfometrijska analiza hAFS-EV mjerena je na 10 nasumično snimljenih mikrofotografija pri 40.000× g uvećanju. Veličina je izračunata upotrebom proizvoljne funkcije linije ugrađene u dijaloški okvir za mjerenje Radius softvera (EMSIS, Muenster Njemačka). Da bi se vizualizirala distribucija veličine hAFS-EV, rezultati su prikazani kao dijagram raspršenih tačaka i kao distribucija frekvencije u kojoj je svaka veličina predstavljena kao tačka zajedno sa linijama za vrijednost medijane i raspon.

f-hAFS-EV i p-hAFS-EV takođe su analizirani pomoću Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) kako bi se procijenile čestice koje oslobađaju ćelije od 10 stepeni. hAFS-EV su razrijeđeni 1:100 u PBS otopini i nabavljeni na NanoSight LM10 (Malvern Instruments, Malvern, UK) koji je snimio najmanje 3 različita kadra od po 60 s. Tri različite akvizicije svakog uzorka su analizirane korištenjem opcije Batch Process u softveru. 4.7.LC-MS/MS analiza hAFS-CM i hAFS-EVs 4.7.1. Digestija u otopini

Proteomska analiza je izvršena na 3 biološke replike hAFS-CM i hAFS. EV iz f-hAFS i p-hAFS nakon normoksičkog ili hipoksičnog predkondicioniranja (n=24 različitih stanja). hAFS-CM i hAFS-EV uzorci su suspendirani u 0.1M NHCO3 pH 7,9 i tretirani RapigestIM SF reagens (Waters Co, Milford, MA, USA) u konačnoj koncentraciji od 0.25 posto (w/v). Dobijene suspenzije su inkubirane uz miješanje na 100 stepenu 2{{40}} min. Digestija je obavljena na svakom uzorku dodavanjem modificiranog tripsina (Promega Inc, Madison, WI, SAD) u omjeru enzim/supstrat od 1:50 (w/w) preko noći na 37 stepeni u 0,1 M NH4HCO3 pH7,9 pufer sa 10 posto CHSCN. Dodatni alikvot tripsina (1:100 w/w) je dodat ujutru, a digestija je nastavljena 4 sata. Štaviše, dodavanje 0,5 posto trifluorosirćetne kiseline (TFA) Gigma-Aldrich Inc., St Louis, MO, SAD) zaustavilo je enzimsku reakciju, a naknadnom inkubacijom na 37 stepeni tokom 45 minuta završena je RapiGest kisela hidroliza[108]. Produkti razgradnje koji se ne miješaju s vodom uklonjeni su centrifugiranjem na 13.000 o/min tokom 10 min. Konačno, mješavine triptičnog digestora su desaljene korištenjem PierceTM C-18 spin kolona (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija), prema protokolu proizvođača, i resuspendirane su u 0,1 posto mravlje kiseline (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, SAD) u vodi (LC-MS Ultra CHROMASOLVTM, Honeywell Riedel-de HaenTM, Muskegon, MI, SAD) u koncentraciji od 0,1 ug/μL.

4.7.2.Tečna hromatografija

Tripsinom digestirane mješavine analizirane su pomoću platforme koja se sastoji od nano-tečnog hromatografskog sistema, Eksigent nanoLC-Ultra[2]2D sistema (Eksigent, dio AB SCIEX Dublin, Dublin, Kalifornija, SAD) konfiguriran u trap-elute modu, zajedno sa masenim spektrometrom visoke rezolucije. Ukratko, uzorci (0.8 ug ubrizgani) su prvo učitani na peptidnu zamku (200 um × 500 um ChromXP C18- CL,3 um,120 A) i ispran sa pumpom za punjenje koja radi u izokratskom režimu sa 0,1 posto mravlje kiseline u vodi tokom 10 minuta pri protoku od 3 μL/min. Automatsko prebacivanje ventila s deset priključaka je zatim eluiralo zarobljenu smjesu na koloni nano reverzne faze (75 um × 15 cm ChromXP C18-CL,3 um,120 A) kroz 150-minutni gradijent eluenta B (eluent A, 0,1 posto mravlje kiseline u vodi; eluent B, 0,1 posto mravlje kiseline u acetonitrilu) pri brzini protoka od 300 nL/min. Dubinski, gradijent je bio: od 5-10 posto Bin 3min,10-40 posto Bin 130min,40-95 posto Bin 10 min i zadržavanje na 95 posto B za 7 minuta. 4.7.3. Masena spektrometrija

MS/MS analize su izvedene na LTQ-OrbitrapXL masenom spektrometru (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija) opremljenom izvorom jona nanospreja. Napon kapilare raspršivanja je postavljen na 1,7 kV, a temperatura kapilare prijenosa jona održavana je na 220 stepena. Puni MS spektri su snimljeni u opsegu 400-1600 m/z u modu pozitivnih jona, sa snagom razlučivanja od 60000 (puna širina na pola maksimuma) i brzinom skeniranja od 2 spektra/s. Nakon ovog koraka slijedilo je pet MS/MS događaja niske rezolucije koji su uzastopno generirani na način ovisan o podacima o prvih pet jona odabranih iz punog MS spektra (pri 35 posto energije sudara), koristeći dinamičko isključenje od 0,5 min za MS/MS analiza. Funkcije skeniranja masenog spektrometra i gradijenti rastvarača tečne hromatografije visokih performansi kontrolisani su Xcalibur sistemom podataka verzije 1.4 (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija).

4.7.4.Proteomska obrada podataka i rudarenje podataka

Svi generirani podaci pretraženi su pomoću tražilice Sequest HT koja se nalazi u softveru Thermo Scientific Proteome Discoverer, verzija 2.1. Eksperimentalni MS/MS spektri su u korelaciji sa sekvencama triptičnih peptida u poređenju sa teoretskim spektrom mase dobijenim in silico digestijom baze podataka Uniprot Homo Sapiens proteoma (74600 unosa), preuzete 2. januara 020 (www.uniprot.org, pristupljeno 10 2. marta021). Za identifikaciju peptidnih sekvenci i srodnih proteina korišteni su sljedeći kriteriji: tripsin kao enzim, tri propuštena cijepanja po peptidu, tolerancije mase od ±50 ppm za jone prekursora i ±0,8 Da za jone fragmenata. Čvor perkolatora je korišćen sa strategijom cilja-mamca da bi se dala konačna stopa lažnog otkrivanja (FDR) na nivou podudaranja peptidnog spektra (PSM) od 0,01 (strogo) na osnovu q-vrednosti, uzimajući u obzir maksimalnu deltaCN od 0,05 [109]. Razmatrani su samo peptidi sa minimalnom dužinom peptida od šest aminokiselina i rangom 1. Primijenjeno je grupiranje proteina i strogi principi štedljivosti. MS podaci su deponovani u ProteomeXchange Consortium preko PRIDE [10]partner repozitorijuma (ftp://massive.ucsd.edu/MSV000087013/, pristupljeno 10. marta 2021.) 48 proteina dobijenih iz SEQUEST algoritma, normalizovano je bilo usklađeno , i usporedba bez oznaka. Za ovaj cilj korišćen je interni algoritam, naime, višedimenzionalna algoritamska mapa proteina (MAProMa), koristeći prosječna podudaranja peptidnog spektra (aPSM) [111,112] koja odgovara prosjeku svih spektra identificiranih za protein i, posljedično, , na njegovu relativnu brojnost, u svakom analiziranom stanju. Detaljno, da bi se odabrali različito eksprimirani proteini, podgrupe (i za fetalni u odnosu na perinatalni-hAFS-CM i hAFS-EVs, uzimajući u obzir i stimulaciju predkondicioniranja hipoksične ćelije) su uparene u paru primjenom praga od 0,4 i 5 na dva MAProMa indeksi DAve (Differential Average) i DCI (Differential Confidence Index), respektivno. DAve, koji procjenjuje promjene u ekspresiji proteina, definiran je kao (XY)/(X＋Y)/0,5, dok je DCI koji procjenjuje pouzdanost diferencijalne ekspresije definiran kao (X plus Y)×(XY)/2 X i Y termini predstavljaju PSM datog proteina u dva upoređena uzorka. Osim toga, prosječne liste proteina, dobijene iz svakog ispitivanog stanja, podvrgnute su linearnoj diskriminantnoj analizi (LDA), a proteini s najvećim F omjerom (većim ili jednakim 4,5) i najmanjom p-vrijednošću (manjim ili jednakim 0,001) zadržani su i obrađeni hijerarhijskim grupisanjem, primjenom Wardove metode i Euklidove metrike udaljenosti pomoću softvera JMP 15.2. Konkretno, F omjer predstavlja srednji kvadrat modela podijeljen sa srednjim kvadratom greške, dok p-vrijednost ukazuje na vjerovatnoću dobijanja F vrijednosti veće od one izračunate ako, u stvarnosti, nije bilo razlike između srednjih vrijednosti grupe stanovništva. 4.8. Citokinsko i hemokinsko profiliranje hAFS-CM i have-EV

Profiliranje citokina i hemokina hAFS-CM i have-EV dobijenih pomoću f-hAFS i p-hAFS nakon hipoksičnog predkondicioniranja procijenjeno je pomoću Proteome ProfilerTM Human XL Cytokine Array kita (R&D System, Minneapolis, MN, SAD) prema uputstva proizvođača. Korišteno je dvadeset ug uzoraka hAFS-CM i hAFS-EVs. Slike membrana su dobijene pomoću Chemidoc Mini HD9 Auto (Uvitec Cambridge, UK) Specifični sadržaj citokina/kemokina procijenjen je kvantifikacijom intenziteta pozitivnog piksela (pomoću proizvoljne jedinice) za svaki detektibilni citokin korištenjem softvera ImageJ (dostupnog na https: //imagej.nih.gov/ij/, pristupljeno 10. marta 2021. [13]). 4.9. Ekstrakcija RNK iz hAFS-EV i Next

Generation Sequencing

RNK je izolovana iz f-hAFS-EV i p-have-EV pomoću miRNeasy Micro Kit (Qiagen, Milano, Italija) prema uputama proizvođača. Integritet RNK i distribucija veličine procijenjeni su korištenjem Agilent Small RNA Kita s malim nekodirajućim RNA čipom kako bi se procijenio sadržaj malih RNK ​​u rasponu od 6 do 150 nukleotida (nt). Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Monza, Italija) korišten je za kvantificiranje sadržaja mikroRNA (miRNA), slijedeći uputstva proizvođača. Biblioteke sekvencioniranja miRNA su pripremljene i amplificirane korištenjem QIAseq miRNA Library kita (Qiagen, Milano, Italija) koristeći 18,5 ng izolovanih miRNA kao ulaz i slijedeći uputstva proizvođača. Biblioteke su objedinjene nakon provjere kvaliteta i kvantifikacije od strane TapeStation (Agilent Technologies, Foster City, Kalifornija, SAD) pomoću Agilent High Sensitivity D1000 ScreenTape. Objedinjene biblioteke procijenjene su za kontrolu kvaliteta pomoću qPCR-a u realnom vremenu prema Vodiču "Kvantifikacija qPCR-a za sekvenciranje" (Illumina Inc, San Diego, CA, SAD) i sekvencionirane su pomoću Illumina NextSeq platforme koristeći High Output Hit v2.5 (75 ciklusa) ( Illumina Inc, San Diego, CA, SAD). Pozivanje baze je izvršeno sa podrazumevanim tokom rada Illumina NextSeq500.

4.10. Bioinformatička analiza podataka sekvenciranja miRNA

Fastq fajlovi su prvo obrađeni odsecanjem 3' adaptera i nekvalitetnih baza pomoću Cutadapt-a [114]. Nakon obrezivanja identifikovane su sekvence umetanja i UMI sekvence. Čitanja bez sekvence adaptera, čitanja sa sekvencama umetanja manje od 16 bp i Čitanja sa manje od 10 bp UMI sekvenci su odbačena. Da bi se označile sekvence umetanja, očitavanja su usklađena sa sklopom humanog genoma GRCh38 pomoću Bowtie-a [15] Za svaki uzorak su izbrojana sva očitanja dodijeljena određenoj miRNA, a pridruženi UMI su agregirani kako bi se izbrojali jedinstveni molekuli. Sekundarna analiza je izvršena prilagođenim R skriptama dostupnim na razuman zahtjev. Analiza diferencijalnog obogaćivanja izvedena je korištenjem Limma [116] i EdgeR Bioconductor paketa [117].

4.11. Statističke analize

Rezultati su predstavljeni kao srednja vrijednost ±sem od najmanje tri (n{{0}}) nezavisna eksperimenta. Poređenja su napravljena jednosmjernom ANOVA-om praćenom posthoc Tukeyjevim testom višestrukih poređenja ili Studentovim t-testom. Analize su obavljene korišćenjem Graph-Pad Prism verzije 8.0.2 (GraphPad Software, https://www.graphpad.com, pristupljeno 10. marta 2021.) sa statističkom značajnošću postavljenom na* p<0.05. for="" proteomics="" analysis,="" the="" distribution="" of="" proteins="" in="" the="" examined="" conditions,="" functional="" enrichment="" analysis,="" and="" comparison="" of="" data="" versus="" the="" vesiclepedia="" database="" (http:/microvesicles.org,="" accessed="" on="" 10="" march="" 2021)="" were="" achieved="" using="" funrich="" (version="" 3.1.3,http://www.funrich.org,accessed="" on="" 10="" march="" 2021[54]),="" that="" uses="" hypergeometric="" test="" and="" bonferroni="" for="" statistics="" and="" allows="" the="" graphical="" visualization="" of="" data="" with="" venn="" and="" bar="" charts="" [118].="" 5.="">

U zaključku, utvrđeno je da su fetalni i perinatalni hAFS fenotipski ekvivalentni sa uporedivom sekretornom potencijom i EV obogaćenjem po veličini i distribuciji; ipak bi se mogle uvažiti neke razlike u njihovom sekretomskom profilu. Konkretno, razvojno nezreo profil fetalnog hAFS-a može se rekapitulirati njihovim formulacijama sekretoma sa izraženijim provaskulogenim, proregenerativnim i pomlađujućim sekretomom. Međutim, perinatalni hAFS i dalje zadržava relevantan parakrini profil kroz ekspresiju faktora koji se odnose na migraciju endotelnih ćelija, imunomodulatorni, antiinflamatorni i neurotrofni potencijal sličan fetalnom hAFS-u. Ovi nalazi mogu pružiti korisne uvide koji podržavaju buduću parakrinu terapiju bolesti povezanih s ozljedama i upalnim/ishemijskim bolestima. Stoga, odabir fetalnog ili perinatalnog hAFS-a kao najidealnijeg izvora ćelija treba procijeniti s obzirom na specifičan klinički scenarij.

Ovaj članak je preuzet iz Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3713. https://doi.org/10.3390/ijms22073713 https://www.mdpi.com/journal/ijms