Prediktivni značaj ekspresije proteina 8 povezanog sa mijeloidom u bubrezima kod pacijenata sa gojaznošću ili tipom 2 bolesti bubrega povezanih sa dijabetesom

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Takashige Kuwabara¹, Kiyoshi Mori1,^2*, Masato Kasahara^1,3, Hideki Yokoi¹, Hirotaka Imamaki¹,Akira Ishii¹, Kenichi Koga¹, Akira Sugawara⁴, Shinji Yasuno³, Kenji Ueshima³, Takashi Morikawa⁵,Yoshio Konishi⁵, Masahito Imanishi⁵, Akira Nishiyama⁶, Kazuwa Nakao^1,2, Masashi Mukoyama¹

¹Odsjek za medicinu i kliničke nauke, Medicinski fakultet Univerziteta Kjoto, Kjoto, Japan,

²Medicinski inovacijski centar, Diplomska medicinska škola Univerziteta Kjoto, Kjoto, Japan,

³Odeljenje za istraživanje EBM, Institut za unapređenje kliničkih i translacionih nauka, Univerzitetska bolnica Kjoto, Kjoto, Japan,

⁴Odeljenje za nefrologiju, Bolnica Crvenog krsta Osaka, Osaka, Japan,

5 Odsek za nefrologiju i hipertenziju, Opšta bolnica grada Osaka, Osaka, Japan,

6 Odsjek za farmakologiju, Medicinski fakultet Univerziteta Kagawa, Kagawa, Japan

Abstract

Pozadina i cilj: Izvijestili smo da receptor sličan toll-u 4 (TLR4) i jedan od njegovih endogenih liganada, protein 8 povezan s mijeloidom (MRP8 ili S100A8), igraju važnu ulogu u napredovanju dijabetičke nefropatije kod miševa. Cilj ove studije bio je procijeniti značajbubregEkspresija MRP8 kod pacijenata sagojaznost- ili povezan sa dijabetesom tipa 2bolesti bubrega. Metode: Kod dijabetičara, gojaznih ili kontrolnih subjekata, nivoi ekspresije MRP8 mRNA i proteina u uzorcima biopsije bubrega određeni su RT-PCR u realnom vremenu i imunohistokemijom (n=28 i 65, respektivno), i njihova povezanost s bazom i analizirani su prognostički parametri. Učinci MRP8 na ekspresiju proinflamatornih gena ispitani su korištenjem makrofaga. Rezultati:BubregNivoi ekspresije gena MRP8 i proteina bili su povišeni u gojaznim ili dijabetičarskim grupama u poređenju sa kontrolnom grupom. Među svim subjektima, univarijantnom linearnom regresijskom analizom, glomerularni MRP8-pozitivan broj ćelija i tubulointersticijski MRP8-pozitivno područje na početku su bili u korelaciji ne samo s različitim poznatim faktorima rizika za dijabetičku nefropatiju (kao što su kao sistolni krvni pritisak, proteinurija i kreatinin u serumu), ali i sa stepenom glomeruloskleroze i tubulointersticijalne fibroze. Nezavisni faktori koji predviđaju nivoe proteina u urinu godinu dana kasnije ispitani su multivarijantnom analizom, a uključivali su glomerularni MRP8-pozitivan broj ćelija (b=0.59, P,0.001), proteinuriju (b=0.37, P=0.002) i sistolički krvni pritisak (b=0.21, P=0.04) na početku, nakon prilagođavanja za poznati rizik faktori. Ekspresija MRP8 proteina je uočena u CD68-pozitivnim makrofagima i atrofičnim tubulima. U uzgojenim mišjim makrofagima, ekspresije proinflamatornih citokina izazvane proteinom MRP8 također su pokrenule autoindukciju MRP8 na način ovisan o TLR4-u.

Zaključci: Čini se da je ekspresija glomerularnog MRP8 povezana s progresijom proteinurije kod gojaznih pacijenata ili pacijenata sa dijabetesom tipa 2, vjerovatno indukcijom upalnih promjena u makrofagima putem TLR4 signalizacije.

Djelovanje cistanche: liječenje bolesti bubrega

Uvod

Kronična upala igra važnu ulogu u patogenezi dijabetesa iligojaznosti njegove kardiovaskularne komplikacije [1]. Uključeno je uključivanje urođenih imunoloških receptora i endogenih liganada u proces kronične upale. Protein 8 povezan s mijeloidom (MRP8, također poznat kao S100A8 ili kalgranulin A) prvobitno je identificiran kao citoplazmatski protein koji vezuje kalcij u neutrofilima i monocitima [2] i postao je široko prepoznat kao moćan endogeni ligand za receptore 4 sličan tollu (TLR4). ) kod raznih bolesti uključujući septički šok, vaskularne i autoimune poremećaje [3,4,5]. Nedavno smo predložili da MRP8/TLR4 signalizacija igra važnu ulogu u progresiji dijabetičke nefropatije izazvanoj hiperlipidemijom [6]. Glomerularni makrofagi i ćelije sabirnih kanala glavni su izvori MRP8 u mišjim modelima dijabetičke nefropatije[6] i renalne fibroze [7], respektivno. Nivo MRP8 u plazmi, koji obično formira heterodimerni kompleks sa vezujućim partnerom MRP14 u krvotoku, povećan je kod gojaznih subjekata [8,9]. Međutim, nije bilo izvještaja o ispitivanju bubrežne ekspresije MRP8 kod pacijenata sa gojaznošću ilitip2dijabetesi njegovu povezanost sa prognozom bubrega.

Cilj ove studije bio je odrediti nivoe ekspresije mRNA i proteina MRP8 ububregjapanskih pacijenata sa dijabetičkom nefropatijom (DN),gojaznost- glomerulopatija (ORG), nefrotski sindrom minimalnih promjena (MCNS) ili manja glomerularna abnormalnost (MGA), koji su svi dijagnosticirani biopsijom bubrega, te procijeniti može li ekspresija bubrežnog MRP8 predvidjeti renalne ishode.

Cistanche može poboljšati funkciju bubrega

Materijali i metode

Etička izjava

Studija na ljudima sprovedena je u skladu sa principima izraženim u Helsinškoj deklaraciji i odobrena je od strane etičkih komiteta za istraživanje ljudi Medicinskog fakulteta Univerziteta Kjoto i Opšte bolnice grada Osake. Svi učesnici su dali pismeni informirani pristanak. Protokol studije na životinjama odobrio je Komitet za istraživanje životinja Medicinskog fakulteta Univerziteta Kjoto (broj dozvole: Med Kyo 13318). Sve operacije na životinjama izvedene su pod anestezijom natrijum pentobarbitalom, a uloženi su svi napori da se patnja svede na minimum.

Predmeti studija

Proteinični pacijenti sagojaznostili dijabetes tipa 2 koji su bili podvrgnuti biopsiji bubrega uključeni su u ovu studiju. Pacijenti sa zaraznom bolešću, rakom, bolešću jetre ili bolešću kolagena su isključeni. Proteinurija je definirana kao protein u urinu veći od 0.5 g/g kreatinina ili albumin u urinu veći od 300 mg/g kreatinina u najmanje dva uzastopna mjerenja.gojaznostje definiran kao indeks tjelesne mase (BMI) veći od 25.0 (kg/m²). Dijabetes tipa 2 dijagnosticiran je u skladu sa kriterijima Svjetske zdravstvene organizacije. Biohemijska mjerenja pri prijemu na biopsiju bubrega korištena su kao osnovne karakteristike za analizu poprečnog presjeka. Procijenjena brzina glomerularne filtracije (eGFR) izračunata je korištenjem pojednostavljene jednadžbe predviđanja koju je predložilo Japansko društvo za nefrologiju: eGFR (ml/min/1,73 m).²)=1946 [dob (godine)]20.287 6 [serumski kreatinin (mg perdl)]21.094 60.739 (za žene), što je validirana lokalna modifikacija MDRD [ 10]. Koncentracije kreatinina u serumu mjerene su enzimskom metodom.

Za imunohistohemiju, analizirano je 65 japanskih pacijenata koji su bili podvrgnuti biopsiji bubrega na Odsjeku za medicinu i kliničku nauku Univerzitetske bolnice Kyoto između 2000. i 2011. godine. Dijagnoze dokazane biopsijom svih pacijenata tokom ovog perioda su navedene u tabeli S1 u fajlu S1. Ispitanici koji su ispitivani u ovom radu uključivali su DN (n=19), ORG (n=10) i kontrolne subjekte bez gojaznosti, nedijabetičara kojima je dijagnosticirana MGA(n=19) ili MCNS (n=17). Neki slučajevi u ovim kategorijama su isključeni jer su dostupni rezidualni uzorci sadržavali manje od 10 glomerula. Definicija DN se sastojala od (1) trajanja više od 5 godina nakon pojave dijabetesa, (2) postojanja mikro- ili makro-albuminurije, (3) kompatibilnih histopatoloških promjena sa DN kao što su zadebljanje bazalne membrane glomerula, mezangijalna ekspanzija, nodularna skleroza (Kimmelstiel-Wilsonovi noduli) i/ili arteriolarna hialinoza, i (4) isključenje drugih uzroka bubrežnih poremećaja [11]. ORG je morfološki definiran kao fokalna segmentna glomeruloskleroza i/ili glomerulomegalija kod ispitanika koji imaju obagojaznosti proteinurija, čije su definicije gore opisane [12,13].

Za analizu ekspresije mRNA, isključeni su uzorci niske kvalitete, u kojima su nivoi 18S ribosomalne RNK (rRNA) bili niži od granice osjetljivosti detekcije pomoću RT-PCR u realnom vremenu. Uključeni subjekti su se sastojali od 22 pacijenata sa dijabetesom tipa 2 koji su bili podvrgnuti biopsiji bubrega u Općoj bolnici grada Osaka između 2000. i 2010. i 6 kontrolnih subjekata bez dijabetesa, kojima je biopsijom dokazan MGA.

Tabele 1 i 2 sumiraju osnovne kliničke karakteristike pacijenata koji su pregledani imunohistohemijskom analizom ili analizom ekspresije gena, respektivno. Za svjetlosnu mikroskopiju uzorci tkiva su obrađeni prema standardnim procedurama. Presjeci su obojeni hematoksilin-eozinom, periodičnom kiselinom-Schiff, periodičnom kiselinom metenamin srebrom ili Masson trihromom (slika S1). Odnos broja glomerula sa globalnom sklerozom između ukupnog broja glomerula i relativnih područja tubulointersticijalne fibroze nezavisno su procenila dva patologa koji nisu upoznati sa dijagnozom i kliničkim podacima.

Djelovanje cistanche: liječenje bolesti bubrega

Definicija bubrežnih ishoda

Sljedeća dva prognostička indikatora ispitana su linearnom regresijskom i logističko-regresijskom analizom, redom: (1) stepen proteinurije izmjeren godinu dana nakon biopsije i (2) bubrežni događaj definiran kao godišnji porast serumskog kreatinina za 0,50 posto od početka ili početka kronične dijalize.

Imunohistohemija

Imunohistohemija MRP8 i CD68 je sprovedena korišćenjembubregsekcije (debljine 4 mm) fiksirane sa 4 posto puferovanog paraformaldehida. Nakon uzimanja antigena citratnim puferom, sekcije bubrega su inkubirane sa 10 posto kozjeg seruma, a zatim mišjim anti-humanim MRP8 (1:100; BMA biomedicals, Augst, Švicarska)[14] ili mišjim anti-humanim CD68 antitijelima (1:50 DAKO, Ely, UK). Primarna antitijela su vizualizirana sekundarnim antitijelom konjugovanim s peroksidazom hrena i 3,3-diaminobenzidin tetrahidrokloridom (Dako USA, Carpinteria, CA). Nukleusi su obojeni hematoksilinom. MRP8-pozitivne ćelije su izbrojane u više od 10 glomerula, a MRP{17}}pozitivna površina u tubulointersticijumu je izmjerena kvantitativno kako bi se dobio prosjek za svakog subjekta pomoću softvera MetaMorph 7.5 (Molecular Devices, Downingtown, PA, SAD ). Kolokalizacija CD68- i MRP8-pozitivnih ćelija je procijenjena serijskim sekcijama. Nije bilo ni MRP8 ni CD68 signala u negativnim kontrolama obojenim bez prvog antitela (slika S2). Prethodnom inkubacijom anti-MRP8 antitela sa 20 molarnog viška rekombinantnog humanog MRP8 proteina (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornija, SAD) na 4uC preko noći, bojenje je značajno smanjeno, ako ne i potpuno, dodatno podržavajući specifičnost antitela (Sl.S3) .

Cistanche za liječenje bubrega

Evaluacija ekspresije mRNA

Frozenbubregsekcije su razdvojene na glomerula i neglomerulna tkiva mikro-disekcijom laserskog hvatanja (LM200; Olympus, Tokyo, Japan) kao što je prethodno opisano [15]. Ukupna RNK je ekstrahovana sa RNeasy mini kitom (Qiagen, Tokio, Japan). Nivoi ekspresije mRNA su određeni TaqMan PCR u realnom vremenu (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, SAD) [16,17]. Nivoi ekspresije svih gena su normalizovani nivoima 18S rRNA (interna kontrola). Pogledajte tabelu S2 u datoteci S1 za sekvence prajmera i sonde. Eukariotska 18S rRNA detektirana je unaprijed razvijenim TaqMan reagensima za analizu (primijenjeni biosistemi).

Tabela 1. Osnovne kliničke karakteristike pacijenata na biopsiji bubrega koji su imunohistohemijski analizirani na ekspresiju proteina MRP8.

MGA: manja glomerularna abnormalnost, MCNS: nefrotski sindrom minimalnih promjena, ORG:gojaznost-povezana glomerulopatija, DN: dijabetička nefropatija, BMI: indeks tjelesne mase, BUN: azot ureje u krvi, CRP: C-reaktivni protein. Podaci su znači 6 SD. *Ukupne razlike između MGA, MCNS, ORG i DN grupa uporedila je ANOVA.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t001

MRP8 tretman makrofaga

Makrofagi izvedeni iz koštane srži generirani su od divljeg tipa ili TLR4 nokaut (KO) miševa [18] na genetskoj pozadini C57BL/6J (Oriental BioService, Kyoto, Japan) kao što je prethodno opisano [6]. Ukratko, nakon lize crvenih krvnih zrnaca, stanice koštane srži su resuspendirane u mediju koji je sadržavao 20 posto fetalnog telećeg seruma i 50 ng/ml rekombinantnog humanog faktora koji stimulira kolonije makrofaga (Peprotech, Rocky Hill, NJ, SAD) i uzgajane u 37uC u atmosferi od 5% CO2. Dana 7, makrofagi su inkubirani sa rekombinantnim mišjim MRP8 (Abnova, Taipei, Tajvan) ili vehikulom 4 sata. Polimiksin B (25 mg/ml, NacalaiTesque, Kjoto, Japan) je dodan u svaku jažicu da bi se minimizirala kontaminacija endotoksina kao što je prethodno opisano [3,19]. Noendotoksin je detektovan u bilo kojoj koncentraciji MRP8 koja je testirana u nastavku inkubacije sa 25 mg/ml polimiksina B pomoću ToxinSensorChromogenic LAL kompleta za ispitivanje endotoksina (GenScript, Piscataway, NJ, SAD). Ukupna RNK iz ćelija ekstrahirana je pomoću RNeasy MiniKit-a, a nivoi ekspresije mRNA interleukina-1 beta (IL-1b), faktora tumorske nekroze-alfa (TNFa) i MRP8 su određeni TaqMan-om u realnom vremenu RT-PCR. Nivoi ekspresije svih gena su normalizovani nivoima GAPDH glodara (interna kontrola, unapred razvijeni TaqMan reagensi za analizu). Prajmer i probe sekvence za PCR u realnom vremenu navedene su u tabeli S2 u datoteci S1.

Statistička analiza

Podaci su izraženi kao znači 6 SD, ili znači 695 posto intervala pouzdanosti (CI) kada je prikladno. Za poređenje između četiri grupe korišćena je jednosmerna ili dvosmerna ANOVA sa Bonferronijevom post-hoc analizom, a kategoričke varijable su upoređene pomoću x2 testa. Studentov neupareni t-test je primijenjen za poređenje između dvije grupe prema potrebi. Spearmanovi koeficijenti korelacije su procijenjeni da bi se utvrdile veze između dvije varijable. Da bi se ispitali efekti početnih kovarijacija koje određuju stepen glomerularne ili tubulointersticijalne ekspresije MRP8 ili nivoa proteina u urinu godinu dana nakon biopsije, izvršene su univarijantne i multivarijantne linearne regresione analize. Logistička regresiona analiza je korištena za analizu eksplanatornih varijabli koje predviđaju pojavu bubrežnih događaja. Svi podaci su analizirani pomoću softvera StatView 5.0 (SAS InstituteInc., Cary, NC, USA). P vrijednosti,0.05 smatrane su statistički značajnim.

Djelovanje cistanche: liječenje bolesti bubrega

Rezultati

Uporedili smo nivoe ekspresije proteina MRP8 ububregmeđu DN, ORG i ne-gojaznim, nedijabetičkim kontrolnim grupama (MGA i CNS). Imunohistohemijska analiza je otkrila da su i glomerularni MRP8-pozitivni broj ćelija (slika 1A) i tubulointersticijski MRP8-pozitivna površina (slika 1B) u DN bili značajno veći od onih u drugim grupama uključujući MGA, MCNS, i ORG (P<0.01). org="" subjects="" also="" showed="" a="" tendency="" of="" elevated="" mrp8expression="" compared="" to="" mga="" and="" mcns="" (fig.="" 1a,="" 1b).="" furthermore,="" glomerular="" mrp8="" mrna="" expression="" levels="" in="" dn="" subjects="" were="" significantly="" higher="" compared="" to="" non-dm="" control="" subjects="" (p,0.01,="" fig.="" 1c).="" in="" non-glomerulus="" tissues,="" mrp8mrna="" expression="" levels="" were="" much="" lower="" than="" those="" in="" glomeruli,="" both="" in="" non-dm="" and="" dm="" groups.="" abundant="" mrp8="" protein="" expression="" in="" the="" tubulointerstitium="" of="" dn="" cases="" was="" not="" clearly="" reflected="" into="" increased="" mrna="" expression,="" which="" may="" be="" partly="" caused="" by="" deposition="" of="" blood-derived="" proteins="" in="" the="" tubulointerstitium="" as="" discussed="" in="" the="" next="" section.="" as="" shown="" in="" representative="" photos="" (fig.="" 1d–g,="" see="" fig.="" s4="" in="" detail),="" renal="" biopsy="" samples="" from="" mga="" and="" mcns="" subjects="" showed="" few="" mrp8-positive="" cells="" in="" glomeruli="" (fig.="" 1d,="" 1e="" and="" fig.="" s4).="" in="" org="" subjects,="" somemrp8-positive="" cells="" appeared="" in="" glomeruli="" and="" tubulointerstitium(fig.="" 1f="" and="" fig.="" s4).="" in="" dn="" subjects,="" a="" marked="" increase="" of="" mrp8-expressing="" cells="" in="" glomeruli="" and="" significant="" expansion="" of="" mrp8-positive="" areas="" in="" the="" tubulointerstitium="" were="" observed="" in="" a="" focal="" manner="" (fig.="" 1g="" and="" fig.="" s4).="" of="" note,="" mrp8-positive="" cells="" were="" absent="" in="" nodular="" sclerosing="" lesions="" of="" diabetic="" glomeruli="" (fig.="" s4:dn="" case="" 2,="" 3)="" as="" described="" previously="" for="" sclerotic="" lesions="" in="" anca-associated="" glomerulonephritis="" [20].="" paired="" immunohistochemistry="" for="" cd68="" and="" mrp8="" in="" serial="" sections="" suggested="" thatmrp8="" signals="" were,="" at="" least="" in="" part,="" observed="" in="" macrophages="" expressing="" cd68="" (fig.="" 2),="" as="" we="" reported="" in="" a="" mouse="" model="" of="" diabetic="" nephropathy="" [6].="" besides,="" focally="" injured="" atrophic="" tubular="" epithelial="" cells="" also="" strongly="" expressed="" mrp8,="" which="" were="" surrounded="" by="" mrp8(+)-,="" cd68(+)-positive="" macrophages="" (fig.="" 2,="" fig="" s4:="" dn="" case="" 3-5).="" in="" the="" cases="" with="" nephrotic="" range="" proteinuria,="" mrp8="" staining="" was="" also="" observed="" along="" brush="" borders="" of="" proximal="" tubules="" both="" in="" mcns="" and="" dn="" cases="" (fig.="" s4).="" since="" the="" sample="" number="" of="" mrna="" expression="" was="" too="" small="" for="" multivariate="" analysis,="" the="" following="" analyses="" were="" performed="" using="" data="" from="" patients="" studied="" by="">

Tabela 2. Osnovne kliničke karakteristike pacijenata na biopsiji bubrega koji su analizirani na ekspresiju mRNA MRP8 pomoću RT-PCR u realnom vremenu.

Asocijacije izmeđububregMRP8 signali i osnovni klinički parametri u vrijeme biopsije bubrega analizirani su poprečnim presjekom (Tabela 3). Univarijantnom analizom, ekspresija glomerularnog i/ili tubulointersticijalnog MRP8 proteina bila je značajno povezana sa starošću, sistolnim i dijastolnim krvnim pritiskom, proteinom u urinu, nivoima kreatinina u serumu, BUN i HDL holesterola, eGFR-om i stepenom globalne glomeruloskleroze i tubulointersticijalne fibroze. Ovi parametri su dalje ispitani multivarijantnom analizom nakon što su isključeni dijastolički krvni pritisak, eGFR i BUN zbog kolinearnosti. Postotak tubulointersticijske fibroze bio je nezavisno povezan sa glomerularnim MRP8 signalima (b=0.62, prilagođeni P=0.02) i tubulointersticijskim MRP8 signalima (b=0.85, prilagođeni P ,0,001), respektivno. Osim toga, tubulointersticijski MRP8 signali su također bili neovisno povezani s proteinurijom na početku (b=0.20, prilagođeni P=0.01). Analiza raspršene slike između MRP8 signala u glomerulima ili tubulointersticijumu i klinički parametri su pokazali da je MCNSgroup imala različit obrazac distribucije od drugih grupa, posebno u pogledu nivoa proteina u urinu i nivoa LDL holesterola u serumu (sl. S5A–D, S6A–D). Isključivanje MCNS grupe poboljšalo je korelaciju između MRP8 signala i nivoa proteina u urinu ili nivoa LDL holesterola u serumu (sl. S5E–F, S6E–F). Zbog toga smo izvršili podanalizu isključujući pacijente sa MCNS i otkrili da je protein u urinu nezavisan faktor u korelaciji sa glomerularnim MRP8 signalima multivarijantnom analizom (Tabela 4; b=0.36, prilagođeno P=0.03 ).

Zatim smo izvršili linearnu regresiju ili logističku regresijsku analizu da identifikujemo faktore objašnjenja koji predviđaju bubrežne ishode, a to su stepen proteinurije godinu dana kasnije i bubrežni događaj u roku od godinu dana. Pošto je postojala dobra povezanost između glomerularnih i tubulointersticijskih MRP8 signala (slika S7; R=0.67,P,0.001), ovi parametri su alternativno uključeni u dalje analize . Procijenili smo povezanost između osnovnih parametara i proteina u urinu godinu dana nakon biopsije bubrega višestrukom regresijskom analizom. Kao što je prikazano u tabeli 5, glomerularni MRP8 signal (b=0.59, prilagođeni P,0,001) bio je prediktivni faktor za stepen proteinurije godinu dana kasnije, kao i osnovni sistolni krvni pritisak (b {{13} }.21, prilagođeni P=0.04) i početna proteinurija (b=0.37, prilagođeni P=0.002) su bile. Ovi parametri su bili nezavisni od drugih poznatih faktora rizika za dijabetičku nefropatiju, uključujući disfunkciju bubrega (serumski kreatinin) i stepen globalne skleroze i tubulointersticijalne fibroze [11,21–24]. S druge strane, tubulointersticijski MRP8 signal (b=0.34, prilagođeni P=0.09) nije bio nezavisan prediktivni faktor za nivoe proteina u urinu godinu dana kasnije. Bubrežni događaji su se desili kod 7 pacijenata (6 u DN i 1 u ORG slučajevima) u roku od godinu dana nakon biopsije bubrega. Univarijantnom analizom, ne samo opseg glomeruloskleroze i tubulointersticijalne fibroze, te glomerularni i tubulointersticijski MRP8 signali, već i krvni tlak, disfunkcija bubrega i nivoi proteina u urinu na početku su bili značajni prediktivni faktori za pojavu bubrežnih događaja. Međutim, multivarijantnom analizom, njihove kovarijate su poništene jedna od druge (tabela S3 u datoteci S1), vjerovatno zbog visoke korelacije između ovih parametara.

Konačno, ispitali smo moć MRP8 kao endogenog liganda za TLR4 koristeći uzgojene makrofage. U makrofagima dobijenim iz koštane srži iz divljeg tipa miševa, MRP8 proteinom indukovana regulacija proinflamatornih citokinskih gena kao što su IL-1b i TNFa i također je pokrenula auto-indukciju MRP8, na način ovisan o dozi između 1{{ 15}}–1000 ng/ml. Ovi efekti MRP8 su potisnuti približno za dvije trećine u makrofagima dobijenim od TLR4 KO miševa (P,0,01) (Slika 3).

Slika 1. Imunohistohemijske i mRNA analize za MRP8 ububregbiopsijski uzorci. Kvantifikacija glomerularnog MRP{{0}}pozitivnog broja ćelija (A) i tubulointersticijalnog MRP8-pozitivnog područja (B). mRNA ekspresija MRP8 u glomerularnim i neglomerularnim frakcijama (C). Otvorene trake: ne-gojazne, nedijabetičke kontrole koje su MGA ili MCNS, zatvorene trake: ORG ili DN (A–C). Reprezentativne slike MGA, MCNS, ORG i DN grupa (D–G). MGA: manja glomerularna abnormalnost, MCNS: nefrotski sindrom minimalnih promjena, ORG: glomerulopatija povezana s gojaznošću, DN: dijabetička nefropatija. *P,0.01.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g001

Diskusija

Ova studija je pokazala da je MRP8 obilno eksprimiran u glomerulima i tubulointersticijumu pacijenata sa DNas u poređenju sa ORG i ne-gojaznom, nedijabetičkom kontrolom (MGA i MCNS). Štaviše, kod ORG subjekata, nivoi ekspresije MRP8 su imali tendenciju da budu viši od MGA ili MCNS subjekata. U osnovnom ispitivanju poprečnog presjeka, uključujući sve subjekte, univarijantnom linearnom regresijskom analizom, glomerularni MRP8-pozitivan broj ćelija i tubulointersticijski MRP8-pozitivno područje, bili su u korelaciji ne samo s različitim poznatim faktorima rizika za dijabetička nefropatija (kao što je sistolni krvni pritisak, proteinurija i kreatinin u serumu), ali i sa stepenom glomeruloskleroze i tubulointersticijalne fibroze. Multivarijantnom analizom, tubulointersticijalna MRP8-pozitivna oblast je značajno povezana sa proteinurijom i tubulointersticijskom fibrozom. Broj pozitivnih glomerularnih MRP8- ćelija bio je u značajnoj korelaciji sa tubulointersticijskom fibrozom u primarnoj analizi i sa proteinurijom u subanalizi isključujući MCNS grupu. Imunohistohemija je pokazala da je MRP8 eksprimiran, barem djelimično, makrofagima koji eksprimiraju CD68( plus ) i atrofičnim tubulima. Ovi nalazi otvaraju mogućnost dabubregMRP8 signali u glomerulima ili tubulointersticijumu mogu poslužiti kao novi markeri dijabetičke nefropatije.

Slika 2. Lokalizacija ekspresije CD68 i MRP8 proteina u serijskim sekcijama slučajeva dijabetičke nefropatije. Ekspresija ekspresije CD68(A, B) i MRP8 (C, D) u uparenim bubrežnim uzorcima (A i C, iliB i D). Strelice pokazuju kolokalizaciju CD68 i MRP8 signala.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g002

U prognostičkoj studiji, multivarijantna analiza je otkrila da su nivoi proteina u urinu godinu dana nakon biopsije bubrega bili nezavisno povezani sa glomerularnim MRP8-pozitivnim brojem ćelija, proteinom u urinu i sistoličkim krvnim pritiskom na početku. Treba napomenuti da je ekspresija glomerularnog MRP8 pokazala najjaču korelaciju sa proteinom u urinu godinu dana kasnije (b= 0.87), čak i jaču od osnovnog proteina u urinu (b=0.78), univarijantnom analizom. Djelomično je to zato što ekspresija glomerularnog MRP8 nije u velikoj mjeri povišena u 'benignim' oblicima proteinurije kao što su oni uočeni kod pacijenata s MCNS, čiji su nivoi proteinurije izuzetno visoki pri dijagnozi putem biopsije bubrega, ali se obično povlače u roku od godinu dana nakon početka imunosupresivne terapije. Ovi nalazi ukazuju na to da ekspresija glomerularnog MRP8 može imati jedinstvenu prediktivnu prirodu kao marker bolesti, koji se ne može zamijeniti osnovnom proteinurijom ili rutinskom patološkom analizom koja procjenjuje globalnu glomerulosklerozu i tubulointersticijsku fibrozu. Štaviše, mi spekulišemo da ekspresija glomerularnog MRP8 nije jednostavan marker ili posmatrač, već aktivni igrač u glomerularnoj povredi, kao što je objašnjeno u nastavku.

Koeficijent determinacije (R2) izračunat sa parametrima objašnjenja uključenim u analizu višestruke regresije bio je 0.52* i 0.74#, respektivno. y, godine; BP, krvni pritisak; gCr, g kreatinin; T-chol, ukupni holesterol; HDL-Chol, HDL holesterol; LDL-hol, LDL holesterol; GS, glomeruloskleroza; TI, tubulointerstitial.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t003

Tabela 4. Subanaliza odnosa između osnovnih kliničkih parametara i MRP8 signala, nakon isključenja MCNS grupe.

Tabela 5. Analiza višestruke regresije za identifikaciju faktora koji predviđaju nivoe proteina u urinu 1 godinu nakon biopsije bubrega

Slika 3. Efekti MRP8 na makrofage izvedene iz koštane srži. Makrofagi izvedeni iz koštane srži (BMDM) stimulirani su rekombinantnim mišjim MRP8 tokom 4 sata. Trake grešaka ukazuju na 95 posto CI, a statističke analize su obavljene s log transformiranim vrijednostima. Dvosmjerna ANOVA je otkrila značajne efekte genotipova, koncentracija MRP8 i njihovih interakcija na ekspresiju sva 3 gena (P,0.001 za sva poređenja). n=4. WT, divlji tip; KO, nokaut; IL-1b, interleukin 1 beta; TNFa, faktor nekroze tumora-alfa. *P,0,01 među različitim koncentracijama, #P,0,01 među genotipovima.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g003

U drugom pokušaju longitudinalne studije, logistička regresiona analiza nije uspjela pronaći bilo kakve nezavisne prediktore za pojavu bubrežnog događaja u roku od godinu dana. Nagađamo da je to dijelom zbog toga što su tubulointersticijalna ekspresija MRP8 i tubulointersticijska fibroza bili dva moćna prediktora za bubrežni događaj u univarijantnoj analizi, ali su njihove važnosti međusobno poništene u multivarijantnoj analizi. Ova dva parametra su pokazala jaku korelaciju (R=0.68, P,0.001) (slika S8), što sugerira da bi ova dva parametra mogla biti ekvivalentna predviđanju bubrežnih događaja. Zaista, intersticijska ekspresija MRP8 pokazala je prilično sličan obrazac intersticijskoj fibrozi procijenjenoj Massonovim trihromskim bojenjem. Količina intersticijalnog MRP8 u velikoj mjeri ovisi o pozitivnim signalima u atrofičnim tubulima, a ne o onima u makrofagima, čija se karakteristika razlikuje od glomerularnog MRP8 u tačkastom rasporedu. Nadalje, mala veličina uzorka, kratak period posmatranja i nekoliko subjekata koji su razvili bubrežne događaje mogli su smanjiti moć detekcije. Budući da ekspresija MRP8 u tubularnim epitelnim ćelijama igra uzročnu ulogu u napredovanju tubulointersticijske upale u mišjem modelu renalne fibroze[7], bit će potrebna daljnja analiza kako bi se razjasnila uloga tubulointersticijalnog MRP8 u DN.

U skladu sa našom prethodnom studijom [6], MRP8 mRNA je bila povećana pretežno u glomerularnoj frakciji ljudskih DN subjekata u poređenju sa kontrolnim subjektima sa MGA. S druge strane, ekspresija proteina MRP8 uočena je ne samo u glomerulu već iu tubulointersticijumu. S tim u vezi, treba napomenuti da su postojala dva različita obrasca MRP8 bojenja u tubulointersticijumu DN. Jedna je bila intenzivna i žarišna mrlja u jako atrofičnim tubulima. Drugo je bilo blago bojenje raspoređeno duž ivice četkice proksimalnih tubula, što je također pronađeno u ORG i MCNS. Potonji signali vjerovatno predstavljaju protein MRP8 izveden iz krvi i reapsorbiran u proksimalnim tubulima, koji ne bi trebao biti praćen povećanom ekspresijom mRNA MRP8. Što se tiče proteina koji nisu MRP8, mi i drugi smo nedavno prijavili slične fenomene detekcije imunoreaktivnog proteina u proksimalnim tubulima uzrokovanim reapsorpcijom, ali ne i bubrežnom sintezom [25,26]. S druge strane, budući da je malo MRP8 bojenja ostalo u testu apsorpcije antitijela, posebno u glomerularnim eksudativnim lezijama i jako ožiljnim, fibrotičnim lezijama oko atrofičnih tubula, prisustvo nespecifičnih signala ne može se potpuno negirati (Slika S3).

Glomerularni MRP8 signali su uglavnom pokazivali punktuirane obrasce kod DN subjekata (slika 1, slika S4). Budući da su i CD68 i MRP8 otkriveni mišjim monoklonskim antitijelima, lokalizacija ovih molekula procijenjena je serijskim sekcijama, a ne dvostrukim imunološkim bojenjem. Obrasci bojenja MRP8 bili su kompatibilni s onima kod drugih upalnih bubrežnih poremećaja uključujući IgAnefritis [27], membranoproliferativni glomerulonefritis [14] i ANCA glomerulonefritis [20], u kojima su makrofagi predloženi kao glavni izvor MRP8. model glodara [6]. Osim toga, neutrofili se mogu smatrati još jednim izvorom MRP8 koji utiče na vaskularne komplikacije [28]. Trenutno istražujemo molekularni mehanizam zašto se MRP8 pretežno pojačano regulira u stanicama mijeloidne loze koje infiltriraju glomerule. In vitro studija je otkrila da je MRP8 inducirao inflamatornu ekspresiju citokina i potencirao ekspresiju samog MRP8 u makrofagima na TLR{18}}zavisan način. Osim toga, MRP8-pozitivne ćelije su bile odsutne u nodularnim sklerozirajućim lezijama, što sugerira da glomerularni MRP8 može odražavati tekuće oštećenje glomerula [20]. Važno je da je najveća studija na ljudima objavila da je ekspresija gena MRP8 u mononuklearnim ćelijama krvi pacijenata sa dijabetesom tipa 1 značajno povišena kod subjekata sa dijabetičkim komplikacijama uključujući nefropatiju [29].

Budući da je inhibicija renin-angiotenzin sistema (RAS) važna determinanta bubrežnih ishoda, ispitali smo efekte blokade RAS-a nabubregMRP8 izraz. Nismo pronašli značajnu razliku u ekspresiji mRNA MRP8 u bubrezima između pacijenata sa DN liječenim sa ili bez blokade RAS (slika S9), vjerovatno zato što su slučajevi liječeni blokadom RAS obično imali težu hipertenziju i proteinuriju od slučajeva bez blokade RAS

Kod gojaznih ljudi i miševa, povećanje plazmatskog MRP8/14kompleksa može odražavati određeni stepengojaznosta potiču od adipocita kao i od leukocita [8,9]. Naši ORG slučajevi su imali blago bojenje MRP8 u proksimalnim tubulima, što ukazuje na povećane nivoe MRP8 u plazmi. Nasuprot tome, nije postojala značajna korelacija između ekspresije tubulointersticijalnog MRP8 i indeksa tjelesne mase (slika S6G). Stoga, lokalna ekspresija MRP8 ububregmože bolje poslužiti kao marker za oštećenje bubrega, a ne zagojaznost[8,9].

Cistanche za poboljšanje disfunkcije bubrega

Naša studija ima nekoliko ograničenja. Broj uzoraka svake ispitivane grupe bio je mali. Neidentični subjekti su uključeni u mRNA i imunohistohemijske analize. Budući da smo analizirali samo pacijente koji su bili podvrgnuti biopsiji bubrega, sastav pacijenata koji se ovdje istražuje možda neće odražavati one u bolesnika s dijabetesom tipa 2 ili općenito hroničnimbubregbolesnici. Iako starost nije zadržana kao nezavisni faktor povezan sa MRP8 signalima u našim podacima (Tablica 3), poznato je da je starenje povezano s kroničnom upalom [30]. Efekti starosti ne mogu se potpuno zanemariti. Iako je većina MRP8 signala izgubljena u testu apsorpcije antitijela, ostali su pozitivni signali, koji bi mogli biti uzrokovani nespecifičnim vezivanjem prvog antitijela. Kao što je gore spomenuto, ispitivanje ekspresije bubrežnog MRP8 putem biopsije bubrega pomaže nam razumjeti patofiziologiju i prognozu kroničnih bolesti bubrega, posebno povezanih sgojaznosti dijabetes, ali ima nedostatak za rutinsku i ponovnu upotrebu u ambulantama

Ukratko, ova studija sugerira da ekspresija MRP8 ububregodražava trenutni patološki status i također predviđa bubrežne ishode kod pacijenata sagojaznostilidijabetes tipa 2. Dalja istraživanja koja proučavaju nivoe MRP8 u urinu među gojaznim ili dijabetičarima u velikim razmjerima mogu biti opravdana

Popratne informacije

Slika S1 Reprezentativne fotografije koje prikazuju rezove renalne biopsije pacijenta sa DN obojenim (A) periodičnom kiselinom po Schiffu, (B) periodičnom kiselinom metenamin srebrom ili (C) Masson trihromom. Odnos broja glomerula sa globalnom sklerozom (strelice) između ukupnih glomerula i relativne površine tubulointersticijalne fibroze iznosio je 33 posto, odnosno 65 posto, kod ovog pacijenta. (TIFF)

Slika S2 Imunohistohemija za MRP8 i CD68proteine ​​kod pacijenata sa DN. Fotografije u desnoj koloni prikazuju eksperimente negativne kontrole bez prvog antitijela. (TIF)

Slika S3 Test apsorpcije antitijela za bojenje MRP8. PBS: fiziološka otopina puferirana fosfatom, rhMRP8: rekombinantni humani MRP8. (TIF)

Slika S4 Reprezentativne fotografije ekspresije MRP8 u MGA, MCNS, ORG i DN grupama.(TIF)

Slika S5 Korelacija između glomerularnog MRP8-pozitivnog broja ćelija i kliničkih parametara. Korištene su log transformirane vrijednosti MRP8 signala. Korelacije su analizirane koristeći sve 4 grupe (A–D, G) ili 3 grupe isključujući MCNS grupu (E, F). Otvoreni krugovi: manja glomerularna abnormalnost (MGA), zatvoreni krugovi: nefrotski sindrom minimalnih promjena (MCNS), otvoreni trokuti:gojaznost-povezana glomerulopatija (ORG), zatvoreni trokuti: dijabetička nefropatija (DN).(TIF)

Slika S6 Korelacija između tubulointersticijalnog MRP8-pozitivnog područja i kliničkih parametara. Korištene su log transformirane vrijednosti MRP8 signala. Ove korelacije su analizirane koristeći sve 4 grupe (A–D, G) ili 3 grupe isključujući MCNS grupu (E, F).(TIF)

Slika S7 Korelacija između glomerularne i tubulointersticijske ekspresije MRP8. Korištene su log transformirane vrijednosti MRP8 signala. (TIF)

Slika S8 Korelacija između tubulointersticijalnog MRP8-pozitivnog područja i tubulointersticijske fibroze. Korištene su log transformirane vrijednosti MRP8 signala.(TIF)

Slika S9 Ekspresija renalne mRNA MRP8 kod pacijenata sa DN sa ili bez blokade renin-angiotenzin.NS: nije značajno. n=15 (Da), 6 (Ne). Među 22 slučaja DN, informacije o lijekovima nisu bile dostupne kod jednog pacijenta.(TIF)

Fajl S1 Podržava tabele.

Tabela S1, Patološke dijagnoze svih slučajeva koji su bili podvrgnuti biopsiji bubrega na Odsjeku za medicinu i kliničke nauke, Univerzitetska bolnica Kjoto između 2000. i 2011. Tabela S2, Prajmer i sekvence sonde za TaqMan RT-PCR u realnom vremenu. Tabela S3, Logistička regresiona analiza za pojavu bubrežnog događaja u toku godine. (DOC)Zahvalnice Zahvaljujemo S. Tanaka za statističke savjete, Y. Ogawa, N. Igarashi i C. Kimura za tehničku pomoć i A. Yamamoto i SOgino za pomoć sekretara. Prilozi autora Osmislili i dizajnirali eksperimente: TK KM MK HY MI AN KNMM. Eksperimente izveo: TK HI AI KK TM YK MI AN. Analizirani podaci: TK KM MK HY AS SY KU KN MM. Reagensi/materijali/alati za analizu: TK KM. Napisao rad: TK KMMM.

Djelovanje cistanche: liječenje bolesti bubrega

Reference

1. Donath MY, Shoelson SE (2011) Dijabetes tipa 2 kao inflamatorna bolest. Nat Rev Immunol 11: 98–107.

2. Odink K, Cerletti N, Bruggen J, Clerc RG, Tarcsay L, et al. (1987) Dva proteina koji vezuju kalcijum u infiltrirajućim makrofagima reumatoidnog artritisa. Nature 330: 80–82.

3. Vogl T, Tenbrock K, Ludwig S, Leukert N, Ehrhardt C, et al. (2007) Mrp8 i Mrp14 su endogeni aktivatori Toll-like receptora 4, promovišući smrtonosni šok izazvan endotoksinom. Nat Med 13: 1042–1049.

4. Croce K, Gao H, Wang Y, Mooroka T, Sakuma M, et al. (2009) Protein povezan sa mijeloidom-8/14 je kritičan za biološki odgovor na vaskularnu ozljedu. Circulation 120: 427–436.

5. Loser K, Vogl T, Voskort M, Lueken A, Kupas V, et al. (2010) Toll-like receptor 4 ligandi Mrp8 i Mrp14 su ključni u razvoju autoreaktivnih CD8 plus T ćelija. Nat Med 16: 713–717.

6. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H, et al. (2012) Pogoršanje dijabetičke nefropatije hiperlipidemijom je posredovano Toll-like receptor 4 kod miševa. Diabetologia 55: 2256–2266.

7. Fujiu K, Manabe I, Nagai R (2011) Epitelne ćelije bubrežnih sabirnih kanala regulišu upalu kod tubulointersticijskih oštećenja kod miševa. J Clin Invest 121: 3425–3441.

8. Sekimoto R, Kishida K, Nakatsuji H, Nakagawa T, Funahashi T, et al. (2012) Visoki nivoi cirkulacije S100A8/A9 kompleksa (kalprotektina) kod mužjaka Japanaca sa abdominalnom masnoćom i nereguliranom ekspresijom S100A8 i S100A9 u masnom tkivu gojaznih miševa. Biochem Biophys Res Commun 419: 782–789.

9. Mortensen OH, Nielsen AR, Erikstrup C, Plomgaard P, Fischer CP, et al. (2009) Kalprotektin—novi markergojaznost. PLoS One 4: e7419.

10. Matsuo S, Imai E, Horio M, Yasuda Y, Tomita K, et al. (2009) Revidirane jednačine za procijenjenu GFR iz serumskog kreatinina u Japanu. Am JBubregDis53: 982–992.

11. Gross JL, de Azevedo MJ, Silveiro SP, Canani LH, Caramori ML, et al. (2005) Dijabetička nefropatija: dijagnoza, prevencija i liječenje. Diabetes Care 28:164-176.

12. Kambham N, Markowitz GS, Valeri AM, Lin J, D'Agati VD (2001)gojaznost-povezana glomerulopatija: epidemija u nastajanju.BubregInt 59: 1498–1509.

13. Praga M, Morales E (2006)gojaznost, proteinurija i progresija bubrežne insuficijencije. Curr Opin Nephrol Hypertens 15: 481–486.

14. Kawasaki Y, Hosoya M, Takahashi A, Isome M, Tanji M, et al. (2005) Ekspresija proteina 8 povezana s mijeloidom na makrofagima je koristan prognostički marker za disfunkciju bubrega kod djece sa MPGN tipa 1. Am JBubregDis 45: 510–518.

15. Nishiyama A, Konishi Y, Ohashi N, Morikawa T, Urushihara M, et al. (2011) Urinarni angiotenzinogen odražava aktivnost intrarenalnog renin-angiotenzin sistema kod pacijenata sa IgA nefropatijom. Nephrol Dial Transplant 26: 170–177.

16. Ogawa Y, Mukoyama M, Yokoi H, Kasahara M, Mori K, et al. (2012) Natriuretski peptidni receptor gvanilil ciklaze-A štiti podocite od ozljede glomerula izazvane aldosteronom. J Am Soc Nephrol 23: 1198–1209.

17. Yokoi H, Mukoyama M, Mori K, Kasahara M, Suganami T, et al. (2008) Prekomjerna ekspresija faktora rasta vezivnog tkiva u podocitima pogoršava dijabetičku nefropatiju kod miševa.BubregInt 73: 446–455.

18. Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T, et al. (1999) Najnovija oštrica: Miševi sa nedostatkom receptora 4 (TLR4) sličnim Toll-u su slabo reagiraju na lipopolisaharide: dokaz za TLR4 kao Lps genski proizvod. J Immunol162: 3749–3752.

19. Suganami T, Tanimoto-Koyama K, Nishida J, Itoh M, Yuan X, et al. (2007) Uloga puta Toll-like receptor 4/NF-kappaB u inflamatornim promjenama izazvanim zasićenim masnim kiselinama u interakciji između adipocita i makrofaga. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27: 84–91.

20. Pepper RJ, Hamour S, Chavele KM, Todd SK, Rasmussen N, et al. (2013) Ekspresija leukocita i seruma S100A8/S100A9 odražava aktivnost bolesti u vaskulitisu i glomerulonefritisu povezanom s ANCA.BubregInt 83: 1150–1158.

21. Ravid M, Brosh D, Ravid-Safran D, Levy Z, Rachmani R (1998) Glavni faktori rizika za nefropatiju kod dijabetes melitusa tipa 2 su nivoi holesterola u plazmi, srednji krvni pritisak i hiperglikemija. Arch Intern Med 158: 998–1004.

22. Adler AI, Stratton IM, Neil HA, Yudkin JS, Matthews DR, et al. (2000) Povezanost sistoličkog krvnog pritiska sa makrovaskularnim i mikrovaskularnim komplikacijama dijabetesa tipa 2 (UKPDS 36): prospektivna opservaciona studija.BMJ 321: 412–419.

23. Ruggenenti P, Remuzzi G (1998) Nefropatija dijabetes melitusa tipa -2. J Assoc Nephrol 9: 2157–2169.

24. Taft JL, Nolan CJ, Yeung SP, Hewitson TD, Martin FI (1994) Kliničke i histološke korelacije opadanja bubrežne funkcije kod dijabetičara sa proteinurijom. Diabetes 43: 1046–1051.

25. Matsusaka T, Niimura F, Shimizu A, Pastan I, Saito A, et al. (2012) Liverangiotenzinogen je primarni izvor bubrežnog angiotenzina II. J Am Soc Nephrol23: 1181–1189.

26. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H, et al. (2009) Nivo lipokalina povezan sa neutrofilnom želatinazom u urinu odražava oštećenje glomerula, proksimalnih tubula i distalnih nefrona.BubregInt 75: 285–294.

27. Kawasaki Y, Suyama K, Go H, Imamura T, Ushijima Y, et al. (2009) Akumulacija makrofaga koji eksprimiraju protein 8 povezan sa mijeloidom povezana sa progresijom sklerotičnih promjena kod djece sa IgA nefropatijom. Tohoku J Exp Med 218: 49–55.

28. Nagareddy PR, Murphy AJ, Stirzaker RA, Hu Y, Yu S, et al. (2013) Hiperglikemija pospješuje mijelopoezu i otežava rješavanje ateroskleroze. Cell Metab 17: 695–708.

29. Jin Y, Sharma A, Carey C, Hopkins D, Wang X, et al. (2013) Ekspresija inflamatornih gena je pojačana u perifernoj krvi pacijenata sa dijabetesom tipa 1. Diabetes Care.

30. Longo VD, Finch CE (2003) Evolucijska medicina: od sistema patuljastih modela do zdravih stogodišnjaka? Science 299: 1342–1346.

Citiranje: Kuwabara T, Mori K, Kasahara M, Yokoi H, Imamaki H, et al. (2014) Prediktivni značajBubregEkspresija proteina 8 vezanih za mijeloide kod pacijenata sagojaznost- ili bolesti bubrega povezane sa dijabetesom tipa 2. PLOS ONE 9(2): e88942. doi:10.1371/journal.pone.0088942

Urednik: Utpal Sen, Univerzitet Louisville, Sjedinjene Američke Države

Primljeno 11. septembra 2013.; Prihvaćen 14. januara 2014; Objavljeno 18. februara 2014

Autorsko pravo: 2014 Kuwabara et al. Ovo je članak otvorenog pristupa koji se distribuira pod uslovima licence Creative Commons Attribution License, koja dozvoljava neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju na bilo kom mediju, pod uslovom da se navedu originalni autor i izvor.

Finansiranje: Ovaj rad je dijelom podržan od strane Grant-in-Aid za istraživanje dijabetičke nefropatije i nefroskleroze Ministarstva zdravlja, rada i socijalne skrbi Japana (do KM), istraživačkih grantova japanskog Ministarstva obrazovanja, kulture, sporta, nauke i tehnologije (TK, KM i MM), od Japanske fondacije za primijenjenu enzimologiju (za TK) i od Fondacije za istraživanje pušenja (za MM). Finanseri nisu imali nikakvu ulogu u dizajnu studije, prikupljanju podataka i analizi, odluci o objavljivanju ili pripremi rukopisa.

Konkurentni interesi: Autori su izjavili da ne postoje konkurentni interesi.

* E-mail: keyem@kuhp.kyoto-u.ac.jp