baJezik
Dom / Znanje / Sadržaj

Znanje

Plumbagin potiskuje -MSH-indukovanu melanogenezu u ćelijama melanoma miša B16F10 tako što inhibira aktivnost tirozinaze, 2. dio

May 09, 2023

3. Diskusija

Plumbagin je sekundarni metabolit biljnog porijekla i pokazuje nekoliko bioloških funkcija, uključujući protuupalno, antikancerogeno, antialergijsko i antibakterijsko djelovanje [8,9]. Međutim, nije bilo poznato da li plumbagin ima inhibitorni učinak na melanogenezu povezanu s hiperpigmentacijom i melanomom. U ovoj studiji smo pokazali da plumbagin snažno potiskuje melanogenezu u stanicama melanoma B16F10, a ovaj rad bi mogao pružiti priliku za razvoj kozmetike za njegu kože zasnovane na protuupalnim, antialergijskim, antibakterijskim i antimelanogeneznim aktivnostima plumbagina.

Prema relevantnim studijama, cistanche je uobičajena biljka koja je poznata kao "čudotvorna biljka koja produžava život". Njegova glavna komponenta je cistanozid, koji ima različite učinke kao što su antioksidans, protuupalni i promocija imunološke funkcije. Mehanizam između cistanche i izbjeljivanja kože leži u antioksidativnom dejstvu cistanche glikozida. Melanin u ljudskoj koži nastaje oksidacijom tirozina koju katalizira tirozinaza, a reakcija oksidacije zahtijeva sudjelovanje kisika, pa radikali bez kisika u tijelu postaju važan faktor koji utječe na proizvodnju melanina. Cistanche sadrži cistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijelu, čime inhibira proizvodnju melanina.

cistanche nedir

Kliknite na Rou Cong Rong prednosti za izbjeljivanje

Za više informacija:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Budući da se pojačana regulacija melanogeneze često opaža kod malignog melanoma s prekomjerno izraženim nivoima tirozinaze u krvi, kao i tumorskim tkivima, očigledno je da je melanogeneza potencijalna meta za kemoterapiju malignih melanoma [1]. U ovoj studiji smo otkrili da plumbagin direktno potiskuje aktivnost tirozinaze nezavisno od transkripcione mašinerije povezane sa melanogenezom (Slika 6). Stoga naši rezultati sugeriraju da plumbagin može biti potencijalna komponenta preventivne i terapijske strategije za liječenje malignog melanoma. Zaista, prijavljeni su antimelanomski, hemosenzibilizirajući i radiosenzibilizirajući efekti plumbagina na terapiju melanoma [17–21].

cistanche gnc

U prethodnim studijama koje su se bavile antikancerogenim i protuupalnim učincima plumbagina, približno 5–10 µM plumbagina (više od koncentracije korištene u ovoj studiji) korišteno je u in vitro modelima [17,22 ,23]. Stoga smo istraživali toksični učinak plumbagina na proliferativne stanice, uključujući normalne keratinocite (HaCaT) i epitelne stanice sočiva (B3), koje mogu biti oštećene kozmetikom za njegu kože. Naši rezultati su pokazali da niže koncentracije, otprilike 0.5–1 µM plumbagina, nisu toksične za normalne keratinocite i epitelne ćelije sočiva, ali su dovoljno efikasne da smanje aktivnost tirozinaze i sintezu melanina. Osim toga, otkrili smo i da plumbagin efikasnije suzbija melanogenezu od 1 mM arbutina ili 0,2 mM kojične kiseline, koja je dobro poznata sredstva za izbjeljivanje kože. Ovi rezultati sugeriraju da je plumbagin siguran za upotrebu kao komponenta za razvoj kozmetike za izbjeljivanje kože.

U ovoj studiji proučavali smo inhibitorne efekte plumbagina na reakciju enzima tirozinaze koristeći testove aktivnosti tirozinaze bez ćelija i bez ćelija na osnovu L-DOPA oksidacije. Ipak, nismo predložili precizan molekularni mehanizam kako plumbagin inhibira aktivnost tirozinaze. Ovaj mehanizam treba dalje istražiti kako bi se utvrdilo da li plumbagin direktno stupa u interakciju s tirozinazom i inhibira njenu aktivnost oksidaze ili ima indirektne efekte koji dovode do smanjene aktivnosti tirozinaze.

4. Materijali i metode

4.1. Reagensi i antitijela

Plumbagin, -MSH (M4135), arbutin (A4256), kojična kiselina (K3125), L-DOPA (333786) i tirozinaza (T3824) prečišćene iz gljiva kupljeni su od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD). Antitijela protiv MITF (#12590), p-AKTS473 (#4060), p-AKTT308 (#13038), p-CREB (#9198), p-ERK1/2 (#4370), ERK1/2 (#9102), H2AX (#9718), PARP (#5625) i kaspaza-3 (#9665) su kupljeni od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, SAD). Tirozinaza (sc-7833) i -tubulin (sc-9104) su kupljeni od Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, SAD).

cistanche norge

4.2. Ćelijska kultura i analiza vitalnosti ćelije

B16F10 (ćelije melanoma miša), B3 (epitelne ćelije ljudskog sočiva) i HaCaT (ljudski keratinociti) ćelije su uzgajane u Dulbecco-ovom modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) dopunjenom 10 posto fetalnog goveđeg seruma i 25 mM glukoze. Ćelije su inkubirane u vlažnoj atmosferi od 95 posto zraka i 5 posto CO2 na 37 ◦C. Da bi se izmjerila održivost, ćelije su inkubirane s različitim koncentracijama plumbagina otopljenog u dimetil sulfoksidu (DMSO) 48 ili 72 h. Nakon inkubacije, kultivisane ćelije su isprane sa PBS, a zatim inkubirane sa 0,5 posto kristalno ljubičastog rastvora za bojenje 20 minuta na sobnoj temperaturi. Da bi se izmjerila optička gustoća, obojene ćelije su inkubirane s 1% otopinom natrijum dodecil sulfata (SDS) 15 minuta na sobnoj temperaturi, a optička gustina svake jažice je zatim izmjerena na 570 nm (OD570) pomoću čitača apsorbancije (BioTek, Winooski, VT, SAD).

4.3. Imunobloting

Kultivisane ćelije su lizirane upotrebom 1% IGEPAL (oktilfenoksipolietoksietanola), 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM NaF i koktela inhibitora proteaze u puferu za lizu. Uzorci proteina su odvojeni natrijum dodecil sulfat-poliakrilamid gel elektroforezom (SDS-PAGE), a odvojeni proteini su zatim prebačeni na membranu od poliviniliden difluorida (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, SAD). Membrane su inkubirane preko noći sa primarnim antitelima (1:1000) na 4 ◦C, a zatim inkubirane sa sekundarnim antitelima konjugiranim HRP (1:10,000) 1 h na sobnoj temperaturi. Proteini su vizualizirani korištenjem ECL Prime kita (GE Healthcare Pittsburgh, PA, SAD).

4.4. Mjerenje intracelularnog i ekstracelularnog sadržaja melanina

Sadržaj melanina je određen i kvantificiran prethodno opisanom metodom uz neznatnu modifikaciju [2,24]. Za analizu sadržaja melanina, ćelije B16F10 su uzgajane u DMEM-u bez fenola koji sadrži 10 posto fetalnog goveđeg seruma. B16F10 ćelije su kultivisane sa -MSH tretmanom u odsustvu ili prisustvu plumbagina 3 ili 4 dana. Kultivisane ćelije ili podloga su sakupljene i pelete su rastvorene u 1N NaOH koji sadrži 10 procenata DMSO na 80 ◦C tokom 1 h. Sadržaj melanina je mjeren pomoću čitača apsorbancije na 475 nm (OD475), a sadržaj melanina je zatim normaliziran na koncentraciju ćelijskog proteina.

does cistanche work

4.5. Izolacija RNK i kvantitativna RT-PCR

Ukupna RNK je ekstrahovana iz B16F10 ćelija korišćenjem TRIzola (Invitrogen, Waltham, MA, USA) i 2 µg ukupne RNK je upotrijebljeno za sintezu cDNK korištenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Applied Biosystems, Waltham, MA, SAD). Kvantitativni PCR je izveden korišćenjem SYBR Green PCR Master Mixa (Applied Biosystems). Sekvence PCR prajmera (50 –30 ) bile su sledeće: TCAAGTTTCCAGAGACGGGT i CATCATCAGCCTGGAATCAA za MITF; ATAGGTGCATTGGCTTCTGG i TCTTCACCATGCTTTTGTGG za TYR; CATTTCCAG CTGGGTTTCTC i TGGTCTGTGAATCCTTGGAA za TYRP1.

4.6. Test aktivnosti stanične tirozinaze

Aktivnost ćelijske tirozinaze je određena prethodno opisanom metodom sa modifikacijom [25,26]. Kultivisane B16F10 ćelije su inkubirane sa -MSH u odsustvu ili prisustvu plumbagina, a ćelije su zatim isprane i lizirane PBS-om koji je sadržavao 1 posto natrijum deoksiholata i 0.5 posto Triton X{{8} }. Nakon što je određena koncentracija proteina, 50 µg proteina je inkubirano sa 2,0 mM L-DOPA i 0,1 M PBS (pH 6,8) tokom 1 h na 37 ◦C. Oksidacija L-DOPA je izmjerena na 475 nm (OD475) pomoću čitača apsorbancije. Aktivnost je mjerena korištenjem sljedeće formule: aktivnost tirozinaze (procent)=(OD475 uzorka/OD475 kontrole) × 100.

4.7. Test aktivnosti tirozinaze bez ćelija

Da bi se odredio inhibitorni efekat plumbagina na aktivnost tirozinaze, pročišćena tirozinaza gljiva je inkubirana 2 h sa reakcionom smjesom koja sadrži 0.1 M PBS (pH 6,8) i 2 mM L-DOPA u odsustvu ili prisustvu plumbagina . Oksidacija L-DOPA u dopahrom izmjerena je na 475 nm (OD475) čitačem apsorbancije. Aktivnost je mjerena korištenjem sljedeće formule: aktivnost tirozinaze (procent)=(OD475 uzorka/OD475 kontrole) × 100.

4.8. DPPH analiza aktivnosti uklanjanja radikala

Da bi se odredila aktivnost plumbagina uklanjanja radikala, pripremljena je i korištena otopina {{0}}.2 mM DPPH u metanolu. Svaki uzorak je razrijeđen destilovanom vodom do konačnih koncentracija od 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 i 5 mg/mL (plumbagin), ili { {13}}.005, 0.01, 0,05, 0,1, 0,2 i 0,5 mg/mL (vitamin C). Nakon reakcije, optička gustina (OD) je izmjerena na 517 nm (OD517) pomoću čitača apsorbancije. Aktivnost uklanjanja slobodnih radikala izračunata je koristeći sljedeću formulu: DPPH aktivnost uklanjanja radikala ( posto )=10 − ((ODs/ODc) × 100), gdje ODs predstavlja apsorbanciju uzoraka, a ODc apsorbanciju kontrola vozila.

4.9. Statistička analiza

Svi podaci su analizirani korištenjem neuparenog Studentovog t-testa za dva eksperimentalna poređenja i jednosmjerne analize varijanse (ANOVA) sa Tukeyjevim post hoc testom za višestruka poređenja koristeći Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, Kalifornija, SAD). Podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). Razlike između srednjih vrijednosti smatrane su statistički značajnim kada je pridružena p-vrijednost bila manja od 0.05.

5. Zaključci 

Glavni nalazi ove studije su da plumbagin (i) potiskuje -MSH-indukovanu sintezu melanina inhibiranjem aktivnosti tirozinaze; (ii) ne utiče na MITF-povezanu transkripcionu mašineriju i kaskade transdukcije signala uključujući AKT i ERK1/2 aktivaciju povezanu sa melanogenezom; i (iii) ne izaziva toksičnost u normalnim keratinocitima (HaCaT) i epitelnim ćelijama sočiva (B3) kada je njegova koncentracija manja od 5 µM. Uzeti zajedno, plumbagin ukida sintezu melanina izazvanu -MSH inhibiranjem aktivnosti tirozinaze nezavisno od CREB-MITF transkripcione ose. Ovi rezultati stoga sugeriraju obećavajući i siguran prirodni proizvod plumbagin za smanjenje hiperpigmentacije korištenjem u razvoju kozmetike za izbjeljivanje kože.

cistanche and tongkat ali reddit

Priznanja:Ovaj rad je podržao Univerzitet Konkuk 2016.
Doprinosi autora:Ji-Hong Lim je osmislio i dizajnirao eksperimente; Taek-In Oh, Jeong-Mi Yun, Eun-Ji Park i Young-Seon Kim izveli su eksperimente; Ji-Hong Lim, Taek-In Oh i Yoon-Mi Lee analizirali su podatke; Ji-Hong Lim i Yoon-Mi Lee napisali su rukopis.
Sukobi interesa:Autori izjavljuju da nema sukoba interesa.

Skraćenice

-MSH alfa-melanocit-stimulirajući hormon
TYR tirozinaza
L-DOPA L-3,4-dihidroksifenilalanin
Transkripcijski faktor povezan sa MITF mikroftalmijom
TYRP1 protein vezan za tirozinazu 1
CREB cAMP element za vezivanje proteina
PKA protein kinaza A
ERK1/2 ekstracelularna signalno regulirana kinaza 1/2

Reference

1. Riley, PA Melanogeneza i melanom. Pigment Cell Res. 2003, 16, 548–552. [CrossRef] [PubMed]

2. Bae, JS; Han, M.; Yao, C.; Chung, JH Chaetocin inhibira IBMX-induciranu melanogenezu u B16F10 ćelijama melanoma miša kroz aktivaciju ERK. Chem. Biol. Interakcija. 2016, 245, 66–71. [CrossRef] [PubMed]

3. D'Mello, SA; Finlay, GJ; Baguley, BC; Askarian-Amiri, ME Signalni putevi u melanogenezi. Int. J. Mol. Sci. 2016. [CrossRef] [PubMed]

4. Kim, HJ; Yonezawa, T.; Teruya, T.; Woo, JT; Cha, BY Nobiletin, polietoksi flavonoid, smanjen endotelin-1 plus pigmentacija izazvana SCF u ljudskim melanocitima. Photochem. Photobiol. 2015, 91, 379–386. [CrossRef] [PubMed]

5. Kang, SJ; Choi, BR; Lee, EK; Kim, SH; Yi, HY; Park, HR; Song, CH; Lee, YJ; Ku, SK Inhibicijski učinak praha koncentracije sušenog nara na melanogenezu u stanicama melanoma B16F10; uključivanje p38 i PKA signalnih puteva. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 24219–24242. [CrossRef] [PubMed]

6. Kim, JW; Kim, HI; Kim, JH; Kwon, OC; Sin, ES; Lee, CS; Park, YJ Efekti ganodermanondiola, novog inhibitora melanogeneze iz ljekovite gljive Ganoderma lucidum. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1798. [CrossRef] [PubMed]

7. Tsao, YT; Huang, YF; Kuo, CY; Lin, YC; Chiang, WC; Wang, WK; Hsu, CW; Lee, CH Hinokitiol inhibira melanogenezu putem AKT/mTOR signalizacije u B16F10 ćelijama melanoma miša. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 248. [CrossRef] [PubMed]

8. Padhye, S.; Dandawate, P.; Yusufifi, M.; Ahmad, A.; Sarkar, FH Pogledi na ljekovita svojstva plumbagina i njegovih analoga. Med. Res. Rev. 2012, 32, 1131–1158. [CrossRef] [PubMed]

9. Gupta, SC; Kim, JH; Prasad, S.; Aggarwal, BB Regulacija preživljavanja, proliferacije, invazije, angiogeneze i metastaziranja tumorskih stanica kroz modulaciju upalnih puteva nutraceuticima. Cancer Metastasis Rev. 2010, 29, 405–434. [CrossRef] [PubMed]

10. Jackson, JK; Higo, T.; Hunter, WL; Burt, HM Inhibitori topoizomeraze kao anti-artritični agensi. Inflflamm. Res. 2008, 57, 126–134. [CrossRef] [PubMed]

11. Ahmad, A.; Banerjee, S.; Wang, Z.; Kong, D.; Sarkar, FH Plumbagin-indukovana apoptoza ljudskih ćelija raka dojke posredovana je inaktivacijom NF-κB i Bcl-2. J. Cell. Biochem. 2008, 105, 1461–1471. [CrossRef] [PubMed]

12. Aziz, MH; Dreckschmidt, NE; Verma, AK Plumbagin, naftohinon ljekovitog bilja, novi je inhibitor rasta i invazije hormonski refraktornog karcinoma prostate. Cancer Res. 2008, 68, 9024–9032. [CrossRef] [PubMed]

13. Thasni, KA; Rakesh, S.; Rojini, G.; Ratheeshkumar, T.; Srinivas, G.; Priya, S. Estrogen zavisna stanična signalizacija i apoptoza u BRCA1-blokirali su BG1 ćelije raka jajnika kao odgovor na plumbagin i druge hemoterapeutske agense. Ann. Oncol. 2008, 19, 696–705. [CrossRef] [PubMed]

14. Gomathinayagam, R.; Sowmyalakshmi, S.; Mardhatillah, F.; Kumar, R.; Akbarsha, MA; Damodaran, C. Antikancerogeni mehanizam plumbagina, prirodnog jedinjenja, na ćelijama raka pluća ne-malih ćelija. Anticancer Res. 2008, 28, 785–792. [PubMed]

15. Wang, CC; Chiang, YM; Sung, SC; Hsu, YL; Chang, JK; Kuo, PL Plumbagin inducira zaustavljanje ćelijskog ciklusa i apoptozu putem reaktivnih vrsta kiseonika/c-Jun N-terminalnih kinaznih puteva u ćelijama humanog melanoma A375.S2. Cancer Lett. 2008, 259, 82–98. [CrossRef] [PubMed]

16. Shih, YW; Lee, YC; Wu, PF; Lee, YB; Chiang, TA Plumbagin inhibira invaziju i migraciju HepG2 ćelija raka jetre smanjujući proizvodnju matriksne metaloproteinaze-2 i aktivatora urokinaze-plazminogena. Hepatol. Res. 2009, 39, 998–1009. [CrossRef] [PubMed]

17. Anuf, AR; Ramachandran, R.; Krishnasamy, R.; Gandhi, PS; Periyasamy, S. Antiproliferativni efekti Plumbago rosea i njegovog pročišćenog konstituenta plumbagina na SK-MEL 28 ćelijske linije melanoma. Pharmacogn. Res. 2014, 6, 312–319.

18. Gowda, R.; Sharma, A.; Robertson, GP Sinergistički inhibitorni efekti celekoksiba i plumbagina na rast tumora melanoma. Cancer Lett. 2017, 385, 243–250. [CrossRef] [PubMed]

19. Li, J.; Shen, Q.; Peng, R.; Chen, R.; Jiang, P.; Li, Y.; Zhang, L.; Lu, J. Plumbagin pojačava apoptozu posredovanu TRAIL-om kroz regulaciju receptora smrti u ćelijama humanog melanoma A375. J. Huazhong Univ. Sci. Technol. Med. Sci. 2010, 30, 458–463. [CrossRef] [PubMed]

20. Nair, S.; Nair, RR; Srinivas, P.; Srinivas, G.; Pillai, MR Radiosenzibilizirajuće djelovanje plumbagina u stanicama raka grlića materice je kroz modulaciju apoptotičkog puta. Mol. Carcinog. 2008, 47, 22–33. [CrossRef] [PubMed]

21. Prasad, VS; Devi, PU; Rao, BS; Kamath, R. Radiosenzibilni učinak plumbagina na ćelije melanoma miša uzgojene in vitro. Indian J. Exp. Biol. 1996, 34, 857–858. [PubMed]

22. Li, YC; He, SM; On, ZX; Li, M.; Yang, Y.; Pang, JX; Zhang, X.; Chow, K.; Zhou, Q.; Duan, W.; et al. Plumbagin inducira apoptotičku i autofagičnu smrt ćelije kroz inhibiciju PI3K/Akt/mTOR puta u ljudskim ćelijama raka pluća ne-malih ćelija. Cancer Lett. 2014, 344, 239–259. [CrossRef] [PubMed]

23. Checker, R.; Sharma, D.; Sandur, SK; Khanam, S.; Poduval, TB Protuupalni efekti plumbagina su posredovani inhibicijom aktivacije NF-κB u limfocitima. Int. Immunopharmacol. 2009, 9, 949–958. [CrossRef] [PubMed]

24. Kim, B.; Lee, SH; Choi, KY; Kim, HS N-nikotinoil tiramin, novi derivat niacinamida, inhibira melanogenezu suzbijanjem ekspresije MITF gena. EUR. J. Pharmacol. 2015, 764, 1–8. [CrossRef] [PubMed]

25. Lee, HY; Jang, EJ; Bae, SY; Jeon, JE; Park, HJ; Shin, J.; Lee, SK Anti-melanogena aktivnost Gauguina D, visoko oksigeniranog diterpenoida iz morskog sunđera Phorbas sp., putem moduliranja ekspresije i degradacije tirozinaze. Mar. Drugs 2016, 14, 212. [CrossRef] [PubMed]

26. Winder, AJ; Harris, H. Novi testovi za aktivnosti tirozin hidroksilaze i DOPA oksidaze tirozinaze. EUR. J. Biochem. 1991, 198, 317–326. [CrossRef] [PubMed]

Za više informacija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Moglo bi vam se i svidjeti