Privilegovani kinolilnitroni za kombinovanu terapiju ishemijskog moždanog udara i Alchajmerove bolestiⅡ
Apr 07, 2023
3. Materijali i metode
3.1. Sinteza
Ciljani QN su pripremljeni i pročišćeni kako je prikazano u Dodatnom materijalu.
3.2. Analiza neuroprotekcije u eksperimentalnom modelu ishemije
3.2.1. Primarne neuronske kulture
Primarne neuronske kulture pripremljene su iz moždane kore kao što je prethodno opisano [16]. Moždani korteksi su dobijeni iz embriona štakora E16 Sprague-Dawley, homogenizirani i zasijani u plastične više posude prethodno premazane sa 0.05 mg/mL poli-Dlizina pri gustini od 2,5 × 105 ćelija/cm2. Ćelijske kulture su držane u atmosferi sa 6,5% CO2 na 37 ◦C, u visokoglukoznom Dulbecco-ovom mediju dopunjenom sa 15% toplotno inaktiviranim (56 ◦C, 30 min) fetalnim telećim serumom. Nakon 24 h, podloga za kulturu je zamijenjena podlogom bez seruma (Dulbecco/Ham-ov F12, 1:1 vol/vol, 5 mg/mL glukoze, 2 mM L-glutamina i 1 mM natrijum piruvata i dopunjen sa 100 µg /mL transferina, 100 µM putrescina, 20 nM progesterona, 30 nM natrijum selenita i 5 µg/mL insulina).
Click to cistanche tubulosa kapsule za Alchajmerovu bolest
U prijavljenim eksperimentima korištene su od 6- do 7- dana in vitro (DIV) neuronske kulture, koje su sadržavale 90 posto -tubulin izotip III-pozitivnih zrelih neurona, kao što je prethodno opisano [17]. Sve postupke povezane s eksperimentima na životinjama odobrio je Etički komitet bolnice Universitario Ramón y Cajal (Madrid, Španija).
3.2.2. Eksperimentalna ishemija u neuronskim kulturama i tretmanima
Da bi se izazvala eksperimentalna ishemija, primarne neuronske kulture su podvrgnute deprivaciji kiseonika i glukoze (OGD) [18]. Kulture od 6- do 7-DIV su isprane i stavljene u Dulbeccov medijum bez glukoze, koji je prethodno bio probušen sa 95% N2/5% CO2 tokom 30 minuta, i držane u vlažnoj anaerobnoj komori koja sadrži gasna mešavina 95 procenata N2/5 procenata CO2 na 37 ◦C tokom 4 h (OGD4h). Kontrolna grupa je stavljena u Dulbecco podlogu obogaćenu glukozom i držana u normoksičnom inkubatoru 4 h. Nakon 4 h inkubacije u anoksičnim (OGD4h) ili normoksičnim (kontrolnim) uslovima, ćelije kulture su brzo stavljene u normoglikemijski medij kulture bez seruma i stanje reoksigenacije, zatim su dodana jedinjenja ili vehikulum i ćelije su održavane u normoksičnim i normoglikemijskim uslovima do oporavka. za 24 h.
Eksperimentalna grupa vozila (R24h) uključivala je iste količine nosača kao i testirana jedinjenja (konačna koncentracija bez teksta 0.5 posto etanola). Nakon oporavka od 24 h, određena je vitalnost ćelija. Svakoj ispitivanoj grupi dodijeljen je nasumični redoslijed za slijepo izvođenje eksperimentalne procedure. Složeni testovi su izvedeni nezavisno četiri do osam različitih puta s različitim serijama kultura, a svaki eksperiment je izveden u četiri primjerka.
3.2.3. Test vitalnosti ćelija
Za procjenu neuroprotektivnog efekta jedinjenja protiv OGD-a, vitalnost ćelija je procijenjena kvantifikacijom živih, metabolički aktivnih ćelija, što je određeno fotometrijskom redukcijom 3-(4,5-dimetiltiazol{{3) }}il)-2,5-difenil tetrazolijum bromid (MTT) (Roche) u plavi formazan proizvod.
MTT test je izveden nakon perioda oporavka—osim za grupu OGD od 4 h, za koju je MTT dodan odmah nakon završetka OGD perioda, bez oporavka—tretiranjem ćelija sa 0.2 mg/mL MTT u medijumu kulture 1,5 h na 37 ◦C u atmosferi od 6,5 procenata CO2. Nakon inkubacije, ćelije su lizirane jednakom zapreminom rastvora za lizu (10 mM HCl, 10 posto SDS) preko noći. Smanjenje MTT-a je kvantificirano mjerenjem apsorbancije na 595 nm (690 nm kao referenca). Smanjena aktivnost MTT označava oštećenje mitohondrijalne funkcije i smatra se da ukazuje na oštećenje ćelija.
3.3. Analiza neuroprotekcije u eksperimentalnim modelima AD
3.3.1. SHSY-5Y ćelijska kultura
Ćelijska linija neuroblastoma SH-SY5Y je dobijena od Sigma-Aldrich (Madrid, Španija), održavana i kultivisana u 1:1 mešavini Eagle-ovog minimalnog esencijalnog medijuma (EMEM) i medija F12 sa dodatkom 10 procenata fetalnog goveđeg seruma (FBS). ), prema prethodno opisanim procedurama [8].
Kulture su zasijane u tikvice i održavane na 37 ◦C u vlažnoj atmosferi od 5 posto CO2 i 95 posto zraka. Za testove održivosti, SH-SY5Y ćelije su posađene u 96-ploče sa gustinom od 50,000 ćelija/bunariću prema opisanoj proceduri [8]. U ovoj studiji, sve ćelije su korištene pri malom broju prolaza (<14).
3.3.2. Neuroprotection Studies
Da bi se proučavao potencijalni neuroprotektivni efekat jedinjenja, ćelije su prethodno inkubirane sa jedinjenjima na 0.3, 1, 3 ili 10 µM tokom 24 h. Zatim su ćelije inkubirane sa 30 µM rotenona i 10 µM oligomicina-A (R/O) [19], okadaičke kiseline (20 nM) [20] ili amiloida- 25-35 (30 µM) (Sigma-Aldrich, Madrid, Španija) sa ili bez jedinjenja u različitim koncentracijama tokom 24 h. Na kraju eksperimenta, izmjerena je vitalnost ćelija korištenjem MTT metode opisane u Odjeljku 3.2.3.
3.4. Statistička analiza
Rezultati dobijeni za svaki tretman su usrednjeni i nezavisno analizirani, a informacije o tretmanu su skrivene tokom studije. Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± SE. Analiza varijanse (ANOVA) je izvršena kako bi se uporedili podaci između više koncentracija, nakon post hoc testa kada je analiza varijanse bila značajna. Nivo statističke značajnosti je postavljen na {{0}}.05 korištenjem Prism statističkog softvera 5.0 (GraphPad).
3.5. ADME analiza
ADME svojstva spoja MC903 procijenjena su pomoću QikProp modula od Schrödingera (QikProp, verzija 5.1, Schrödinger, LLC, New York, NY, SAD, januar 2017.) [21–23].
4. Zaključakusions
U ovom radu objelodanili smo preliminarne rezultate koje smo dobili u potrazi za pojedinačnim i novim lijekovima za potencijalno kombinirano liječenje ishemijskog moždanog udara i AD. Suprotno drugim prijavljenim pristupima [14,15], ovdje smo se po prvi put pozabavili racionalno vođenim dizajnom lijekova koristeći strategiju dizajna lijeka zasnovanu na fragmentima zasnovanu na suprotstavljanju odabranih farmakofora iz QN23 i Contilisanta, naših najnaprednijih spojeva olova. za ishemijski moždani udar i liječenje AD, respektivno.
Stoga, u potrazi za novim nitronima kao neuroprotektivnim antioksidansima, sposobnim ne samo da smanje nivoe ROS, već i da se vežu za biološke mete i povećaju nivo neurotransmitera – ključnog deficita koji se nalazi u mozgu pacijenata sa AD – sintetizirali smo QNs JMA101A, JMA98C , DDI89, DDI88, JMA12A, JMA11A, MC903 i MC902 (Slika 1) i podvrgnuti ih odgovarajućim fenotipskim testovima za ishemijsku ozljedu i AD. Kao rezultat toga, uspjeli smo identificirati MC903 kao hitnog agenta. Što se tiče strukture, MC903 nosi iste funkcionalne grupe na istim pozicijama kao QN23, osim N-propargil piperazina supstituiranog na drugom dušiku linearnim tri metilenskim motivom povezanim sa O(C6), umjesto metoksi grupom.
Uzimajući u obzir rezultate dobijene preliminarnim SAR-om koji je ovdje prikazan, ovaj funkcionalni i farmakoforni raspored izgleda kritičan za promatrane aktivnosti i treba ga uzeti u obzir za dalji razvoj. Dakle, MC903 je novi i mali QN za potencijalnu kombinovanu terapiju ishemijskog moždanog udara i AD, koji pokazuje snažna neuroprotektivna svojstva na primarnim neuronskim kulturama pod uslovima OGD kao eksperimentalni model ishemije, i na ćelijama neuronske linije protiv R/O, OA ili 25-35 tretmana, koji oponašaju efekte pronađene u AD.
Na osnovu ovih obećavajućih rezultata, naši napori su sada usmjereni na poboljšanje uočenog farmakološkog profila hit-MC903 dizajnom, sintezom i biološkom evaluacijom novih srodnih QN-ova, uključujući relevantne analize vezivanja enzima i receptora, tražeći olovo-QN da se podvrgnu odgovarajućim životinjskim modelima ishemijskog moždanog udara i AD. Sadašnji rezultati otvaraju put novim terapijskim uvidima i razvoju u potrazi za novim agensima za kombinirano liječenje ishemijskog moždanog udara i AD.
mehanizam Cistenche neuroprotektivni efekat
Cistanche je tradicionalna kineska biljka za koju se navodi da ima neuroprotektivno djelovanje. Mehanizmi iza ovih efekata nisu u potpunosti shvaćeni, ali postoji nekoliko mogućih mehanizama koje su predložili istraživači:
1. Antioksidativna aktivnost: Utvrđeno je da ekstrakti cistanche posjeduju snažno antioksidativno djelovanje, koje može zaštititi od oštećenja neurona uzrokovanih oksidativnim stresom.
2. Protuupalni efekti: Upala je čest uzrok neurodegenerativnih bolesti, a pokazalo se da ekstrakti cistanche imaju protuupalno djelovanje koje može umanjiti oštećenje neurona.
3. Zaštita mitohondrijalne funkcije: Mitohondrijska disfunkcija je ključni faktor koji doprinosi oštećenju neurona i smrti ćelija, a utvrđeno je da ekstrakti cistanche štite od oštećenja mitohondrija i poboljšavaju funkciju mitohondrija.
4. Aktivacija neurotrofnih faktora: Neurotrofni faktori su hemikalije koje potiču rast i preživljavanje neurona, a pokazalo se da ekstrakti cistanche povećavaju ekspresiju neurotrofnih faktora kao što su neurotrofni faktor iz mozga (BDNF) i faktor rasta nerava (NGF) .
References
1 Carney, JM; Starke-Reed, PE; Oliver, CN; Landum, RW; Cheng, MS; Wu, JF; Floyd, RA Poništavanje porasta oksidacije proteina u mozgu, smanjenja aktivnosti enzima i gubitka vremenske i prostorne memorije kroničnom primjenom spoja N-tert-butil-alfa-fenilnitrona koji hvata spin. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 1991, 88, 3633–3636. [CrossRef]
2. Maples, KR; Green, AR; Floyd, RA Nitrone-Related Therapeutics. CNS Drugs 2004, 18, 1071–1084. [CrossRef] [PubMed]
3. Zhang, Q.; Gao, T.; Luo, Y.; Chen, X.; Gao, G.; Gao, X.; Zhou, Y.; Dai, J. Prolazna fokalna cerebralna ishemija/reperfuzija izaziva rane i kronične promjene aksona kod pacova: Njegova važnost za rizik od Alchajmerove bolesti. PLOS ONE 2012, 7, e33722. [CrossRef]
4. Kim, HA; Miller, AA; Drummond, GR; Amanda, G.; Thrift, AG; Arumugam, TV; Phan, TG; Srikant, VK; Sobey, CG Vaskularna kognitivna oštećenja i Alchajmerova bolest: Uloga cerebralne hipoperfuzije i oksidativnog stresa. Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 2012, 385, 953–959. [CrossRef] [PubMed]
5. Zhen, G.; Kim, YT; Li, RC; Yocum, J.; Kapoor, N.; Langer, J.; Dobrowolski, P.; Maruyama, T.; Narumiya, S.; Doré, S. PGE2 EP1 receptor je pogoršao neurotoksičnost na mišjem modelu cerebralne ishemije i Alchajmerove bolesti. Neurobiol. Starenje 2012, 33, 2215–2219. [CrossRef]
6. Macrae, MI; Allan, SM Stroke: Prošlost, sadašnjost i budućnost. Brain Neurosci. Adv. 2018, 2, 1–5. [CrossRef]
7. Chioua, M.; Martìnez-Alonso, E.; Gonzalo-Gobernado, R.; Ayuso, MI; Escobar-Peso, A.; Infantes, L.; Hadjipavlou-Litina, D.; Montoya, JJ; Montaner, J.; Alcázar, A.; et al. Novi kinolilnitroni za terapiju moždanog udara: antioksidativni i neuroprotektivni (Z)-N-tert-butil-1-(2-kloro-6-metoksihinolin-3-il) metenamin oksid (kao novo olovo - spoj za liječenje ishemijskog moždanog udara J. Med. Chem. 2019, 62, 2184–2201. [CrossRef] [PubMed]
8. Bautista-Aguilera, OM; Hagenow, S.; Palomino-Antolìn, A.; Farré-Alìns, V.; Ismaili, L.; Joffrin, P.-L.; Jimeno, ML; Soukup, O.; Janočkova, J.; Kalinowsky, L.; et al. Višeciljno usmjereni ligandi koji kombiniraju inhibiciju holinesteraze i monoaminooksidaze sa histaminskim H3R antagonizmom za neurodegenerativne bolesti. Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 12765–12769. [CrossRef] [PubMed]
9. Bautista-Aguilera, OM; Budni, J.; Mina, F.; Medeiros, EB; Deuther-Conrad, W.; Entrena, JM; Moraleda, I.; Iriepa, I.; Lòpez Munoz, F.; Marco-Contelles, J. Contilisant, tetra ciljna mala molekula za terapiju Alchajmerove bolesti koja kombinuje holinesterazu, inhibiciju monoamin oksidaze i H3R antagonizam sa profilom agonizma S1R. J. Med. Chem. 2018, 61, 6937–6943. [CrossRef] [PubMed]
10. Bolea, I.; Juàrez-Jiménez, J.; de los Rìos, C.; Chioua, M.; Pouplana, R.; Luque, FJ; Unzeta, M.; Marco-Contelles, J.; Samadi, A. Sinteza, biološka procjena i molekularno modeliranje donepezila i n-[(5-(benziloksi)-1-metil-1h-indol-2-il)metil] - nmetilprop{10}}in{11}}amin hibridi kao novi multipotentni inhibitori holinesteraze/monoamin oksidaze za liječenje Alchajmerove bolesti. J. Med. Chem. 2011, 54, 8251–8270. [CrossRef] [PubMed]
11. Brouns, R.; De Deyn, PP Složenost neurobioloških procesa u akutnom ishemijskom moždanom udaru. Clin. Neurol. Neurosurg. 2009, 111, 483–495. [CrossRef]
12. Marco-Contelles, J. A Tau, lobi ili religija? ACS Med. Chem. Lett. 2019, 10, 1361–1362. [CrossRef] [PubMed]
13. Oset-Gasque, MJ; Marco-Contelles, J. Alchajmerova bolest, paradigma "jedna molekula, jedna meta" i pristup višeciljanog usmjerenog liganda. ACS Chem. Neurosci. 2018, 9, 401–403. [CrossRef] [PubMed]
14. Sun, P.; Zhou, W.; Yue, H.; Zhang, C.; Ou, Y.; Yang, Z.; Hu, W. Spoj AD110 djeluje kao terapijski tretman za Alchajmerovu bolest i moždani udar na modelima miševa i pacova. ACS Chem. Neurosci. 2020, 11, 929–938. [CrossRef] [PubMed]
15. Liu, Z.; Cai, W.; Lang, M.; Yan, R.; Li, Z.; Zhang, G.; Da.; Wang, Y.; Sun, Y.; Zhang, Z. Neuroprotektivni efekti i mehanizmi djelovanja multifunkcionalnih agenasa koji ciljaju slobodne radikale, monoamin oksidazu B i holinesterazu u modelu Parkinsonove bolesti. J. Mol. Neurosci. 2017, 61, 498–510. [CrossRef] [PubMed]
16. Quevedo, C.; Salinas, M.; Alcázar, A. Aktivnost faktora inicijacije 2b regulirana je proteinskom fosfatazom 1, koja se aktivira mitogenom aktiviranom protein kinazom (map) zavisnim putem u neuronskim stanicama stimuliranim faktorom rasta 1-sličnim insulinom. J. Biol. Chem. 2003, 278, 16579–16586. [CrossRef]
17. Cid, C.; Alcázar, A.; Regidor, I.; Masjuán, J.; Salinas, M.; Álvarez-Cermeño, J. Neuronska apoptoza izazvana cerebrospinalnom tečnošću kod pacijenata sa multiplom sklerozom korelira sa hipointenzivnim lezijama na t1 magnetnoj rezonanci. J. Neurol. Sci. 2002, 193, 103–109. [CrossRef]
18. Chioua, M.; Salgado-Ramos, M.; Diez-Iriepa, D.; Escobar-Peso, A.; Iriepa, I.; Hadjipavlou-Litina, D.; Martínez-Alonso, E.; Alcázar, A.; Marco-Contelles, J. Novi kinolilnitroni koji kombinuju neuroprotektivna i antioksidativna svojstva. ACS Chem. Neurosci. 2019, 10, 2703–2706. [CrossRef] [PubMed]
19. Malek, R.; Arribas, RL; Palomino-Antolín, A.; Totoson, P.; Demougeot, C.; Kobrlova, T.; Soukup, O.; Iriepa, I.; Moraleda, I.; DiezIriepa, D.; et al. Nove dualne male molekule za terapiju Alchajmerove bolesti koje kombinuju antagonizam histaminskih h 3 receptora (h3r) i blokadu kalcijumskih kanala sa dodatnom inhibicijom holinesteraze. J. Med. Chem. 2019, 26, 11416–11422. [CrossRef]
20. Buendía, I.; Egea, J.; Parada, E.; Navarro, E.; Leon, R.; Rodríguez-Franco, MI; López, MG Melatonin-N,N-dibenzil(Nmetil)amin hibrid ITH91/IQM157 pruža neuroprotekciju u in vitro Alchajmerovom modelu putem indukcije hemo-oksigenaze-1. ACS Chem. Neurosci. 2015, 18, 288–296. [CrossRef]
21. Lipinski, CA; Lombardo, F.; Dominy, BW; Feeney, PJ Eksperimentalni i računarski pristupi za procjenu rastvorljivosti i permeabilnosti u okruženju za otkrivanje i razvoj lijekova. Adv. Drug Deliv. Rev. 2001, 46, 3–26. [CrossRef]
22. Duffy, EM; Jorgensen, WL Predviđanje svojstava iz simulacija: Slobodne energije solvatacije u heksadekanu, oktanolu i vodi. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2878–2888. [CrossRef]
23. Jorgensen, WL; Duffy, EM Predviđanje rastvorljivosti lijeka iz monte karlo simulacija. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 1155–1158. [CrossRef]
