Pin1 pogoršava ozljedu bubrega uzrokovanu ishemijom i reperfuzijom kod pacova putem Nrf2/HO-1 posredovanog stresa endoplazmatskog retikuluma
Jul 17, 2023
Abstract
1. Svrha
Istražiti ulogu peptidil-prolil cis/trans izomeraze 1 (Pin1) na oštećenje bubrežne ishemije-reperfuzije (I/R) i osnovni mehanizam.
2. Metode
Uspostavljanjem in vitro i in vivo modela bubrežnog I/R, uloga Pin1 je istražena pomoću molekularnih testova.
3. Rezultati:
U bubrežnom I/R, endogeni nivo Pin1 je bio povišen u I/R-oštećenim bubrezima. Supresija Pin1 juglonom pružila je zaštitu od I/R-posredovane disfunkcije bubrega i smanjen stres endoplazmatskog retikuluma (ER) in vivo izazvan I/R. U skladu sa in vivo rezultatima, represija Pin1 sa juglonom ili nokdaun gena sa si-Pin1 dovela je do citoprotekcije i ograničenog ER stresa izazvanog hipoksijom/reoksigenacijom (H/R) u HK-2 ćelijama. Istovremeno, dalja studija je otkrila da su Nrf-2/HO-1 signali povezani sa Pin1 i ER stresom kao odgovor na bubrežni I/R. Osim toga, signalni put Nrf-2/HO-1 je inaktiviran nakon što je bubreg bio izložen I/R, na šta ukazuje niska regulacija Nrf-2/HO{{18 }} nivoa. Nadalje, inhibicija Pin1 je značajno spasila inaktivaciju Nrf-2/HO-1.
4. Zaključak
Pin1 modulirana I/R-posredovana ozljeda bubrega na način ER stresa koji ovisi o Nrf2-HO-1 putu kod I/R ozljede.
Ključne riječi
NIMA-interakcija peptidilprolil izomeraze. Ishemija. Reperfuzija. NF-E2-Povezani faktor 2. Heme oksigenaza-1. Stres endoplazmatskog retikuluma.
Kliknite ovdje da biste dobili efekte Cistanchea na funkciju bubrega
Uvod
Povreda bubrežne ishemije-reperfuzije (I/R), koja se smatra jednim od glavnih stimulansa koji predisponiraju bubreg na akutnu ozljedu bubrega (AKI), može poremetiti funkciju bubrega nakon transplantacije bubrega i parcijalne nefrektomije1. Značajno je da su mehanizmi kojima I/R dovodi do ozljede bubrega složeni i višestruki, s različitim ozlijeđenim stimulansima koji su uključeni u patogenezu, uključujući apoptozu, ER stres, autofagiju i oksidativni stres2,3. Prethodne studije su bile posvećene istraživanju obećavajućih terapeutika za zaštitu od I/R-indukovanog AKI, kao što su daljinsko ishemijsko predkondicioniranje, postkondicioniranje i nove farmakološke intervencije4,5. Međutim, malo rada je potvrđeno u pretkliničkoj fazi. Stoga je neophodno utvrditi potencijalne mehanizme i istražiti nove terapijske ciljeve u bubrežnom I/R.
Pin1 daje svoju funkciju tako što efikasno promoviše konformacijske promjene proteina supstrata kroz specifično identificiranje fosforiliranih Ser/Thr-Pro peptidnih veza6. Pin1 katalizira izomerizaciju supstratnih proteina i mijenja funkcionalne aktivnosti ciljanih fosfoproteina, kako bi kontrolirao mnoge biološke procese, uključujući tumorigenezu i razvoj, transkripciju gena i redoks ravnotežu7. Nedavni izvještaj je pokazao da je Pin1 povezan s progresijom ishemijskog moždanog udara ciljanjem na transaktivaciju p538. Druga studija je pokazala da supresija Pin1 ograničava ishemijsku ozljedu crijeva i da su ti efekti posredovani p66Shc-indukovanom mitohondrijalnom homeostazom6. Međutim, ostaje da se otkrije da li Pin1 posreduje u disfunkciji bubrega u kontekstu I/R ozljede.
Signalni put za nuklearni faktor-eritroid 2-faktor 2/heme oksigenaza-1 (Nrf2/HO-1) povezan je sa različitim biološkim procesima ćelije, uključujući ER stres. Prijavljeno je da je Nrf2/HO-1 uzvodni regulator ER stresa tokom AKI9,10. Međutim, ostaje nepoznato da li je Pin1 u korelaciji sa ekspresijom Nrf2/HO-1 i ER stresom. Ovdje smo pokazali da supresija Pin1 smanjuje I/R-indukovani ER stres kod pacova i istražili uključene mehanizme.
Cistanche dodatak
Metode
1. Životinja, uspostavljanje I/R modela
Mužjaci Sprague-Dawley (SD) pacova (180-200 g, stari 8 sedmica) su dobijeni iz Centra za životinje Shanghai Science Academy (Šangaj, Kina). Projekat je sproveden u skladu sa Principima nege laboratorijskih životinja (NIH Publikacije br. 8023, revidirani 1978). Sve procedure na životinjama odobrene su od strane Institucionalne komisije za njegu i korištenje životinja Medicinskog univerziteta Anhui (broj odobrenja: LLSC20210858). Životinje su držane u slobodno dostupnom okruženju za hranu i vodu sa ciklusom 12-h svjetla i 12-h tame. I/R model je izveden prema dobro uhodanoj metodi11. Ukratko, napravljen je srednji rez abdomena i oba bubrega su otkrivena. Glavne bubrežne arterije i vene identificirane su stereotaktičkim mikroskopom, nakon čega je uslijedila desna nefrektomija. Zatim su leve bubrežne arterije i vene okludirane na 45 min netraumatskim stezaljkama za mikroaneurizme. Nakon 45 minuta bubrežne ishemije, abdomen je ponovo otvoren i stezaljke su uklonjene. Bubrezi su pregledani najmanje 1 min kako bi se osiguralo obnavljanje krvi. Abdomen je zatvoren kontinuiranim 4-0 polipropilenskim šavovima. Bubrežna tkiva i krv su dobijeni u različitim vremenskim tačkama reperfuzije (6, 12, 24 h). Lažna operacija se sastojala od identične procedure bez primjene mikroaneurizma stezaljki na lijevim bubrežnim arterijama i venama.
2. Grupe životinja
Sedamdeset i dva štakora su nasumično podijeljena u sljedeće grupe (n=8): Lažna grupa (n=8)—pacovi su bili izloženi samo lažnoj operaciji; I/R 6 h grupa (n=8), I/R 12 h grupa (n=8) i I/R 24 h grupa (n=8)—pacovi patili od ishemije 45 min i različiti periodi reperfuzije; I/R grupa (n=8)—pacovi su podvrgnuti samo uvredama I/R povredama; I/R plus DMSO grupa (n=8)—pacovima je ubrizgan jednak DMSO prije uspostavljanja I/R; I/R plus juglon (2,5 mg∙kg–1) grupa (n=8), I/R plus jugolon (5 mg∙kg–1) grupa (n=8), I/R plus grupa juglona (10 mg∙kg–1) (n=8) – pacovima su intraperitonealno ubrizgane različite doze juglona (jednom dnevno), tri uzastopna dana prije I/R hirurškog protokola.
3. Testovi seruma
Koncentracije azota uree u krvi (BUN) i Cr u serumu su procijenjene komercijalnim kompletom (kompanija Nanjing Jiancheng, Kina) na osnovu uputstava proizvođača.
4. Ćelijska kultura i tretman
Ćelijska linija ljudskog bubrega (HK-2) uzgajana je u kompletnom Dulbecco-ovom modificiranom mediju orla (DMEM) (Invitrogen, SAD) sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1 posto penicilina i streptomicina u vlažnoj sredini koja sadrži 5 posto CO2 na 37 stepeni. Da bi se uspostavila mimička hipoksična atmosfera H/R modela, ćelije su inkubirane u hipoksičnom inkubatoru sa 1 posto O2, 94 posto N2 i 5 posto CO2 tokom 12 sati. Zatim su za reoksigenaciju ćelije uzgajane u normoksičnom inkubatoru 2, 4 i 6 h. Kontrolne ćelije su uzgajane u vlažnoj atmosferi sa 5 posto CO2 na 37 stepeni.
5. Mala interferirajuća RNA (siRNA) transfekcija
Za transfekciju, HK-2 ćelije su uzgajane u mediju bez FBS. Specifične siRNA ili negativne siRNA (GenePharma, Kina) su transficirane u ćelije korištenjem Lipofectamine 2000 reagensa u trajanju od 6 sati. Zatim je podloga zamijenjena kompletnom podlogom dopunjenom sa 10 posto FBS-a.
Cistanche tubulosa
6. Hematoksilin i eozin (H&E)
Bubrežno tkivo je isječeno na 4 μm debljine, nakon čega je fiksirano, uklopljeno u parafin. Zatim su sekcije korištene za procjenu histoloških oštećenja od strane H&E. Histološke procene su rađene prema prethodno utvrđenim kriterijumima od strane Jablonskog i sar.12. Morfološke promjene su izmjerila dva patologa koji nisu znali ništa o tretiranoj grupi.
7. Lančana reakcija polimeraze reverzne transkripcije (RT-PCR)
Ukupna RNK iz ćelija ili bubrežnog tkiva je pripremljena korišćenjem Trizola (Invitrogen, SAD), nakon čega je usledila sinteza u cDNK pomoću kompleta za reverznu transkripciju cDNA (Applied Biosystems, SAD). qPCR je izveden korištenjem SYBR Green (BioRad). Prajmer sekvence koje ciljaju specifične gene navedene su na sledeći način: R-Pin1: 5΄-GCTCAGGCCGTGTCTACTACTTC-3΄ (F), 5΄-TCCGAGATTGGCTGTGCTTC-3΄ (R); R- -aktin: 5΄-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3΄ (F), 5΄-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3΄ (R). Relativni nivoi ekspresije mRNA mjereni su vrijednostima Ct i normalizirani na GAPDH.
8. Western blotting
Uzorci ukupnih proteina pripremljeni su iz ćelija ili bubrežnog tkiva korišćenjem kompleta za ekstrakciju proteina radioimunoprecipitacionim testom (RIPA). Primarna antitela korišćena u ovom odeljku navedena su na sledeći način: Pin1 (1:1000, Abcam), p-eIF2 (1:1000, tehnologija ćelijske signalizacije), eIF2 (1:1000, tehnologija ćelijske signalizacije), CHOP (1:1000, Tehnologija ćelijske signalizacije), GRP78 (1:1000, tehnologija ćelijske signalizacije), Nrf2 (1:1000, Abcam), HO-1 (1:1000, tehnologija ćelijske signalizacije) i -actin (1:5000, Boster Biološka tehnologija). Svaka traka gustine je izmjerena pomoću slike J.
9. Komplet za brojanje ćelija-8 (CCK-8)
Vijabilnost ćelija je izmjerena pomoću kompleta za detekciju CCK-8 (Beyotime Biotechnology, #C0037) prema uputama.
10. Statističke analize
Podaci prikupljeni iz svake eksperimentalne grupe predstavljeni su kao srednja vrijednost ± standardna greška srednje vrijednosti (SEM). Normalna distribucija podataka procijenjena je Shapiro-Wilkovim testom. Pošto je distribucija normalnosti podataka ispunjena, grupe su upoređene analizom varijanse (ANOVA) praćeno Tukeyjevim testovima višestrukog poređenja kako bi se utvrdilo koje se grupe razlikuju uz poređenje u parovima. Prethodne analize veličine uzorka i post hoc analize snage izračunate su korištenjem G-power paketa. Veličina uzorka izračunata je za ANOVA test, koji je korišten za testiranje glavne hipoteze studije. Kao rezultat analize veličine uzorka koja je obavljena korištenjem prethodnog znanja istraživanja, ustanovljeno je da je 80 štakora, 8 u različitim grupama, trebalo biti uključeno u studiju kako bi se otkrile značajne razlike u grupama koje koriste 80 posto snage (1- =0.80),=0.05 greška (95 posto intervala pouzdanosti) sa dvostranom hipotezom. P < 0,05 se smatra statistički značajnim.
Cistanche prah
Diskusija
Naglasili smo naš rad na ulozi Pin1 u bubrežnom I/R i istražili povezani mehanizam. Rezultati su pokazali da Pin1 može biti uključen u bubrege oštećene I/R. Istovremeno, inhibicija Pin1 je omogućila nefroprotekciju protiv I/oštećene funkcije bubrega i oštećenja tkiva. Osim toga, nivoi Pin1 su bili povišeni nakon H/R in vitro, a inhibicija Pin1 je spriječila stres endoplazmatskog retikuluma izazvan H/R. Štaviše, dalja studija je pokazala da je stres endoplazmatskog retikuluma regulisan Pin1 nezavisno od Nrf2/HO-1 puta. Stoga su ovi novi nalazi pokazali da bi Pin1 mogao biti obećavajući terapeutski cilj za bubrežnu I/R.
Pin1 se smatra ključnim faktorom za regulaciju bioloških procesa modifikacijom ciljane strukture proteina. Može se vezati za p-Ser/Thr-Pro motiv, katalizirati cis-trans izomerizaciju i također dodati još jedan nivo posttranslacijske regulacije13,14. Prethodne studije su pokazale da povećana ekspresija Pin1 potiče patogenezu i progresiju cerebralne i intestinalne I/R ozljede6. Naša studija je pokazala konzistentne rezultate sa prethodnim izvještajima.
Također, istražili smo različite koncentracije Pin1 inhibitora protiv I/R i H/R ozljeda. Inhibicija Pin1 bi mogla ublažiti oštećenu funkciju bubrega i oštećenje strukture uzrokovano I/R. Eksperimenti in vitro su također pokazali da inhibitor Pin1 može zaštititi oštećenu vitalnost HK-2 ćelija izazvanu H/R. Stoga bi inhibicija Pin1 mogla zaštititi od oštećenja bubrežnih I/R. Negativna kontrola (bez intervencije ili nefrektomije) nije grupirana u ovoj studiji. Na osnovu našeg prethodnog istraživanja, nije bilo razlika u bubrežnoj funkciji ili strukturnom oštećenju između lažno operirane grupe i grupe negativne kontrole.
Ishemija-reperfuzija je ozbiljna komplikacija koja se obično dešava kod transplantacije bubrega, parcijalne nefrektomije, operacija srca i drugih velikih operacija6. Relevantni mehanizmi bubrežnog I/R uključuju nekrozu, mitohondrijalnu disfunkciju, apoptozu, ER stres i oksidativni stres15. Među njima, ER stres se smatra jednim od ključnih mehanizama. Prethodna studija je objavila da je liječenje deksmedetomidinom ublažilo AKI posredovano infarktom miokarda ograničavanjem stresa na endoplazmatski retikulum16. Druga studija je pokazala da je oštećenje bubrega I/R-oštećeno liječenjem faktorom rasta fibroblasta2 ovisno o modulaciji stresa endoplazmatskog retikuluma aktivacijom PI3K/AKT i MEK-ERK1/2 signala17. Naša studija je pokazala da je ekspresija proteina povezanih sa ER stresom bila povišena nakon I/R i H/R procesa. Nadalje, inhibicija Pin1, sa inhibitorom in vivo ili si-RNA in vitro, mogla bi ublažiti povišenu ekspresiju proteina povezanih sa ER stresom induciranih I/R ili H/R. Ovi rezultati su ilustrovali da Pin1 pogoršava renalnu I/R povredu kroz povećanje ER stresa in vivo i in vitro.
U fiziološkom stanju, Nrf2 je lociran i kombinovan sa Keap1 proteinom u citoplazmi. Kada je bio pod različitim stresnim stimulacijama, Nrf2 se odvojio od Keap1 i translociran u jezgro, a zatim je podstakao ekspresiju HO-118. Prethodne studije su otkrile da je Nrf2/HO-1 put povezan sa ER stresom tokom I/R procesa. Prijavljeno je da je povišen Nrf2/HO-1 smanjio apoptozu srčanih ćelija izazvanu I/R i ozljedu miokarda kroz ublažavanje signalnih molekula endoplazmatskog retikuluma povezanih sa stresom19. Druga studija je pokazala da je helix B položaj peptida igrao ključnu ulogu u smanjenju akutne ozljede pluća aktivacijom Nrf2/HO-1, što je ograničilo ER stres u epitelnim ćelijama pluća20. Pokazali smo da su nivoi Nrf2/HO-1 smanjeni i da su proteini povezani sa ER stresom bili povišeni nakon I/R stimulansa i inhibicije Pin1 aktiviranih Nrf2/HO-1 signala, štiteći tako bubreg od I /R stimulacija. Da bismo dalje demonstrirali odnos između Nrf2/HO-1 i ER stresa, izveli smo in vitro eksperimente sa inhibitorom Pin1 i inhibitorom Nrf2. Kombinirani tretman s Pin1 inhibitorom i inhibitorom Nrf2 mogao bi preokrenuti smanjenu ekspresiju proteina povezanu sa stresom endoplazmatskog retikuluma izazvanu inhibicijom Pin1, što ukazuje da je Nrf2/HO-1 igrao ključnu ulogu u regulaciji između Pin1 i stresa endoplazmatskog retikuluma.
Cistanche kapsule
Zaključak
Inhibicija Pin1 je pružila zaštitu od I/R ozljede i ograničene povrede bubrega ovisno o regulaciji Nrf2/HO-1. Ovaj efekat se može dogoditi kroz modulaciju ER stresa na I/R stimulans. Ovi rezultati su pokazali da je Pin1 obećavajući terapeutski cilj za bubrežnu I/R ozljedu.
Reference
1. Ronco C, Bellomo R, Kellum JA. Akutna povreda bubrega. Lancet. 2019;394(10212):1949-64. https://doi.org/10.1016/ S0140-6736(19)32563-2
2. He L, Wei Q, Liu J, Yi M, Liu Y, Liu H, Sun L, Peng Y, Liu F, Venkatachalam MA, Dong Z. AKI na CKD: pojačane povrede, potisnuta popravka i osnovni mehanizmi. Kidney Int. 2017;92(5):1071-83. https://doi.org/10.1016/j. knit.2017.06.030
3. Han SJ, Lee HT. Mehanizmi i terapijski ciljevi ishemijske akutne ozljede bubrega. Kidney Res Clin Pract. 2019;38(4):427-40. https://doi.org/10.23876/j.krcp.19.062
4. Zhang Y, Zhang JJ, Liu XH, Wang L. Supresija CBX7 sprječava ishemiju-reperfuziju izazvanu ozljedom endoplazmatskog retikuluma kroz Nrf-2/HO-1 put. Am J Physiol Renal Physiol. 2020;318(6):F1531-8. https://doi. org/10.1152/ajprenal.00088.2020
5. Wang L, Chen Z, Weng X, Wang M, Du Y, Liu X. Kombinirano ishemijsko postkondicioniranje i ozonsko postkondicioniranje pružaju sinergističku zaštitu od ishemije bubrega i reperfuzijske ozljede kroz inhibiciju piroptoze. Urologija. 2019;123:296.E1-8. https://doi.org/10.1016/j.urology.2018.10.015
6. Feng D, Yao J, Wang G, Li Z, Zu G, Li Y, Luo F, Ning S, Qasim W, Chen Z, Tian X. Inhibicija p66Shc posredovane mitohondrijalne apoptoze putem ciljanja prolil-izomeraze Pin1 slabi crijevni ishemija/reperfuzijska povreda kod pacova. Clin Sci (Lond). 2017;131(8):759-73. https://doi.org/10.1042/CS20160799
7. Lee TH, Pastorino L, Lu KP. Peptidil-prolil cis-trans izomeraza Pin1 kod starenja, raka i Alchajmerove bolesti. Stručnjak Rev Mol Med. 2011;13:e21. https://doi.org/10.1017/S1462399411001906
8. Balaganapathy P, Baik SH, Mallilankaraman K, Sobey CG, Jo DG, Arumugam TV. Interakcija između Notch-a i p53 potiče smrt neuronskih stanica u ishemijskom moždanom udaru. J Cereb Blood Flow Metab. 2018;38(10):1781-95. https://doi. org/10.1177/0271678X17715956
9. Zhao W, Huang XD, Zhang LX, Yang XJ, Wang LH, Chen YS, Wang JH, Wu GL. Predtretman penehiklidin hidrohloridom poboljšava AKI izazvan rabdomiolizom aktiviranjem Nrf2/HO-1 puta i ublažavanjem stresa endoplazmatskog retikuluma kod pacova. PLoS One. 2016;11(3):e151158. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0151158
10. Zhang GZ, Zhang K, Yang SQ, Zhang Z, Chen S, Hou BJ, Yuan JY. VASPIN smanjuje upalu i stres endoplazmatskog retikuluma epitelnih ćelija bubrežnih tubularnih ćelija inhibiranjem HMGB1 i ublažava renalnu ishemiju-reperfuziju. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(17):8968-77. https://doi.org/10.26355/eurrev_202009_22839
11. Wang L, Chen ZY, Liu Y, Du Y, Liu XH. Ozonsko oksidativno postkondicioniranje inhibira oksidativni stres i apoptozu kod ishemije bubrega i reperfuzijske ozljede kroz inhibiciju MAPK signalnog puta. Drug Des Devel Ther. 2018;12:1293-301. https://doi.org/10.2147/DDDT.S164927
12. Jablonski P, Howden BO, Rae DA, Birrell CS, Marshall VC, Tange J. Eksperimentalni model za procjenu oporavka bubrega od tople ishemije. Transplantacija. 1983;35(3):198-204. https://doi.org/10.1097/00007890- 198303000-00002
13. Lu KP. Prolil izomerizacija zavisna od fosforilacije: novi regulatorni mehanizam ćelijskog ciklusa. Prog Cell Cycle Res. 2000;4:83-96. https://doi.org/10.1007/978-1-4615-4253-7_8
14. Lu KP, Finn G, Lee TH, Nicholson LK. Prolil cis-trans izomerizacija kao molekularni tajmer. Nat Chem Biol. 2007;3:619- 29. https://doi.org/10.1038/nchembio.2007.35
15. James MT, Bhatt M, Pannu N, Tonelli M. Dugoročni ishodi akutne ozljede bubrega i strategije za poboljšanu njegu. Nat Rev Nephrol. 2020;16(4):193-205. https://doi.org/10.1038/s41581-019-0247-z
16. Tang C, Hu Y, Gao J, Jiang J, Shi S, Wang J, Geng Q, Liang X, Chai X. Predtretman deksmedetomidinom smanjuje reperfuziju izazvanu akutnu ozljedu bubrega i stres endoplazmatskog retikuluma kod ljudi i pacova. Life Sci. 2020;257:118004. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.118004
17. Tan X, Tao Q, Li G, Xiang L, Zheng X, Zhang T, Wu C, Li D. Faktor rasta fibroblasta 2 umanjuje reperfuzijsku ozljedu bubrežne ishemije putem inhibicije stresa endoplazmatskog retikuluma. Front Cell Dev Biol. 2020;8:147. https://doi. org/10.3389/cell.2020.00147
18. Loboda A, Damulewicz M, Pyza E, Jozkowicz A, Dulak J. Uloga Nrf2/HO-1 sistema u razvoju, odgovor na oksidativni stres i bolesti: evolucijski očuvan mehanizam. Cell Mol Life Sci. 2016;73(17):3221-47. https://doi. org/10.1007/s00018-016-2223-0
19. Wang J, Lu L, Chen S, Xie J, Lu S, Zhou Y, Jiang H. Up-regulacija PERK/Nrf2/HO-1 ose štiti miokardno tkivo miševa od oštećenja izazvanog ishemijom-reperfuzijom kroz ublažavanje stresa endoplazmatskog retikuluma. Cardiovasc Diagn Ther. 2020;10(3):500-11. https://doi.org/10.21037/cdt-20-126
20. Bi XG, Li ML, Xu W, You JY, Xie D, Yuan XF, Xiang Y. Helix B površinski peptid štiti od akutne ozljede pluća kroz smanjenje oksidativnog stresa i stresa endoplazmatskog retikuluma putem aktivacije Nrf2/HO{{6} } signalni put. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(12):6919-30. https://doi.org/10.26355/eurrev_202006_21683
Honglin Yu 1, Guanjun Jiang 2 , Wei Hu 3 , Changgeng Xu 4.
1. MD. Odjel za radiologiju – Prva pridružena bolnica Medicinskog univerziteta Anhui – Anhui, Kina.
2. MD. Odjel za urologiju – Peta bolnica u Wuhanu – Wuhan, Kina.
3. MD. Odjel za andrologiju – Prva pridružena bolnica – Hengyang Medical School – Univerzitet Južne Kine – Hunan, Kina.
4. MD. Odsjek za urologiju – Centralna bolnica Wuhan – Medicinski koledž Tongji – Univerzitet nauke i tehnologije Huazhong – Hubei, Kina.
