Fitokemijska analiza, in vitro antiproliferativni, antioksidativni dio 2

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

inhibicijski test a-glukozidaze

Napravljena je serija razblaženja frakcija kako bi se dobile koncentracije od 100,200, 300,400 i 500 mg/ml. Reakcione smjese su sadržavale 0,1 ml otopine 1U/ml -glukozidaze pomiješane sa 0,2 ml razblaženog ekstrakta i 0,5 ml 100 mM fosfatnog pufera, pH 6,8. Smeše su inkubirane na 37 stepeni 15 minuta. Zatim, 0,2 ml 5 mM p-nitrofenila-D-galaktopiranozidU reakcionu smjesu je dodat PNPG, a inkubacija je produžena još 20 min na 37 stepeni. Reakcija je prekinuta dodavanjem 0,1 M NazCO3. Apsorbancija je zabilježena na talasnoj dužini od 405 nm za sve uzorke. Akarboza je korištena kao pozitivna kontrola u istim koncentracijama kao i biljni ekstrakti. Rezultati su izraženi kao postotak inhibicije prema sljedećoj jednačini:

gdje je Ag apsorbancija bez inhibitora enzima, a As je apsorpcija u prisustvu inhibitora enzima [26].

Ćelijske linije i MTS test

HeLa i MCF7 ćelijske linije karcinoma su dobijene iz ATCC-a, ćelije su uzgajane u RPMI-1640 mediju sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma, 1 posto penicilin/streptomicinskih antibiotika i 1 posto L-glutamina. Ćelije su uzgajane u vlažnoj atmosferi sa 5 posto CO2 na 37 stepeni. Ćelije su zasijane u količini od 2,6×10* ćelija/jažici u ploču sa 96-jažicom. Nakon 48h, ćelije su konfluentne, podloga je promijenjena. Ćelije su zatim inkubirane sa različitim koncentracijama frakcija lista u rasponu od 0.25-10 mg/ml R. rothschildianus tokom 24 sata. Procijenjena je vitalnost ćelija

sa CellTilter 96 stepeni Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) prema uputstvima proizvođača (Promega Corporation, Madison, WI). Ukratko, na kraju tretmana, 20 ul MTS rastvora na 100 ul medijuma je dodato u svaku jažicu i inkubirano na 37 stepeni tokom 2 sata. Apsorbancije su mjerene na 490 nm [27,28].

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Statistička analiza

Svi dobijeni rezultati četiri proučavane biljne frakcije (antioksidans, anti-lipaza,anti-amilaze, anti-glikozidaza, icitotoksičnostaktivnosti) izraženi su kao srednja vrijednost±SD standardna devijacija; rezultat se smatrao značajnim kada je p-vrijednost bila<0.05. data="" were="" compared="" using="" unpaired="">

Rezultati

Fitokemijski skrining

Rezultati preliminarnih fitokemijskih ispitivanja vodenih frakcija R. rothschildianus pokazali su prisustvo saponina, fenola, proteina, škroba i flavonoida. Ekstrakt metanola pokazao je prisustvo kompleksnih polisaharida, fenola, proteina i flavonoida, dok su u frakciji acetona uočeni fenoli, tanini i flavonoidi, au frakciji heksana identifikovani su fenoli, tanini i flavonoidi, glikozidi, terpenoidi i steroidi. kao što je prikazano u Tabeli 1. Međutim, za proces ekstrakcije, metanol je pokazao najveći procentualni prinos od 29,4 posto, nakon čega slijedi frakcija acetona sa 16,5 posto. Vodena ekstrakcija dala je 10,6 posto, dok je najmanji prinos (7,3 posto) bio kod heksanske frakcije (tablica 2).

Kvantitativna analiza TPC, TFC i TTC Za procjenu TPC, TFC i TTC dobijene su vrijednosti apsorpcije (Abs) nekoliko koncentracija galne kiseline, rutinske kiseline i standarda katehina (STD) iu vezi sa ovim tačkama , dobijene su tri jednadžbe za svaki STD u odnosu na njegove koncentracije za izračunavanje ukupnog sadržaja fenola, flavonoida i tanina u heksanu, acetonu, metanolu i vodenoj otopini R. Frakcije Rothschild-dijagnoze prikazane su u Tabeli 3.

Cistanche može poboljšati imunitet

Antioksidativna aktivnost

Rezultati procene aktivnosti uklanjanja slobodnih radikala četiri frakcije iz listova R. rothschildianus, koristeći Trolox kao moćnu standardnu ​​referencu za antioksidans, izraženi su kao procenat inhibicije DPPH (Slika 1 i Tabela 4). Stoga se listovi R. rothschildianus mogu smatrati biljnim izvorom antioksidanata i acetonske frakcije, koja je pokazala vrijednost ICso od 6,3±0.4 ug/ml. Slični rezultati su takođe dobijeni za heks-an frakciju, koja je imala ICso vrednost od 7,9±1,3ug/ml (tabela 4). Rezultati su upoređeni sa Troloxom, snažnim antioksidativnim jedinjenjem, sa također jednakim 3,1±0,9 ug/ml. Nasuprot tome, vodena frakcija je pokazala samo umjerenu antioksidativnu aktivnost, s višom vrijednošću ICso od 19,9±0.7ug/ml, dok je metanolni ekstrakt bio neaktivan u ovom testu.

Aktivnost inhibicije lipaze

U ovom testu, aktivnost frakcija iz ekstrakta listova R. rothschildianus protiv gojaznosti upoređena je sa

orlistat, snažno sredstvo za inhibiciju lipaze (slika 2 i tabela 4).R. listovi rothschildianusa bili su odličan alternativni prirodni izvor inhibitora lipaze. Frakcija acetona je pokazala ICso vrijednost od 26,3±0.6ug/ml, što je bilo vrlo blizu vrijednosti referentnog spoja orlistata (12,3±0.3ug/ml). Frakcije heksana i metanola su zabilježile samo umjerene vrijednosti ICso, jednake 39,8±0,3ug/ml i 60,3±0,4ug/ml, respektivno; dok je vodena frakcija bila neaktivna.

Aktivnost inhibicije a-amilaze

U ovom testu, anti-amilazna aktivnost frakcija iz ekstrakta listova R. rothschildianus upoređena je sa onom akarboze, snažnog inhibitora a-amilaze (slika 3). Frakcija acetona je bila najsnažniji inhibitor -amilaze, sa ICso od 19.0±0.7ug/ml, u poređenju sa 28.8±1.2 ug/ml za akarbozu, referentno jedinjenje. Ovo sugerira da bi R. rothschildianus mogao biti moćan biljni lijek za dijabetes. Vodena frakcija je pokazala samo umjerenu aktivnost u ovom testu sa ICso vrijednošću od 45,7±0.3 ug/ml, dok je heksan imao ICso vrijednost od 354,8±1,2ug/ml. Frakcija metanola je bila neaktivna protiv enzima -amilaze. također su izračunate vrijednosti za četiri frakcije (Tabela 4).

aktivnost inhibicije a-glukozidaze

Rezultati za a-glukozidazu su upoređeni sa rezultatima za akarbozu, jak agens inhibicije enzima, a takođe su izračunate vrednosti za četiri frakcije (Tabela 4 i Slika 4). Frakcija acetona je imala najveće inhibitorno dejstvo na -glukozidazu sa ICso od 54,9±0.3 ug/ml, u poređenju sa akarbozom, referentnim jedinjenjem, na 37,1±{{10} },3 ug/ml. Nasuprot tome, frakcija metanolnog ekstrakta pokazala je samo umjerenu inhibiciju -glukozidaze, sa ICso od 251,2±0,4ug/ml, dok su heksan i vodene frakcije bile neaktivne u ovom testu.

Anti-proliferativna aktivnost

Rezultati tretmana HeLa i MCF7 ćelija karcinoma sa pet različitih koncentracija u mg/ml za različite ekstrakte pokazali su da je aktivnost prema HeLa ćelijskoj liniji raka bila bolja nego protiv ćelijske linije raka MCF7. Međutim, ekstrakt heksana bio je najmoćniji

ekstrakt u koncentraciji od 4mg/ml sa procentima inhibicije od 98,9 i 97,4 posto protiv HeLa i MCF7 ćelijskih linija raka, respektivno, dok je metanolni ekstrakt u istoj koncentraciji pokazao snažnu aktivnost protiv HeLa i MCF7 ćelijskih linija raka sa 97,2 i 95,6 posto procenta inhibicije. Procentualna inhibicija HeLa ćelija pri izlaganju frakcijama iz listova R. rothschildianus je dokumentovana, u poređenju sa pozitivnom kontrolom doksorubicina (slika 5a). Procenat inhibicije ćelija MCF7 određen je na sličan način za četiri frakcije iz listova R. rothschildianus, u poređenju sa kontrolom (slika 5b).

Diskusija

DPPH analiza uklanjanja radikala dobro je poznata kao jednostavna metoda za otkrivanje antioksidativnog kapaciteta u spojevima. DPPH je stabilan slobodni radikal koji daje ljubičastu boju u alkoholnim otopinama, a smanjenjem prisustva antioksidansa koji doniraju vodonik, čini otopinu bezbojnom [29]. Stoga se listovi R. rothschildianus mogu smatrati prirodnim izvorom antioksidanata, posebno za acetonsku frakciju, koja je pokazala ICso vrijednost od 6,3±0.4ug/ml. Slični rezultati su takođe dobijeni za frakciju heksana, koja je imala ICso vrednost od 7,9±1,3 ug/ml (tabela 4). Rezultati su upoređeni sa Troloxom, snažnim antioksidativnim jedinjenjem, sa također jednakim 3,1±0,9 ug/ml. Nasuprot tome, vodena frakcija je pokazala samo umjerenu antioksidativnu aktivnost, s višom vrijednošću ICso od 19,9±0.7 ug/ml, dok je metanolni ekstrakt bio neaktivan u ovom testu. Ovi rezultati su bili u skladu sa prisustvom fenola i flavonoida u biljci, moćnog izvora hvatača slobodnih radikala kao što je prikazano sa DPPH u ovoj studiji. Ovi rezultati su bili u skladu s raznolikošću fenolnih spojeva u biljkama, jednostavnih fenola poput galne kiseline i sofisticiranijih fenolnih kiselina poput antocijanina, derivata hidroksilne cimetne kiseline i flavonoida. Sve ove klase jedinjenja dobile su veliku pažnju zbog svojih višestrukih fizioloških funkcija, posebno uklanjanja slobodnih radikala, antimutagenih, protuupalnih i antikancerogenih aktivnosti [30]. Kao što je navedeno u Tabeli 3, ekstrakt acetona bilježi najveći sadržaj i fenolnih jedinjenja i flavonoida, 28,2±0,8mg GAE/g i 107,3±4,6mg RU/g, respektivno. Prethodni izvještaj o nekim vrstama Rumexa pronašao je fenolna jedinjenja u ekstraktu etanola iz listova Rumex vicarious L., koji su vjerovatno bili uključeni u reakcije slobodnih radikala, reducirajući stabilan korišteni DPPH radikal u žućkasto obojeni derivat difenil pikrilhidrazina iz njegove originalne ljubičaste boje. boja [31].

R. rothschildianus leaves were an excellent alternative natural source of lipase inhibitory agents. The acetone fraction showed an ICso value of 26.3±0.6μg/ml, which was very close to that of the reference compound orlistat （12.3±0.3μg/ml）. Hexane and methanol fractions only re-corded moderate ICso values, equal to 39.8±0.3 μg/ml and 60.3±0.4μg/ml, respectively; while the aqueous fraction was inactive. Pancreatic lipase is a major enzyme involved in enterocyte triglyceride absorption. Therefore, its inhibition represents an important strategy in the management of obesity [32]. Plants rich in phenolic compounds have been screened in several reports for anti-lipase activity. Lipase inhibitory activity ranging from 40 to >70 posto je pronađeno in vitro testovima u mnogim različitim porodicama, uključujući Solanaceae (Solanum tuberosum), Brassicaceae (Brassica nigra i Raphanus sativus), Rosaceae (Malus Domestica Borkh. i Filipendula ulmaria (L.) Maxim.),

(Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. i Ericaceae Vaccinium myrtillus L.), i Fabaceae (Pisum sativum L. i Phaseolus vulgaris L.)[33].

Frakcija acetona je bila najsnažniji inhibitor -amilaze, sa ICso od 19.0±0.7ug/ml, u poređenju sa 28.8±1.2 ug/ml za akarbozu, referentno jedinjenje. Ovo sugerira da bi R. rothschildianus mogao biti moćan biljni lijek za dijabetes. Vodena frakcija je pokazala samo umjerenu aktivnost u ovom testu sa ICso vrijednošću od 45,7±0.3 ug/ml, dok je heksan imao ICso vrijednost od 354,8±1,2 ug/ml. Frakcija metanola je bila neaktivna protiv -amilaze. Moguće objašnjenje da je vodena frakcija dobar inhibitor enzima bilo je prisustvo saponina. Ranija naučna istraživanja otkrila su da su saponini bioaktivni protiv dijabetesa [34]. Snažan učinak frakcije acetonskog ekstrakta protiv amilaze može biti posljedica visokog sadržaja fenolnih spojeva i flavonoida. Stručnjaci za Corchorus olitorius - inhibitorni efekti amilaze i glukozidaze zbog sastojaka, posebno fenolnih spojeva poput kafeinske kiseline [35].

Frakcija acetona je imala najveće inhibitorno dejstvo na a-glukozidazu sa ICso od 54,9±0.3ug/ml, u poređenju sa akarbozom, referentnim jedinjenjem, na 37,1±0,3ug/ml . Nasuprot tome, frakcija ekstrakta metanola pokazala je samo umjerenu inhibiciju a-glukozidaze, sa ICso od 251,2±0.4ug/ml, dok su heksan i vodene frakcije bile neaktivne u ovom testu. Treća kategorija oralnih hipoglikemika uključuje inhibitore -glukozidaze. Postoje različiti inhibitori -glukozidaze, kao što su akarboza i vogliboza, koji se obično nalaze u biljnim izvorima. Oni pokazuju vrijednu stabilizaciju nivoa glukoze u krvi nakon obroka i klinički su korišteni u liječenju dijabetes melitusa [36, 37].

Rezultati tretmana obje ćelije raka (HeLa i MCF7) različitim koncentracijama u mg/ml za različite ekstrakte pokazali su da je opća aktivnost protiv HeLa ćelijske linije raka bolja od ćelijske linije raka MCF7. Ekstrakt heksana pokazao je snažno antikancerogeno djelovanje u koncentraciji od 4 mg/ml sa procentima inhibicije od 98,9 i 97,4 posto protiv HeLa i MCF7 ćelijskih linija raka, respektivno, dok je metanolni ekstrakt u istoj koncentraciji pokazao snažnu aktivnost protiv HeLa i MCF7 ćelijskih linija raka sa 97,2 i 95,6 posto procenta inhibicije. Iz prethodnih rezultata, heksanska frakcija je imala značajan citotoksični efekat na ćelije HeLa i MCF7, sa procentima inhibicije koji su dostigli 99 i 92,4 procenata pri 4 mg/ml koncentracije heksanske frakcije, respektivno. Ovo je bilo u skladu sa citotoksičnim efektima i terpenoida i steroida, koji su pronađeni u frakciji heksana. Diosgenin, prirodni steroid i triterpenoid koji se nalazi u nekim biljkama, pokazalo se da inhibira rak dojke [38, 39].

Zaključak

Rezultati ove studije na listovima R. rothschildianus pokazali su da frakcija ekstrakta acetona ima značajan potencijal u pružanju fitoterapije za dijabetes i gojaznost, na osnovu svoje moćne inhibicije lipaze, a-amilaze i a-glukozidaze. Osim toga, acetonska frakcija je također pokazala značajnu aktivnost uklanjanja slobodnih radikala. S druge strane, heksanska frakcija je pokazala značajnu inhibiciju i HeLa i MCF7 ćelijskih linija, što bi moglo biti povezano sa visokim sadržajem terpena i steroida. Ova zapažanja u ovoj studiji mogu dovesti do daljnjih in vivo studija za razvoj novih prirodnih farmaceutskih formulacija učinkovitih u liječenju gojaznosti, dijabetes melitusa i nekih karcinoma.

Ovaj članak je preuzet iz Jaradat et al. BMC komplementarna medicina i terapije (2021) 21:107