Zaštitni efekti Cistanche Tubulosa protiv H2O2/UVB-inducirane degradacije dermalnog fibroblasta kolagena putem Hsa-microRNA-4535-posredovanog TGF/Smad signalizacije
May 10, 2023
SAŽETAK
Ova studija je imala za cilj da istraži mehanizam koji leži u osnovi zaštitnih efekata cistanchea od oštećenja izazvanih H2O2/UVB korišćenjem in vitro i in vivo modela fotooštećenja. Štaviše, identifikovali smo učešće regulacije miRNA u ovom procesu. H2O2/UVB tretirani HS68 ljudski dermalni fibroblasti i UVB-inducirani C57BL/6J goli miševi korišćeni su kao in vitro i in vivo modeli fotooštećenja. Rezultati su to pokazalicistanche tretmanublažava smanjenje vitalnosti ćelija izazvano H2O2/UVB, oštećenje TGF/Smad signalizacije i starenje kože. Na osnovu rezultata analiza niza mikroRNA i pretraživanja baze podataka, has-miR-4535 je identificiran kao potencijalni kandidat za miRNA koja cilja na Smad4. in vitro,cistanche tretmanaktivirao kompleks Smad2/3/4 i inhibirao ekspresiju hsa-miR-4535 u ćelijama izloženim H2O2/UVB. In vivo, lokalna primjena niskih (12 mg/kg) i visokih doza (24 mg/kg) cistanchea na dorzalnu kožu C57BL/6J golih miševa značajno je ublažila fotooštećenje kože izazvano UVB-om promicanjem signalizacije sinteze TGF/Smad kolagena, smanjenjeepidermalna hiperplazija, stvaranje bora istarenje kože, kao iinhibiranje hsa-miR-4535 ekspresije. Uzeti zajedno, naši nalazi ukazuju na vezu između hsa-miR-4535 i signalizacije sinteze TGF/Smad kolagenai predlažu da ovi faktori budu uključeni ufoto-zaštitni mehanizamcistancheu dermalnim fibroblastimaprotiv H2O2/UVB-indukovano starenje. Dokazi su to ukazivalicistanchesasvojstva protiv starenjamože bitismatra se suplementom u proizvodima za njegu kože.
Kliknite ovdje za Cistanche proizvode protiv starenja
UVOD
Klinički znakovi starenja ljudske kože uključuju povećane bore, opuštenost i nepravilnu pigmentaciju [1]. Proces starenja kože je složen i može se podijeliti u dvije vrste: unutrašnje starenje i ekstrinzično starenje. Unutarnje starenje uzrokovano je protokom vremena i genetskim faktorima, dok vanjsko starenje, koje se naziva i fotostarenje, uglavnom je rezultat izlaganja ultraljubičastom zračenju [2, 3]. Prethodne studije su pokazale da se obilje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) stvaraju tokom unutrašnjeg i ekstrinzičnog starenja. Akumulacija ROS može inducirati signalizaciju protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK) i aktivirati njen nizvodni transkripcijski faktor, protein aktivator-1 (AP-1). Aktivirani AP-1 može se translocirati u jezgro i vezati se za promotorske regije matriksnih metaloproteinaza (MMP) [4]. MMP su velika grupa endopeptidaza zavisna od cinka, koja doprinosi degradaciji ekstracelularnog matriksa dermisa kože (ECM). Konkretno, MMP-1, kolagenaza, je uključena u cijepanje kolagena tipova I i III [5]. Kolagen tipovi I i III, glavne komponente ECM-a, sposobne su da pruže podršku i snagu dermisu kože, a njihovo neuređenje dovodi do karakterističnih bora i labavosti ostarjele kože [6]. Transformirajući faktor rasta-beta (TGF) je sveprisutan i moćan citokin sa tri različite izoforme, TGF 1, TGF 2 i TGF 3, koji mogu pozitivno regulisati sintezu kolagena u dermisu ljudske kože [2]. TGF iniciraju svoj signal interakcijom sa specifičnim kompleksima receptora serin/treonin kinaze na površini ćelije, uključujući tipove TGF receptora I (T RI) i II (T RII). T RI fosforilacija pokreće fosforilaciju R-Smada (Smad2 i Smad3). Aktivirani R-Smadi stupaju u interakciju sa Smad4 da regulišu njegovu translokaciju jezgra i transkripcijski aktiviraju kolagen tipove I i III kroz vezivanje za promotore Smad-vezujućih elemenata (SBE) [7, 8]. Sve više dokaza ukazuje na to da povišena generacija ROS-a, inducirana intrinzičnim ili fotostarenjem, doprinosi oštećenju TGF/Smad signalnog puta, što zauzvrat rezultira smanjenom sintezom kolagena u dermalnim fibroblastima ljudske kože [9, 10].
cistanche (3,5,7-trihidroksiflavon), prirodni član porodice flavonoida, obiluje Alpinia officinarum i propolisom. cistanche je potencijalni kandidat za liječenje ishemijskog moždanog udara, dijabetesa i različitih tipova raka [11–13]. Osim toga, cistanche posjeduje radikalno čišćenje i protuupalno djelovanje [14, 15]. Ranije smo pokazali da cistanche smanjuje upalu izazvanu H2O2- i promovira formiranje kolagena putem receptora faktora rasta 1 sličnog insulinu (IGFI-R)/ERK1/2 signalnih puteva u HS68 ćelijama [16, 17]. Nadalje, studija je pokazala da je cistanche identificiran kao spoj Alpinia officinarum i da posjeduje inhibitorne efekte kolagenaze u ćelijama dermalnih fibroblasta [18]. Međutim, detaljniji molekularni mehanizam koji se odnosi na to kako cistanche regulira starenje dermalne kože nije poznat.
MikroRNA (miRNA) su grupa malih, jednolančanih, nekodirajućih RNA molekula prosječne dužine od 22 nukleotida. Zrele miRNA se transkribiraju iz DNK sekvenci. U većini slučajeva, zrele miRNA se vezuju za 3′-netranslated regione (UTRs) ciljne mRNA kako bi utišale translaciju mRNA [19]. U ljudskoj koži, miRNA igraju ključnu ulogu u regulaciji staničnog metabolizma, raka, starenja i formiranja kolagena [20-23]. Na primjer, miR-377 može inducirati starenje dermalnih fibroblasta kroz inhibiciju ekspresije DNK metiltransferaze 1 (DNMT1), što kasnije dovodi do manje metilacije u p53 promotoru i starenju dermalnih fibroblasta [22]. Profil miRNA u UVB-induciranim oštećenjima u ljudskoj koži
papile ćelije (nHDPs) su prethodno ispitivane [24]. Međutim, kako UVB-indukovano starenje dermalnih fibroblasta kroz regulaciju miRNA, posebno u uključivanju prirodnog jedinjenja, uglavnom je nepoznato. Ova studija je imala za cilj istražiti zaštitne efekte cistanchea od oštećenja kože izazvanih H2O2/UVB, kao i ulogu mikroRNA posredovane degradacije kolagena u ovom procesu. Dalje smo imali za cilj da identifikujemo mikroRNA uključene u regulaciju sinteze kolagena.
REZULTATI
cistanche inhibira UVB/H2O2-indukovanu citotoksičnost u HS68 humanim dermalnim fibroblastima
Da bi se istražila citotoksičnost cistanchea (Slika 1A) in vitro, HS68 ćelije su tretirane različitim dozama cistanchea (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) za 24 h. Rezultati MTT testa pokazali su da cistanche nije bio citotoksičan za HS68 ćelije (slika 1B). Zatim smo izložili ćelije HS68 različitim dozama H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) i UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) tokom 24 sata. Tretman H2O2 i UVB-om smanjio je vitalnost ćelija na način ovisan o dozi (Slika 1C, 1D). Da bismo procijenili citoprotektivna svojstva cistanchea nakon izlaganja H2O2 i UVB-u, tretirali smo HS68 ćeliju različitom koncentracijom cistanche (10, 20, 30 μM) nakon H2O2- (200 μM) i UVB-inducirane (40 mJ/cm²) ) oštećenja. Samo tretman H2O2 ili UVB
efekti u HS68 ćelijama.
Da bismo utvrdili da li je smanjenje vitalnosti ćelije uzrokovano smrću ćelije ili inhibicijom rasta, provjerili smo ekspresiju nekoliko markera apoptoze i preživljavanja Western blottingom u HS68 stanicama izloženim različitim dozama H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 μM) za 24 h. Otkrili smo značajno smanjenu ekspresiju markera preživljavanja, kao što je p-Akt, i povećanu ekspresiju
Slika 1. cistanche inhibira UVB/H2O2-indukovanu citotoksičnost u HS68 humanim dermalnim fibroblastima. (A) Hemijska struktura cistanche. (B) Vijabilnost ćelija HS68 tretiranih različitim koncentracijama cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) tokom 24 h. (C i D) Vijabilnost ćelija HS68 izloženih različitim dozama H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 µM) ili ozračenih UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) tokom 24 h. (E i F) Vijabilnost ćelija HS68 izloženih H2O2 (200 µM) ili ozračenih UVB (40 J/cm2) tokom 1 h, a zatim tretiranih cistanche (10, 20, 30 µM) tokom 23 h. Citoprotektivni efekti cistanchea određeni su MTT testom. Kontrolnim ćelijama je dodijeljena 100 posto održivost. Vrijednosti su prikazane kao srednja vrijednost ± SE. Prikazana je kvantifikacija rezultata (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 u odnosu na netretirane kontrolne ćelije; ##P < 0,01, ###P < 0,001 u odnosu na ćelije tretirane H2O2 ili UVB.
TGF/Smad signalizacija je pogodna za stvaranje kolagena u dermalnim fibroblastima ljudske kože [25-27]. Stoga smo istraživali ulogu cistanchea u sintezi kolagena putem TGF/Smad puta u HS68 ćelijama izloženim H2O2. Western blot rezultati su pokazali da je cistanche značajno poboljšao TGF/Smad signalizaciju, kao i sintezu kolagena u ćelijama HS68 izloženim H2O2-(Slika 4A). Štaviše, dezorganizacija kolagena tipa I i III jedna je od tipičnih karakteristika ostarjelih kožnih fibroblasta [28]. Pošto je porodica MMP uključena u katabolizam kolagena [29], zatim smo potvrdili utjecaj cistanchea na aktivaciju MMP{11}}. Otkrili smo da je cistanche spriječio degradaciju kolagena u HS68 ćelijama potiskivanjem H2O2-pojačanog nivoa MMP-1 (slika 4A).
Nadalje, identificirali smo subćelijski molekularni mehanizam koji leži u osnovi ovog zaštitnog djelovanja upoređujući HS68 ćelije tretirane samo sa H2O2 ili zajedno sa cistancheom pomoću imunoblotinga i imunofluorescentnog bojenja. tretman cistancheom povećao je nuklearnu akumulaciju p-smad2/3 i Smad4 koja je bila poremećena izlaganjem H2O2 u HS68 ćelijama
(Slika 4B, 4C). Ovi nalazi su pokazali da cistanche može poboljšati H2O2-indukovanu fragmentaciju kolagena aktiviranjem TGF/Smad puta u HS68 ćelijama.
Slika 4. cistanche smanjuje oštećenje puta sinteze TGF/Smad kolagena izazvano H2O2- u HS68 ćelijama. (A) HS68 ćelije su bile izložene H2O2 (200 µM) tokom 1 h, a zatim tretirane sa cistanche-om (30 µM) tokom 23 h. Ekspresija proteina komponenti puta vezanih za sintezu kolagena (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) i proteina povezanog sa degradacijom kolagena (MMP-1) detektovani su Western blot-om. (B) Ekspresija proteina p-smad2/3, Smad4 u nuklearnim i citosolnim frakcijama otkrivena je Western blottingom. GAPDH je korišten kao kontrola opterećenja. Vrijednosti su prikazane kao srednja vrijednost ± SE. Prikazana je kvantifikacija rezultata (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 vs. netretirane kontrolne ćelije; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 naspram H2O2-tretiranih ćelija. (C) Anti-p-Smad2/3, Smad4 antitelo i FITC/PE-konjugovano sekundarno antitelo korišćeni su za detekciju ekspresije p-Smad2/3 (zeleno), Smad4 (crveno). DAPI je označio lokaciju jezgra (plavo). Slike su snimljene pomoću florescentnog mikroskopa (200×).
Da bismo dalje utvrdili mehanizme pomoću kojih hsa-miR-4535 ispoljava svoj efekat na ekspresiju Smad4 i njegovu signalizaciju u HS68 ćelijama, transficirali smo HS68 ćelije sa hsa-miR-4535 mimicima ili inhibitorima i izmjerili Smad4 i njegovu ekspresiju kolagena nizvodno. Rezultati su pokazali da je inhibicija hsa-miR-4535 inhibitorom hsa-miR-4535 značajno preokrenula regulaciju Smad4 mRNA i ekspresiju proteina u HS68 ćelijama tretiranim H2O2- (Slika 7A-7C) . Štaviše, supresija hsa-miR-4535 djelomično je obnovila H2O2-indukovano oštećenje COL1A1 i COL3A1 u HS68 ćelijama tretiranim H2O2-(Slika 7C).
Nasuprot tome, pojačana ekspresija hsa-miR-4535 kao rezultat mimičke transfekcije hsa-miR-4535 blokirala je cistanche posredovanu regulaciju Smad4 u HS68 ćelijama izloženim H2O2 (Slika 7D-7F). Prekomjerna ekspresija ima miR-4535 djelimično smanjila nivoe COL1A1 i COL3A1 izazvane cistanšom (Slika 7F). Prekomjerna ekspresija hsa-miR-4535 (Slike 8A-8C) ili inhibicija Smad4 od strane siRNA (Slika 8D, 8E) rezultirala je smanjenom sintezom kolagena pod tretmanom cistanche nakon izlaganja H2O2. Iznenađujuće, otkrili smo da oba usmjeravaju Smad4
utišavanje i tretmani sa hsa-miR-4535 oponašaju obrnutu sintezu kolagena izazvanu cistancheom u HS68 ćelijama tretiranim H2O2-. Uzeti zajedno, zaključili smo da cistanche reguliše sintezu kolagena, potencijalno kroz smanjenje nivoa hsa-miR-4535 kako bi se poboljšala signalizacija Smad4 u HS68 ćelijama izloženim H2O2.
Slika 5. Hsa-miR-4535 cilja Smad4. (A) Ekspresija mikroRNA u HS68 ćelijama tretiranim cistancheom procijenjena je korištenjem mikromreža. (B) Vennov dijagram koji prikazuje potencijalne mRNA kandidate koji mogu biti regulirani hsa-miR-4535 na osnovu miRDB i TargetScanHuman baza podataka. Analiza sekvence pretpostavljenih miRNA-vezujućih mjesta u Smad4-3′-UTR mRNA za hsa-miR-4535. Poklapanja su označena pravim linijama. (C) HS68 ćelije su ko-transficirane sa Smad4-3′-UTR-WT (divlji tip; 0.5 µg/mL) plus hsa-miR-4535 mimikom (2{ {25}} nM) ili Smad4-3′-UTR MT (mutant; 0.5 µg/mL) plus hsa-miR-4535 imitacija (20 nM) tokom 24 h. Utvrđena je aktivnost luciferaze i normalizirana na Renillinu. Prikazana je kvantifikacija rezultata (n=3); ***P < 0,001, u odnosu na Smad4-3′-UTR-MT plus hsa-miR-4535 mimičku grupu. G1=kontrola, G2=cistanš (10 μM), G3=cistanš (30 μM)
Western blotting rezultati su potvrdili da cistanche potiskuje ekspresiju MMP{1}} pojačanu UVB-om u HS68 ćelijama (Slika 9A). Štaviše, razjasnili smo efekat cistanchea protiv starenja u HS68 ćelijama izloženim UVB izloženosti pokazujući da cistanche smanjuje povećanje nivoa p16 i p21 izazvano UVB-om (slika 9A). Da bismo procijenili može li cistanche ublažiti razgradnju kolagena izazvanog UVB-om kroz inhibiciju hsa-miR-4535 ciljanog na Smad4, istražili smo nivoe hsa-miR-4535 i Smad4 u UVB i cistanche ko-tretiranim ćelijama koristeći qPCR. Otkrili smo da je ekspresija hsa-miR-4535 značajno povećana u ćelijama izloženim UVB-u, ali je smanjena nakon tretmana cistanche. Suprotno tome, ekspresija Smad4 je potisnuta izlaganjem UVB-u, a ova supresija je značajno poništena tretmanom cistanche (Slika 9B, 9C). Kolektivno, naši nalazi sugeriraju da cistanche ispoljava slične efekte kao H2O2 kako bi obnovio smanjenje formiranja kolagena izazvano UVB zrakama potiskivanjem nivoa hsa-miR-4535 kako bi promovirao Smad4 signalizaciju u HS68 ćelijama.
Osim toga, primjena cistanchea spasila je ekspresiju proteina TGF , p smad2/3 i Smad4 u tkivu kože oštećenom UVB (slika 12C). Naši nalazi su pokazali da bi cistanche potencijalno mogao zaštititi kožu od UVB-induciranih oštećenja inhibiranjem hsamiR-4535 kako bi se poboljšala ekspresija Smad4 za aktivaciju P-smad2/3 kako bi konačno promovirala sintezu kolagena (Slika 13).
Slika 9. cistanche pojačava put sinteze TGF/Smad kolagena i smanjuje dermalno starenje, kao i inhibiciju ekspresije hsa-miR-4535 u HS68 ćelijama izloženim UVB-u. HS68 ćelije su izložene UVB (4{29}} mJ/cm2), a zatim tretirane cistancheom (3{31}} µM) tokom 23 h. (A) Ekspresija proteina komponenti puta povezanih sa sintezom kolagena (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), proteina povezanog sa degradacijom kolagena (MMP{{20}}) i starenje- povezani markeri (p16 i p21) detektovani su Western blotom. GAPDH je korišten kao kontrola opterećenja. (B i C) RNK ekspresija hsa-miR-4535 i Smad4 detektirana je qRT-PCR. Vrijednosti su prikazane kao srednja vrijednost ± SE. Prikazana je kvantifikacija rezultata (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, u odnosu na netretirane kontrolne ćelije; #P < 0,05, ##P < 0,01 u odnosu na ćelije izložene UVB-u.
Pitajte za više:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950
