Fitokemijska analiza, in vitro antiproliferativni, antioksidativni dio 1

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Pozadina:Rumex rothschildianus je jedini član jedinstvenog dijela roda Rumex, u porodici Polygonaceae. Ova vrsta je vrlo rijetka mala dvodomna jednogodišnja, endemična za Palestinu koja se tradicionalno koristi kao hrana i za liječenje raznih bolesti. Stoga je sadašnje istraživanje imalo za cilj ispitivanje hemijskih sastojaka, antioksidansa, anti-a-amilaze, anti-a-glukozidaze, anticipacije i citotoksičnih efekata četiri frakcije rastvarača listova R. rothschildianus.

Metode:Osušeni prah listova R. rothschildianus ekstrahiran je u četiri rastvarača različitih polariteta. Urađeno je nekoliko kvalitativnih i kvantitativnih fitokemijskih testova kako bi se odredile komponente ekstrakata. Kolorimetrijska analiza je korištena za kvantitativno određivanje fenola, flavonoida i tanina. In vitro testovi su obavljeni za procjenu ekstrakata na antioksidans, anti-a-amilazu, anti-a-glukozidazu i predviđanje inhibitornih aktivnosti, kao i citotoksičnost MTS testom na liniju stanica karcinoma grlića materice (HeLa) i ćelijsku liniju raka dojke (MCF7).

immunity2

Molimo kliknite ovdje da saznate više

Rezultati:Najznačajnija je frakcija acetona u listovima R. rothschildianusantioksidansaktivnost, zbog najvećeg sadržaja flavonoida i fenola, sa vrijednošću ICso od 6,3±0,4 ug/ml, u poređenju sa 3,1±0,9 ug/ml za Trolox, i u pogledu aktivnost inhibicije lipaze acetonska frakcija je pokazala najsnažniju aktivnost sa ICso vrijednošću od 26,3±{{10}}.6 ug/ml, u poređenju sa pozitivnom kontrolom orlistata ICso 12,3 ug/ml. Isti ekstrakt bio je najsnažniji inhibitor a-amilaze i a-glukozidaze, sa vrijednostima ICso od 19,1±0,7 ug/ml i 54,9±0,3 ug/ml, respektivno, u poređenju do 28,8, 37,1±0,3 ug/i akarboze, respektivno. Frakcija heksana pokazala je 99,9 posto inhibiciju HeLa ćelija i 97,4 posto inhibiciju MCF7 ćelija.

zaključak:Acetonska frakcija listova R. rothschildianus mogla bi pružiti izvor bioaktivnih spojeva za liječenje oksidativnog stresa. Slično, frakcija heksana ukazuje na obećavajući antitumorski potencijal R. rothschildianus. Jasno je da je za ove početne indikacije potrebno dalje prečišćavanje potencijalno aktivnih jedinjenja, i na kraju, in vivo studije kako bi se utvrdila njihova efikasnost.

Ključne riječi:Rumex rothschildianus, antioksidans, lipaza, amilaza, troloks, fitohemija, antiproliferativno djelovanje

Pozadina

Biljke su se koristile kao terapija od davnina. Korijenje, sjeme, kora, listovi i cvjetovi korišćeni su u medicinske svrhe. U današnje vrijeme dostupni su sintetički lijekovi koji su efikasni u liječenju širokog spektra bolesti; međutim, neki ljudi i dalje preferiraju biljne lijekove jer se smatra da su manje štetni za ljudski organizam [1,2]. Ljekovito bilje je po definiciji izvor fitokemijskih spojeva koji posjeduju terapeutsko djelovanje. Ova svojstva se oslanjaju na prisustvo različitih sekundarnih metabolita, kao što su fenoli, terpenoidi i alkaloidi [3]. Rumex rothschildianus Aarons. je jedini član jedinstvenog dijela roda Rumex, u porodici Polygonaceae. Ova vrsta je vrlo rijetka mala dvodomna jednogodišnja, endemična u Palestini. Ima prosječnu visinu od 45 cm i karakteriziraju ga uspravne stabljike koje drže radikalne peteljaste listove, koji su kratkotrajni u osnovi i kratko ušiljeni na vrhu. Cvjetovi imaju prečnik od 3-4 mm, dok su tučkasti cvjetovi prečnika oko 2 mm sa membranoznim slojem [4]. Rumex spp. su rasprostranjene u različitim regijama Turske, a zastupljene su sa 22 vrste. Neke od najčešćih vrsta su R.paticia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus i R. caucasicus su višegodišnje biljke rasprostranjene u srednjoj i istočnoj Anadoliji na nadmorskoj visini od {{10 }} m nadmorske visine. Rod Rumex se široko koristi u tradicionalnoj medicini u Turskoj za liječenje poremećaja, kao što su zatvor, dijareja i ekcem [5, 6]. Rod takođe ima neke laksativne, diuretičke, antipiretičke, zacjeljujuće i protuupalne učinke. Mnogi ljudi u istočnom dijelu Turske koriste mlade listove Rumex spp. kao konzervans u siru, kao i za davanje arome hrani [7].

immunity4

Provedena su razna istraživanja na vrstama Rumexa, kao što su antimikrobne aktivnosti koje su prijavljene za neke vrste. Neke bioaktivne fitokemikalije su ranije pronađene u Rumexu vicarious L, kao što su karotenoidi, tokoferoli, polifenoli, flavonoidi i askorbinska kiselina, koji imaju ulogu antioksidansa i prirodnih sredstava za detoksikaciju. Unos antioksidativnih fitokemikalija hranom, poput karotenoida,fenoli, iflavonoidimože zaštititi od nezaraznih bolesti kod ljudi, kao što su rak, kardiovaskularni poremećaji i drugi zdravstveni problemi povezani s oksidativnim stresom [5, 8]. Poznato je da štetni slobodni radikali igraju važnu ulogu u mnogim velikim zdravstvenim problemima, kao što su rak, kardiovaskularne bolesti, reumatoidni artritis, katarakta,Alchajmerova bolesti druge degenerativne bolesti povezane sa starenjem. Antioksidansi su korisne komponente koje neutraliziraju ove slobodne radikale prije nego što napadnu stanice, te stoga sprječavaju oštećenje ćelijskih proteina, lipida iugljikohidrati. Predloženi su različiti prirodni i sintetički antioksidansi za liječenje ljudskih bolesti. Takav interes za ulogu antioksidansa u ljudskom zdravlju potaknuo je istraživanja u oblasti nauke o hrani i ljekovitom bilju, procjenjujući funkciju bilja kao antioksidansa. Antioksidativno djelovanje uključuje sposobnost uklanjanja slobodnih radikala, inhibiciju peroksidacije lipida, sposobnost heliranja metalnih jona, kao i sposobnost smanjenja [9,10].

Rak je jedan od najvećih globalnih zdravstvenih problema. Razvoj i otkrivanje novih lijekova protiv raka i dalje je izuzetno važno zbog različitih faktora. Ovi faktori uključuju tretmane koji mogu izazvati velike nuspojave ili mogu biti prilično skupi. Alternative koje su biološki sigurnije i pristupačnije su i dalje veoma poželjne [11-14].

immunity3

Nekoliko biljnih vrsta smatra se potencijalnim izvorima bioaktivnih molekula kao što su atropin iz listova Belladonna, kokain iz listova koke, vinkristin iz biljke Vinča i mnoge druge koje još uvijek imaju važnu ulogu u modernoj medicini [15,16].

Korisni terapeutski efekti mogu proizaći iz miješanja sekundarnih proizvoda prisutnih u ljekovitom bilju. Ovi spojevi su uglavnom sekundarni metaboliti, poput alkaloida, steroida, tanina, flavonoida i fenola, koji se sintetiziraju i talože u određenim dijelovima ovih biljaka [17,18]. Ova studija istražuje in vitro anti-a-amilaznu, anti- -glukozidazu, antilipazu, antiproliferativnu i antioksidativnu aktivnost različitih frakcija ekstrahovanih iz listova R. rothschildianus.

Metode

Biljni materijal, hemikalije i instrumenti

Listovi R. rothschildianus su ubrani iz zapadnih regiona Palestine, između februara i marta 2018. Identifikovao ih je dr. Nidal Jaradat, iz Farmakognozijske laboratorije na An-Najah National University, pod šifrom uzorka vaučera Pharm-PCT{{3} }. Sve hemikalije su kupljene od Sigma-Aldrich. Spektrofotometar-UV/Visible (Jenway stepen 7135, Stafford-shire, UK), filter papiri (Whitman No. 1, Washington, SAD), uređaj za tresenje (Memmert 531-25-1, Stockholm, Švedska), rotavap aparat (Heidolph -VV 2000, Schwa-bach, Njemačka), mlin (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, Kina), elektronska vaga (Radwag, AS 220/c/2, Torunska, Poljska), zamrzivač-BT85 Korišteni su (Millrock Technology, Kina) i krio-desikator (Mill-rock technology, BT85, Kingston, SAD).

Priprema ekstrakta i frakcionisanje

Osušeni prah listova R. rothschildianus ekstrahiran je dodavanjem rastvarača uzastopno na osnovu njihovog polariteta, počevši od nepolarnog rastvarača heksana, a zatim acetona (polarno aprotično organsko otapalo), metanola (polarnog alkohola) i na kraju destilovane vode (a polarno protonsko otapalo). Za svaku ekstrakciju, oko 25 g mljevenog osušenog lišća stavljeno je u 0.51 heksan na 72 sata u uređaju za miješanje pri 100 rotacija u minuti na 25 stepeni. Najprije je heksan zamijenjen sa 0,5 l acetona, a zatim je zamjena uključivala ekvivalentne količine metanola i vode. Inkubacije u rastvaračima su kao što je gore opisano za heksan. Svaka organska frakcija je filtrirana i koncentrirana pod vakuumom na rotacionom isparivaču, dok je vodena frakcija osušena pomoću sušača smrzavanjem. Konačno, sve sirove frakcije su pohranjene na 4 stepena [19,20].

Prinos svake frakcije izračunat je pomoću sljedeće formule:

Preliminarna fitokemijska procjena

Provedeni su fitokemijski skrining testovi listova R. rothschildianus u četiri frakcije kako bi se identificirali aktivni sekundarni metaboliti. Kvalitativni rezultati su izraženi kao ( plus ) za prisustvo i (-) za odsustvo bioaktivnih fitokemikalija[10,21].

Određivanje ukupnog sadržaja fenola (TPC)

Procedura za određivanje TPC bila je zasnovana na onoj od Cheunga et al. TPC je izražen u miligramima ekvivalenata galne kiseline po gramu suve mase listova (mg GA/g suve težine). Svježe pripremljeni 7,5 postotni rastvor natrijum karbonata je napravljen stavljanjem 7,5 g Na2CO3 u volumetrijsku tikvicu i podešavanjem zapremine na 100ml destilovanom vodom. Standardni referentni rastvor (rastvor galne kiseline) pripremljen je otapanjem 100 mg galne kiseline u destilovanoj vodi do konačne zapremine od 100 ml. Iz ovoga je izvršeno serijsko razrjeđivanje kako bi se dobili rastvori galne kiseline od 100,70,50,40 i 10ug/ml）. Osnovni rastvori frakcija iz listova pripremljeni su otapanjem 100 mg biljnog ekstrakta u destilovanoj vodi i podešeni na ukupnu zapreminu od 100 ml. Reakcione smjese su pripremljene miješanjem 0,5 ml svake frakcije sa 2,5 ml 10% Folin-Ciocalteuovog reagensa, koji je otopljen u vodi sa 2,5 ml 7,5% natrijum bikarbonata. Epruvete za uzorke su inkubirane 45 minuta na 45 stepeni. Zatim je mjerena apsorbancija svakog spektrofotometra na talasnoj dužini od 765 nm. Radni uzorci su pripremljeni u tri primjerka za svako analitičko ispitivanje, iz kojih su izračunate srednje vrijednosti i vrijednosti standardne devijacije [21].

Određivanje ukupnog sadržaja flavonoida (TFC)

TFC u četiri frakcije lista R. rothschildianus je procijenjen korištenjem kalibracione krive rutina (standardno referentno jedinjenje). Rezultati su izraženi kao miligram ekvivalenta rutina po gramu suve težine ekstrakta listova (mg RU/g suve težine). Kalibraciona kriva za rutin je uspostavljena korišćenjem serijskih razblaženja dobijenih iz matične otopine od 1{{10}}0 ug/ml. Da bi se napravio osnovni rastvor, 10 mg rutina je rastvoreno u 10 ml destilovane vode i zatim razblaženo do 100 ml. Nakon toga, osnovni rastvor je razblažen da bi se obezbedio rutin u koncentracijama od 10, 30, 40, 50, 70 i 100 ug/ml. Za pripremu radnog rastvora, 0,5 ml svake frakcije rastvora je pomešano sa 3 ml metanola, 0,2 ml 10% AlCl3, 0,2 ml 1M kalijum acetata i 5 ml destilovane vode, a zatim inkubirano na sobnoj temperaturi 30 min. Prethodni koraci su ponovljeni za svaku od frakcija, nakon čega je mjerena apsorpcija na talasnoj dužini od 415 nm. Za slepu kontrolu, radni rastvor je postavljen sa destilovanom vodom umesto ekstrakta uzorka. Uzorci su pripremljeni u tri primjerka za svako analitičko ispitivanje, iz kojih su izračunate srednje vrijednosti i vrijednosti standardne devijacije [22].

Improve immunity

Određivanje ukupnog sadržaja tanina (TTC) Protokol Suna et al. je korišten za određivanje TTC u četiri frakcije lista R. rothschildianus, što je najčešće korištena procedura. Katehin je korišten kao referentno jedinjenje za konstruiranje kalibracijske krive. Pripremljena je zaliha od 100ug/ml u metanolu, iz koje je napravljena serija razblaženja da bi se dobile koncentracije katehina od 10, 30, 50,70 i 100 ug/ml. Svježe je pripremljen 4-postotni rastvor vanilina u metanolu. Osnovni rastvori frakcija od 100 ug/ml su pripremljeni korišćenjem metanola kao rastvarača. Za radni rastvor, 0,5 ml svake frakcije pomešano je sa 3 ml rastvora vanilina i 1,5 ml koncentrovane HCl. Smjesa je ostavljena da odstoji 15 minuta, a zatim je izmjerena apsorbancija na 500 nm, koristeći radni rastvor postavljen sa metanolom umjesto ekstrakta uzorka kao slijepog uzorka. Svi radni uzorci su analizirani u tri primjerka, iz kojih su izračunate srednje vrijednosti i vrijednosti standardne devijacije. Ukupni tanin u svakoj frakciji izražen je u ekvivalentima katehina (mg CAE/g suhe mase listova)[23].

Metoda antioksidativnog djelovanja

Test čišćenja slobodnih 2,2-difenil-pikrilhidrazil (DPPH) radikala korišten je za mjerenje antioksidativne aktivnosti u različitim frakcijama listova R. rothschildianus. Osnovni rastvor od 1000 ug/ml svake biljne frakcije pripremljen je u metanolu. Osim toga, pripremljena je i otopina Troloxa od 1000 ug/ml (referentni standard). Serija razblaženja je pripremljena od osnovnih rastvora za svaku frakciju, dajući šest serijskih razblaženja od 2, 5, 10, 20, 50 i 100 ug/ml. Jedan ml svakog razblaženja ekstrakta je pomešan sa 1 ml 0,002 g/ml DPPH u metanolu. Dodan je jedan ml metanola da se dobije konačna radna zapremina od 3 ml. DPPH rastvor je bio sveže pripremljen, jer je bio veoma osetljiv na svetlost. Slijepa kontrola serijskih koncentracija bila je DPPH u metanolu u omjeru 1:2, bez dodatka ekstrakta. Svi radni rastvori su inkubirani na sobnoj temperaturi (25 stepeni) u mraku oko 30 min. Optičke gustine su zatim izmjerene spektrofotometrom na talasnoj dužini od 517 nm. Sljedeća jednadžba je korištena za izračunavanje procenta inhibicije DPPH za svaku biljnu frakciju, sa Troloxom kao standardnim spojem:

gdje je Ag zabilježena apsorbancija slijepe otopine, a Ats zabilježena apsorbancija ispitivanog rastvora uzorka [21].

Test inhibicije svinjske pankreasne lipaze

Matične otopine od 500 ug/ml su napravljene od svake biljne frakcije u 10 posto DMSO. Od njih je napravljena serija razblaženja od pet koncentracija od 50,100,200, 300 i 400 ug/ml. Osnovni rastvor svinjske pankreasne lipaze u Tris-HCl puferu od 1 mg/ml pripremljen je sveže neposredno pre upotrebe. Supstrat, p-nitrofenil butirat (PNPB) pripremljen je otapanjem 20,9 mg u 2 ml acetonitrila. Za svaki radni rastvor, 0,1 ml svinjske pankreasne lipaze pomešano je sa 0,2 ml biljne frakcije iz svakog člana serije razblaženja. Dodan je Tris-HCl da bi konačna zapremina radnih rastvora bila 1ml, i oni su inkubirani na 37 stepeni C 15 min. Nakon inkubacije, u svaku epruvetu je dodato 0,1 ml rastvora p-nitrofenil butirata. Smjesa je zatim inkubirana još 30 minuta na 37 stepeni. Aktivnost pankreasne lipaze određena je mjerenjem hidrolize PNPB u p-nitrofenolat na 410 nm, korištenjem UV spektrofotometra. Isti postupak je ponovljen upotrebom orlistata kao standardnog referentnog jedinjenja. Postotak inhibicije lipaze od strane biljnih frakcija izračunat je sljedećom jednadžbom:

gdje je Ap zabilježena apsorbancija slijepe otopine, a Ats zabilježena apsorbancija ispitivanog rastvora uzorka [24]. inhibicijski test a-amilaze

A100 mg svake frakcije je otopljen u nekoliko milimetara 10 posto DMSO-a, a zatim dalje otopljen do 100 ml u 0,02 M Na HPOq/ NaH-PO4,0,006M NaCl, pH 6,9 da bi se konačno dobili osnovni rastvori sa koncentracijom od 1000 ug/ml. Iz njih su pripremljena sljedeća razrjeđenja od 10,50,70,100 i 500 ug/ml, koristeći 10 posto DMSO kao razblaživač. Zapremina od 0,2 ml 2 jedinice/ml svinjske pankreasne -amilaze pomiješana je sa 0,2 ml

biljne frakcije i inkubirano je 10min na 30 stepena. Nakon inkubacije, dodano je 0.2 ml svježe pripremljene 1% otopine škroba u vodi, a epruvete su zatim inkubirane još najmanje tri minute. U ovom trenutku, reakcija je zaustavljena dodatkom 0,2 ml 3,5- dinitro salicilne kiseline (DNSA) reagensa za boju i razrijeđena je sa 5 ml destilovane vode, prije zagrijavanja na 90 stepeni 10 minuta u vodi. kupatilo. Smjesa je zatim ohlađena na sobnu temperaturu, a apsorbanca je izmjerena na 540 nm. Kontrolna slijepa proba je pripremljena korištenjem istih količina opisanih gore, ali zamjenom biljne frakcije sa 0,2 ml pufera. Akarboza je korištena kao standardna referenca prema gore opisanoj proceduri. Inhibicijska aktivnost a-amilaze izračunata je pomoću sljedeće jednadžbe: