Progresija utvrđene nedijabetične hronične bubrežne bolesti zaustavljena je liječenjem metforminom kod pacova

Trenutne strategije liječenjazahronična bolest bubrega (CKD)uglavnom se fokusiraju nakontrolisanje faktora rizika. Metformin, lijek prve linije za dijabetes tipa 2, ispoljava blagotvorno pleiotropno djelovanje mimo njegove propisane upotrebe, a početni podaci su otkrili zaštitne efekte protiv razvoja oštećenja bubrega. Ova studija procijenila je terapijsku efikasnost metformina i kanagliflozina, inhibitora kotransportera natrijum-glukoze-2 (SGLT2) koji je nedavno odobrila Američka uprava za hranu i lijekove za liječenje dijabetičke nefropatije, u usporavanju progresije utvrđene nedijabetičke CKD . Štakori sa adeninom izazvanom CKD-om su raspoređeni u različite grupe za liječenje da primaju ili 200 mg/kg metformina, četiri ili pet sedmica nakon početka adeninske dijete (utvrđena blaga-umjerena kronična bolest bubrega), ili 25 mg/kg kanagliflozina četiri sedmice nakon početak dijete, dnevnim oralnim davanjem tokom četiri sedmice. Svaka tretirana grupa je upoređena sa grupom nosača. Hronična doza adenina rezultirala je teškom CKD kod pacova koji su tretirani vehikulumom, na šta ukazuje značajan porast nivoa kreatinina u serumu, značajno smanjenje klirensa kreatinina i poremećeni metabolizam minerala. Metformin, ali ne i kanagliflozin, zaustavio je opadanje funkcije bubrega. Dodatno, bubrezi životinja tretiranih metforminom pokazali su manje intersticijske površine i upale u poređenju sa grupom koja je primala vehikulum. Proteomske analize su otkrile da je zaštitni efekat metformina na bubrege povezan s aktiviranjem signalnog puta nilskog konja. Ova visoko očuvana kaskada multiprotein kinaze kontrolira razvoj tkiva, veličinu organa, proliferaciju stanica i apoptozu. Stoga je metformin pokazao terapijsku efikasnost zaustavljanjem progresije utvrđene CKD u modelu štakora. Kidney International (2022) 101, 929–944; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2022.01.037

KLJUČNE RIJEČI:canagliflozin; hronična bolest bubrega; Signalni put nilskog konja; funkciju bubrega;metformin; proteomika

NOVA BILJNA FORMULACIJA ZAHRONIČNA BOLEST BUBREGA (CKD)

Translational Statement

Strategije liječenja zahronična bolest bubrega (CKD)idealno bi trebalo (i) direktno ciljati bubreg i (ii) biti u stanju zaustaviti dalje napredovanje već uspostavljene CKD. Nedavne studije o antidijabetičkim lijekovima, kao što su metformin i kanagliflozin, ukazuju na navodni povoljan učinak na smanjenje funkcije bubrega. Ovaj rad izvještava o rezultatima studije na štakorima koja je ispitivala terapijsku efikasnost metformina i kanagliflozina u okruženju već ustanovljene, nedijabetičke CKD. Naši podaci pokazuju da metformin ima renoprotektivni potencijal i da ima perspektivu da se koristi kao terapeutsko sredstvo za usporavanje ili čak zaustavljanje progresije CKD.

Hronična bolest bubrega(CKD) karakterišesmanjena funkcija bubregatraje duže od 3 mjeseca. Trenutno je prepoznat kao javnozdravstveni problem širom svijeta sa procijenjenom globalnom prevalencijom od 3% do 16%.1–3 Vodeći uzroci CKD u razvijenim zemljama su dijabetes i hipertenzija.1 Osim toga, CKD također doprinosi globalnom teretu kardiovaskularnih bolesti. bolesti.1,4 Oštećenje bubrega može dalje napredovati do zatajenja bubrega, što neizbježno zahtijeva dijalizu ili transplantaciju bubrega, i posljedično značajno smanjuje kvalitetu života.5 Trenutne strategije liječenja CKD uglavnom se fokusiraju na kontrolu faktora rizika i ublažavanje simptoma.

Metformin, bigvanidni lijek, je oralni antidijabetički lijek prve linije koji koristi 200 miliona pacijenata koji boluju od dijabetes melitusa tipa 2.6,7 Iako se metformin koristi već 6 decenija, molekularni putevi kojima metformin snižava glukozu u krvi su još uvijek nije u potpunosti razjašnjeno.8,9 Podaci iz različitih istraživačkih grupa su međutim pokazali da metformin ispoljava mnoge benigne pleiotropne efekte izvan početne propisane upotrebe. Neovisno o dijabetičkom statusu pacijenta, primjena metformina pokazala se obećavajućom za liječenje kardiovaskularnih bolesti10 i sindroma policističnih jajnika11 i pokazala je značajnu efikasnost kod različitih tipova raka (prostate12 i dojke13).

Osim toga, nedavni podaci iz pretkliničkih studija na različitim modelima bolesti bubrega također su ukazali na pretpostavljeni zaštitni učinak metformina na bubrege.14–19 U prethodnoj eksperimentalnoj studiji, pokazali smo da je preventivno liječenje metforminom bilo u stanju snažno umanjiti razvoj teška CKD.14 U ovom scenariju smo otkrili da je metformin sačuvao funkciju bubrega, smanjio upalu bubrega i spriječio prekomjernu fibrozu.14 Nažalost, većini pacijenata s CKD se dijagnosticira kada je GFR već smanjen (GFR kategorija G2–G3a ili čak G3b–G4) , stoga je liječenje već ustanovljene CKD klinički relevantnija paradigma za proučavanje. Međutim, potencijalno objašnjenje kliničke upotrebe metformina tokom CKD-a otežano je istorijskim strahom od razvoja laktacidoze.20,21 Revidirane smjernice ipak navode da se metformin sada može koristiti kod pacijenata sa blagom do umjerenom bubrežnom insuficijencijom.22 Nadalje , nedavna klinička studija Lalaua et al.23 pokazala je da se liječenje metforminom također čini sigurnim i još uvijek farmakološki efikasnim kod umjerene do teške CKD (GFR kategorija G3a–b do G4), pod uvjetom da je doza prilagođena stepenu bubrega neuspjeh.

Pokazalo se da inhibitori kotransportera natrijum-glukoze-2 (SGLT2) smanjuju rizik od oštećenja bubrega kod pacijenata sa dijabetesom i stoga su odobreni za liječenje dijabetičke nefropatije.24 SGLT2 inhibitori su nova klasa oralnih antidijabetičkih lijekova koji ciljaju bubrežnu tubularnu reapsorpciju glukoze.25,26 Nadalje, u nedavnom randomiziranom kontroliranom ispitivanju (dapagliflozin i prevencija štetnih ishoda kod hronične bolesti bubrega [DAPA-CKD]) pokazalo se da inhibitor SGLT2, dapagliflozin, usporava napredovanje CKD nezavisno od prisustva dijabetesa tipa 2.27

Iz tog razloga, Američka uprava za hranu i lijekove je nedavno odobrila upotrebu dapagliflozina za pacijente sa kroničnom bubregom bez obzira na status dijabetesa.28,29 Da bi se razjasnili ovi podaci o intervencijama za ustanovljenu CKD, naša sadašnja studija imala je za cilj procijeniti terapijsku efikasnost metformin i kanagliflozin na progresiju utvrđene CKD u modelu nedijabetičkih pacova sa adeninom indukovanom CKD.

METODE

Priprema lijeka

Metformin (Merck KGaA) i kanagliflozin (Janssen) otopljeni su u 1% karboksimetilcelulozi u koncentraciji od 20 odnosno 2,5 mg/ml prije dnevne oralne sonde. Korišćena je zapremina doze od 10 ml/kg.

Dizajn studije Devedeset četiri (94) mužjaka pacova Wistar (Iffa, Credo) su smještena po 2 po kavezu, izložena ciklusu svjetlo-mrak od 12-12 sata, sa ad libitum pristupom vodi i njihovoj ishrani. CKD je izazvan primjenom ishrane obogaćene adeninom (sa niskim sadržajem vitamina K, 0.25% adenina, 0.2 mg/kg K, 1% Ca, 1% P, 1 IU /g vitamina D i 6% proteina SSNIFF Spezialdiäten), kao što je opisano na drugom mestu,30 tokom čitavog perioda istraživanja od 8 i 9 nedelja;

Štakori sa CKD su nasumično raspoređeni u 6 različitih grupa kako bi primili 4-sedmični tretman od 200 mg/kg metformina, 25 mg/kg kanagliflozina ili vehikuluma (1% karboksimetilceluloze) koji je počeo 4 ili 5 sedmica u režimu CKD izazvane adeninom. Uključene su 4- i 5-nedeljne početne tačke lečenja kako bi se procenilo da li je terapijska efikasnost zavisila od početne težine CKD. Za procjenu histologije i funkcije bubrega na ovim polaznim tačkama, 2 dodatne grupe su primile dijetu od 0,25% adenina tokom 4 i 5 sedmica, nakon čega su žrtvovane. Kao referenca za studiju, uključena je i grupa kontrolnih pacova sa normalnom funkcijom bubrega (Slika 1). Životinje su bile smještene u metaboličke kaveze 24 sata radi prikupljanja uzoraka urina nakon čega je uzeto krv kroz repnu venu u suzdržanom, svjesnom stanju. Smjernice preporučuju smanjenje doze metformina kod pacijenata saporemećena funkcija bubregakako bi se izbjegla laktacidoza.23,31,32 Stoga je prilagođavanje doze zasnovano na procjeni serumskih nivoa laktata i pH kao indikatora laktacidoze (dodatna tabela S1). U grupi koja je primala met u trajanju od min nakon 4 sedmice adenin-indukovane CKD, smanjenje doze na 150 mg/kg sprovedeno je u sedmici 7 do kraja studije. Kada je liječenje započelo nakon 5 sedmica adeninom izazvane CKD, doza metformina je smanjena na 150 mg/kg na početku 7. sedmice i dalje na 100 mg/kg na kraju 8. sedmice. Nakon 4 sedmice liječenja metforminom ili kanagliflozinom (koje su imale 8 i 9 sedmica adeninom izazvane CKD), životinje su ubijene iskrvavljenjem kroz retro-orbitalni pleksus nakon anestezije ip primjenom 80 mg/kg ketamina (Ketalar; Pfizer) i 16 mg/kg ksilazina (Rompun; Bayer) ). Eksperimentalne procedure su provedene prema Vodiču Nacionalnog instituta za zdravlje za brigu i korištenje laboratorijskih životinja 85-23 (1996) i odobren od strane Etičkog komiteta Univerziteta u Antwerpenu (broj dozvole 2017-56).

Biohemijske analize

Deparafinizovani delovi tkiva su obojeni za procenu upale (CD45, pan leukocitni marker) metodom avidin-biotin kompleksa. Nakon blokiranja kozjim serumom i inkubacije preko noći s primarnim antitijelom zečjeg poliklonskog anti-CD45 (1:1000, ab10558, Abcam), naknadna inkubacija sa biotiniliranim kozjim anti-zečjim IgG antitijelom (PK-

4001, Vector Laboratories), praćen kompleksom avidin-biotin peroksidaze (AB-kompleks, Vector Laboratories) omogućio je vizualnu detekciju tamno smeđe boje pri dodavanju diaminobenzidina. Pozitivnost CD45 (procenat površine) je kvantifikovana na slijepi način (originalno uvećanje 100) korištenjem softvera za analizu slike Axiovision (Carl Zeiss).

Kvantitativna polimerazna lančana reakcija u realnom vremenu Ukupna mRNA brzo zamrznutog odjeljka bubrega ekstrahirana je korištenjem PureLink RNA Mini Kita (Invitrogen) i reverzno transkribovana u cDNK pomoću arhivskog kita cDNK visokog kapaciteta (Applied Biosystems). Kvantitativna polimerazna lančana reakcija u realnom vremenu izvedena je pomoću QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific). TaqMan sonda i prajmeri kupljeni su od Thermo Fisher Scientific (Dopunske metode). Nivo ekspresije svakog testiranog gena je analiziran u tri primjerka za svaki uzorak i normaliziran na ekspresiju referentnog gena za domaćinstvo Gapdh. Proteomske analize Lijevi bubreg pacova s ​​CKD koji su tretirani metforminom ili vehikulumom nakon 5 sedmica adeninske dijete je sakupljen i pripremljen za masenu spektrometriju i kvantitativnu proteomiku kako je opisano u Dodatnim metodama. Bioinformatičke analize Značajno izmijenjeni proteini dobivenih skupova podataka funkcionalno su označeni korištenjem Kjoto Enciklopedije gena i genoma (KEGG) i WikiPathways analize puta korištenjem Enrichr paketa (https://maayanlab.cloud/Enrichr/).33,34 Da bi se osiguralo. korištena je funkcionalna interpretacija ovih proteina, Baza podataka za anotaciju, vizualizaciju i integrirano otkrivanje (DAVID Bio informatic Recourses 6.8: https://david.ncifcrf.gov/). Detalji o daljim bioinformatičkim analizama navedeni su u Dodatnim metodama. Statistika Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost SEM. Neparametarske statističke analize su izvedene pomoću Prism (GraphPad Software). P < 0.05 se smatra statistički značajnim.

REZULTATI

Model CKD štakora izazvan adeninom. Detalji o tjelesnoj težini, unosu hrane i izlučenju mokraće svih studijskih grupa predstavljeni su u dodatnim slikama S1 i S2. Nivo glukoze u krvi u ovom modelu nedijabetičke CKD, u poređenju sa tretmanom vehikulom, nije promijenjen metforminom ili kanagliflozinom (Tabela 1). Metformin zaustavlja opadanje bubrežne funkcije. Hronična doza adenina je rezultirala teškom kroničnom bubrežnom bolešću kod pacova koji su tretirani vehikulom, što pokazuje porast nivoa kreatinina u serumu (Slike 2a i b). Ovo povećanje se značajno razlikovalo nakon 4 i 5 sedmica adeninom izazvane CKD, što ukazuje na 2 početne tačke liječenja s različitom ozbiljnošću CKD (P < {{10}}.0001 Dodatna slika S3). Progresivni pad funkcije bubrega je skoro potpuno zaustavljen primjenom metformina od 4. i 5. sedmice nadalje, što je indicirano stabilizacijom nivoa serumskog kreatinina u 8. i 9. sedmici (P < 0,0001 u odnosu na vehikulum), respektivno (Slika 2a i b). Klirens kreatinina, kao mjera za brzinu glomerularne filtracije, otkrio je smanjenje tokom vremena kod pacova s ​​CKD liječenim nosačem, dok je doziranje metformina ublažilo ovo smanjenje (P < 0,05 u odnosu na nosač; Slika 2c i d). Takođe, ovdje je razlika u težini CKD-a na 2 početne tačke prikazana značajno smanjenim klirensom kreatinina nakon 5 sedmica u poređenju sa 4 sedmice indukcije CKD (P <0,001; Dodatna slika S3). U skladu s bubrežnom disfunkcijom, poremećeni mineralni metabolizam postao je očigledan kod pacova s ​​CKD liječenim nosačem. Nivoi fosfora u serumu su značajno porasli od 6. i 7. sedmice nadalje, dok se kalcijum smanjivao, posebno u kasnijim vremenskim tačkama. Tretman metforminom je također poništio ove smetnje (Tabela 2).

Tabela 1|Glukoza u krvi u modelu nedijabetičnog štakora s adeninom izazvanom CKD liječenim metforminom, kanagliflozinom ili vehikulumom, 4 ili 5 sedmica nakon indukcije CKD tokom 4 sedmice

Metformin zaustavlja histološku progresiju CKD Pacovi hranjeni adeninom s CKD imali su gubitak tubularne granice četkice, zadebljanje bazalne membrane i tubularnu dilataciju, koji su svi oslabljeni tretmanom metforminom (Slika 3a). U poređenju sa kontrolnim životinjama sa normalnom funkcijom bubrega, postotak intersticijalnog područja se povećao 2- i 23- puta u 4. odnosno 5. sedmici, nakon indukcije CKD (Slike 3b i 3c). Prema ovim nalazima, ekspresija mRNA fibroznog markera Col1a1 je značajno povećana u kasnijim vremenskim tačkama (Slike 3d i e). Za razliku od tretmana nosačem, nije bilo značajnog povećanja procenta intersticijske površine između početka liječenja metforminom (4. i 5. sedmica, respektivno) i kraja studije (8. i 9. sedmica, respektivno), pružajući dokaze za sposobnost metformina da ublaži dalje povećanje intersticija i histopatološki propadanje. Ovi nalazi su pojačani mjerenjem ekspresije ključnog profibrotičkog citokina, TGFb, koja je bila značajno niža kod životinja tretiranih metforminom u poređenju sa životinjama tretiranim nosačem (Slika 3f i g).

Što se tiče upale, 4 sedmice tretmana nosačem rezultiralo je značajno povećanom ekspresijom Cd45 na kraju studije (tj. sedmica 8 i 9) u poređenju sa kontrolnim pacovima sa normalnom funkcijom bubrega (Slika 4a). Ovo povećanje ekspresije Cd45 je značajno (P < 0.0}1) zaustavljeno kada je metformin primijenjen nakon 5 sedmica adeninom izazvane CKD (Slika 4c). Slično tome, liječenje metforminom, započeto nakon 5 sedmica adenin-inducirane CKD, dovelo je do značajno niže ekspresije upalnog citokina Tnfa na kraju studije u poređenju sa životinjama koje su tretirane vehikulom u istom vremenskom trenutku (P < 0,01; slika; slika). 4d i e). Slični rezultati uočeni su sa ekspresijom Cd68, što ukazuje na supresiju infiltracije makrofaga (Slike 4f ​​i g).

Tabela 2|Serumski parametri mineralnog metabolizma u modelu nedijabetičnog štakora sa adeninom izazvanom CKD liječenim metforminom ili vehikulom, 4 ili 5 sedmica nakon indukcije CKD tokom 4 sedmice

Što se tiče upale, 4 sedmice tretmana nosačem rezultiralo je značajno povećanom ekspresijom Cd45 na kraju studije (tj. sedmica 8 i 9) u poređenju sa kontrolnim pacovima sa normalnom funkcijom bubrega (Slika 4a). Ovo povećanje ekspresije Cd45 je značajno (P < 0.0}1) zaustavljeno kada je metformin primijenjen nakon 5 sedmica adeninom izazvane CKD (Slika 4c). Slično tome, liječenje metforminom, započeto nakon 5 sedmica adenin-inducirane CKD, dovelo je do značajno niže ekspresije upalnog citokina Tnfa na kraju studije u poređenju sa životinjama koje su tretirane vehikulom u istom vremenskom trenutku (P < 0,01; slika; slika). 4d i e). Slični rezultati uočeni su sa ekspresijom Cd68, što ukazuje na supresiju infiltracije makrofaga (Slike 4f ​​i g). Rizik od laktacidoze se može kontrolirati tokom liječenja metforminom kod utvrđene CKD Iako je liječenje metforminom pokazalo sposobnost usporavanja progresije već ustanovljene CKD, mora se napomenuti da je veći mortalitet pronađen kod životinja koje su liječene metforminom (Slika 5). Ipak, u cilju suzbijanja i ublažavanja rizika od laktacidoze, odnosno povećanja nivoa laktata, izvršeno je prilagođavanje doze metformina (vidi Metode), što je rezultiralo smanjenjem vrijednosti na kraju studije (Slika 6).