Fotosenzitivni nanosklopovi pro-lijekova koji sadrže hemoterapeutsku funkciju mirovanja potencira imunoterapiju raka

Abstract

Imunoterapija u kombinaciji s efikasnim terapijskim sredstvima kao što su kemoterapija i fotodinamička terapija je uspješna strategija za aktiviranje antitumorskih imunoloških odgovora za poboljšanje liječenja protiv raka. Međutim, razvoj multifunkcionalnih biorazgradivih, biokompatibilnih, niskotoksičnih, ali visoko učinkovitih i klinički dostupnih transformiranih nano-imunostimulansa ostaje izazov i velika je potražnja. Ovdje izvještavamo i dizajniramo novi foto-kemoterapeutski nano-prolijek COS-BA/Ce6 NP-a bez nosača kombinacijom tri multifunkcionalne komponente samo-sastavljene prirodne male molekule betulinske kiseline (BA), oligosaharida hitozana topljivog u vodi (COS), i nisko toksični fotosenzibilizator hlorin e6 (Ce6) za povećanje antitumorske efikasnosti imunološkog adjuvansa anti-PD-L{14}posredovane imunoterapije raka. Pokazali smo da dizajnirani nanolijekovi imaju pametnu i prepoznatljivu karakteristiku "mirovanja" u kemoterapijskom učinku sa željenom nižom citotoksičnošću i višestrukim povoljnim terapijskim karakteristikama, uključujući poboljšanu generaciju 1 O2 izazvanu smanjenim energetskim jazom Ce6, pH-odgovorom, dobrom biorazgradljivošću i biokompatibilnost, osiguravajući visoko efikasnu, sinergističku fotokemoterapiju. Štaviše, u kombinaciji sa anti-PD-L1 terapijom, i kemoterapija zasnovana na nano-sastavljanju i kemoterapija/fotodinamička terapija (PDT) mogu efikasno aktivirati antitumorski imunitet pri liječenju primarnih ili udaljenih tumora, otvarajući potencijalno atraktivne mogućnosti za kliničku imunoterapiju.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

KLJUČNE RIJEČI

Imunoterapija raka; Nano-imunostimulansi; Kemoterapeutsko mirovanje; Pro-drog; Samostalna montaža; Prirodna mala molekula; Betulinska kiselina; Fotodinamička terapija

1. Uvod

Imunoterapija protiv raka, kao što je strategija blokade imunološke kontrolne tačke koja koristi PD-L1 ili CTLA-4 za borbu protiv raka aktiviranjem imunološkog sistema domaćina, nesumnjivo je revolucionirala liječenje raka1,2. Nažalost, slab imunološki odgovor i neučinkoviti terapijski efekti uvelike su ograničili njegove kliničke izglede3,4. Nedavno su trenutne studije otkrile da kombinacija imunoterapije s drugim modalitetima kao što su kemoterapija5, fotodinamička terapija (PDT)6, fototermalna terapija (PTT)7 i radioterapija8, može djelotvorno pokrenuti antitumorsku imunogenost indukcijom ćelija raka da se podvrgnu imunogenoj ćelijskoj smrti ( ICD)9, što ukazuje na potencijal imunološke modulacije da aktivira antitumorski imuni odgovor. Brojni inovativni dizajni nanomaterijala zasnovani na ovim sinergističkim kombinacijama imunoterapijskih strategija postigli su značajno poboljšanu aktivnost protiv raka uključujući neorganske10, polimer11 i biomimetičke12 nanočestice (NP). Međutim, razvoj multifunkcionalnih biorazgradivih, biokompatibilnih, niske toksičnosti, ali visoko učinkovitih i klinički dostupnih transformiranih nano-imunostimulansa ostaje veliki izazov i velika potražnja. Prirodni biološki materijali kao što su nukleinske kiseline13, proteini12, peptidi14,15 i mali molekularni prirodni proizvodi16,17 zbog svojih inherentnih prednosti (npr. biokompatibilnost, netoksičnost) privukli su značajan istraživački interes za medicinske primjene. Naročito posljednjih godina, sukcesivno su otkriveni antikancerogeni bioaktivni terpenoidni prirodni mali molekuli (NSM) koji posjeduju funkciju samosastavljanja18,19. Na primjer, betulinska kiselina (BA), ergosterol (ET) i abietinska kiselina (AA) mogu se samostalno sastaviti u mikronske ili nano-strukturirane čestice. Ovi NSM-ovi su atraktivni gradivni blokovi za korištenje za razvoj antitumorskih agenasa za sinergističku kemoterapiju i PDT. Dokazano je da pokazuju značajne prednosti lake nano-proizvodnje, bolje biokompatibilnosti i biorazgradljivosti, niže toksičnosti uz smanjeno oštećenje jetre i visokog sinergizma u antitumorskoj terapiji20e23. Ovo pruža obećavajuće alternative za razvoj klinički dostupnih prevodivih nano-imunostimulansa za sinergističku imunoterapiju. Međutim, generalno jača lipofilnost ovih NSM-a dovela je do neefikasne stanične endocitoze, što je oslabilo njihovu antikancerogenu aktivnost i ograničilo njihovu kliničku vrijednost za liječenje raka24. Slično uobičajeno prijavljenim nanokompozitima, odgovarajuće nano-formulacije NSM-a promovirale su staničnu apsorpciju kako bi poboljšale kemoterapeutske efekte, ali i nenamjerno povećale rizik od nespecifične citotoksičnosti na normalne stanice22. Stoga je vrijedno dubokog razmišljanja o tome kako maksimizirati antikancerogenu efikasnost terpenoidnih NSM nanoagensa uz minimiziranje njihove toksičnosti za normalno tkivo kao ključno pitanje u procesu sinergističke imunoterapije.

cistanche koristi za muškarce - jača imuni sistem

Strategije pro-lijekova se intenzivno primjenjuju kako bi se poboljšalo uzimanje lipofilnih malih molekula u ćeliji povećanjem hidrofilnosti25. Općenito, amfifilni lijekovi posebno posjeduju veću efikasnost ćelijske apsorpcije od hidrofilnih ili lipofilnih lijekova26. Što je veća stanična fagocitoza, to je bolja terapijska efikasnost24. Stoga, razvoj amfifilnih terpenoidnih NSMs prolijekova molekula može biti potencijalna metoda za maksimiziranje njihovih terapijskih efekata. Osim toga, nanolijekovi koji reaguju na stimulanse na specifično mikrookruženje tumora (npr. kiselina, redoks odgovor) imaju veliko obećanje za kontrolu oslobađanja lijeka, što je korisno u suzbijanju citotoksičnosti kemoterapeutskih lijekova27,28. U međuvremenu, supramolekularno sastavljanje (npr. pristup reprecipitacije) bila je efikasna strategija za pripremu nanolijekova koji su visoko topljivi u vodi bez nosača22,29, za koje se moglo očekivati ​​da će do određenog stepena malo smanjiti efikasnost fagocitoze amfifilnih NSM-a, smanjujući tako njihovu pre- dizajnirana citotoksičnost. Pretpostavljamo da su nanolijekovi koji reaguju na stimuluse i potpuno hidrofilni nanolijekovi dalje uspostavljeni na osnovu amfifilnih NSM predlijekova i da mogu efikasno potisnuti njegovu nespecifičnu citotoksičnost na normalne ćelije, istovremeno stimulirajući oslobađanje visoko toksičnih amfifilnih NSM-ova u tumorske ćelije, olakšavajući njihovo mirovanje u normalnim tkivima i aktivacija na mestu tumora. Važno je odabrati odgovarajući prekursor rastvorljiv u vodi i prekursor koji reaguje na stimuluse za modifikovanje terpenoidnih NSM-a za pripremu amfifilnih molekula pro-lijekova. Godinama, oligosaharidi hitozana (COS), kao razgrađeni produkti hitozana, ne samo da imaju dobru topljivost u vodi i obilne eOH oreNH2 grupe koje dovode do dobrog pH odgovora, već imaju i korisne antitumorske aktivnosti jačanjem imunološke funkcije domaćina kroz regulaciju aktivnosti. imunih ćelija kao što su monocitni makrofagi i limfociti30,31. Oni garantuju ogromnu mogućnost konstruisanja ciljnih nano imunostimulanata koji reaguju na stimulanse za sinergističku imunoterapiju.

Ovdje se, na osnovu gore navedenih razmatranja, u našem eksperimentalnom dizajnu koristi pentaciklički triterpenski NSM betulinske kiseline (BA) kao snažno sredstvo protiv raka32, COS je uveden za sintetizaciju amfifilne molekule COS-BA radi poboljšanja kemoterapeutskog efekta. Klorin e6 (Ce6), široko korišteni fotosenzibilizator s vrlo niskom/bez tamne toksičnosti33, korišten je za konstruiranje fotoosjetljivog prolijeka COS-BA/Ce6 NP u potpunosti topljivog u vodi bez nosača koristeći direktnu strategiju ko-sastavljanja. COS-BA/Ce6 NP kombinuje dva terapeutska modaliteta, kemoterapiju i fotodinamičku terapiju (PDT), koji mogu efikasno povećati prezentaciju tumorskih antigena na T ćelijama, generišući robusne imunološke odgovore uz pomoć imunog adjuvansa anti-PD-L1 da izazove visoko efikasnu i sinergističku antitumornu kemoterapiju/PDT/imunoterapiju (šema 1). Konstruisani COS-BA/Ce6 NP pokazali su pametnu funkciju mirovanja sa podmuklim efektima hemoterapije, tj. neozračeni ko-sastavljeni NP pokazali su značajno inhibiranu in vitro citotoksičnost u poređenju sa amfifilnim COS-BA, bilo protiv raka ili normalnih ćelija. Pripisuje se karakterističnom ponašanju koje reagira na pH, ima nisku toksičnost i biološku sigurnost za normalno tkivo in vivo, ali je visoko toksičan za tumorsko tkivo zbog stimulirajućeg oslobađanja hiperaktivnog COS-BA u slabo kiselom mikrookruženju tumora34. Prema našim najboljim saznanjima, trenutno se još uvijek rijetko prijavljuju dizajnirani nano lijekovi koji imaju ovu funkciju kemoterapeutskog mirovanja. U međuvremenu, nanolijek ima višestruke povoljne terapeutske karakteristike kao što je poboljšana generacija 1 O2 smanjenjem energetskog jaza (DEST) Ce6, brz biološki metabolizam i pojačana akumulacija tumora, što je dovelo do efikasne i sigurne antitumorske kombinacije kemoterapije i PDT tretmana. Što je još važnije, i NP-bazirana kemoterapija i kemoterapija/PDT sistemi mogu efikasno aktivirati antitumorski imunitet olakšavanjem proliferacije CD8þ T ćelija koje proizvode TNF-a i IFN-g u primarnim ili udaljenim tumorima. Naš predloženi biorazgradivi, biokompatibilni, jedinstveno neaktivni, biosigurni i visoko efikasni foto-kemoterapeutski nano-lijek postiže značajne sistemske imunološke terapijske odgovore, otvarajući atraktivne mogućnosti za kliničku primjenu u liječenju udaljene ili metastatske terapije raka.

Šema 1 PDT i kemoterapija ko-sastavljenih COS-BA/Ce6 NP-a potencirali su anti-PD-L1 da induciraju sistemsku antitumornu imunoterapiju. Uvođenje COS-a rastvorljivog u vodi može efikasno poboljšati hemoterapeutsku aktivnost BA (prikazano kao polumač), što rezultira hiperaktivnim COS-BA amfifilnim prolijekom (dugi mač). Kada su zajedno sastavljeni sa fotosenzibilizatorom Ce6 (korica), nano-sklopovi sa strukturom ljuske i pH-osjetljivi nano-sklopovi imali su pametnu i prepoznatljivu funkciju "uspavanja" sa inhibiranom kemoterapijskom toksičnošću za normalna tkiva. Ali, kada stigne i bude stimulisan kiselim (Hþ) tumorskim mikrookruženjem, visoko aktivni amfifilni prolijek COS-BA će se osloboditi što će rezultirati značajnom kemoterapijom. Pored toga, konstruisani kosklopovi pokazali su odličnu PDT aktivnost sa pojačanim stvaranjem singletnog kiseonika (1 O2) izazvanog smanjenim energetskim jazom između singletnog i tripletnog pobuđenog stanja (DEST) Ce6. U kombinaciji sa blokadom kontrolne tačke anti-PD-L1, oslobađanje antigena povezanih sa tumorom nakon hemoterapije/PDT tretmana može efikasno aktivirati sistemski antitumorski imuni odgovor za udaljenu imunoterapiju raka.

2. Materijali i metode

2.1. Sinteza COS-BA

Betulinska kiselina (40 mg, 0.1 mmol), EDC (38 mg, 0.2 mmol) i NHS (17 mg, 0.15 mmol) ) rastvoreni su u 3 mL N,N-dimetilformamida (DMF). Nakon miješanja na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 min, 96 mg vodenog rastvora COS (1 mL) je lagano dodano u kapima u smjesu i miješano 24 h. Zatim je reakciona smeša razblažena sa CH2Cl2 i više puta ekstrahovana. CH2Cl2 sloj je uparen i pročišćen na koloni silika gela. Nereagirani BA je u početku uklonjen upotrebom petrolej etra: acetona (5:1, v/v) kao eluenta, a zatim promijenjen na 3:1 da bi se dobio bijeli COS-BA (prinos: 42%), gdje je COS identificiran kao dimer ( n Z 2). 1H NMR (40{{70}} MHz, CDCl3) d: 8,98 (1H, s, BA-28 O] CeNH), 4,73 (1H, s, H -29a), 4,60 (1H, s, H-29b), 3,18 (1H, dd, JZ 4,8, 10,8 Hz, H-3), 2,95e3,93 (8H, m, COS), 2,64 (3H, s, CH3eCOS), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H-25), 0,90 (3H, s, H{ {69}}), 0,97 (3H, s, H-26), 0,98 (3H, s, H-27), 1,70 (3H, s, H-30). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) d: 179,18 (CO, COS), 156,43 (C- 28), 150,97 (C-20), 109,03 (C-29), 78,74, 77,04 , 69.32, 69.22, 65.25, 58.14, 55.62, 55.21, 53.65, 53.22, 50.52, 45.96, 44.32, 44.11, 41.85, 40.7, 41.89, 40.7. 04, 36.39, 35.31, 34.21, 31.81, 31.54, 31.17, 30.28 29.09, 27.80, 27.22, 25.74, 25.53, 20.91, 19.48, 18.12, 16.02, 15.87, 15.17, 14.65, 14.62. ESIeMS m/z: 814,5871 [M‒6H] (C44H72N2O12).

2.2. Priprema COS-BA/Ce6 NP

Ko-sastavljeni COS-BA/Ce6 NP pripremljeni su metodom reprecipitacije u jednom koraku. Obično je prvo pomešano 5 mL Ce6 (33 mmol/L) i 40 mL COS-BA (33 mmol/L) DMSO rastvora. Nakon toga, smjesa je brzo ubrizgana u 1 mL vode koja je sadržavala 10 mL NaOH (50 mmol/L) uz ultrazvučnu obradu (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, Kina). Nakon ultrazvučne obrade u trajanju od 10 minuta, COS-BA/Ce6 NP-ovi su dobijeni centrifugiranjem na 13,{17}} o/min (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, Kina) u trajanju od 25 minuta. Druge formulacije sa različitim omjerima COS-BA prema Ce6 pripremljene su istim postupkom sa konstantnim molarnim omjerom NaOH prema Ce6 od 3:1.

2.3. Ćelijske linije

Ljudske MCF-7, HepG2, LO2 i mišje 4T1, L929 ćelijske linije obezbjeđuje Institut za biohemiju i ćelijsku biologiju, SIBS, CAS (Kina). MCF-7, HepG2 i LO2 su uzgajani u DMEM mediju sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, Gibco) i 1% antibiotika penicilin-streptomicina (Life Technology, SAD) na 37 C. 4T1 i L929 su uzgajani u RMPI-1640 medij sa istim omjerom kao gore.

2.4. Studije stanične apsorpcije i endocitnih puteva

Za ispitivanje staničnog preuzimanja, 4T1 ili LO2 ćelije su inkubirane sa slobodnim Ce6 ili COS-BA/Ce6 NP (ekvivalentna koncentracija Ce6: 1,7 mg/mL, COS-BA: 19,5 mg/mL, BA: 10 .8 mg/mL) za različita vremena. Nakon ispiranja, fiksiranja i DIPA (#D9542, Sigma) bojenja, ćelije su snimljene pod fluorescentnim invertiranim mikroskopom (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Changchun, Kina). Intenzitet fluorescencije određen je protočnom citometrijom na Guava EasyCyte mini sistemu (Merck Millipore, Njemačka). Za kvantifikaciju efikasnosti apsorpcije, ćelijska akumulacija BA i COS-BA je izmjerena pomoću HPLC (Agilent 1200, SAD). Tipično, 4T1 ćelije su tretirane slobodnim COS-BA ili BA (ekvivalent BA: 25 mg/mL) tokom 0,5 i 3 sata. Nakon ispiranja sa PBS-om, ćelijske pelete su sakupljene i podvrgnute ultrazvučnoj homogenizaciji (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, Kina) za lizu ćelija. Zatim je COS-BA ili BA ekstrahovan hloroformom za HPLC analizu nakon liofilizacije uzoraka. Mobilna faza je bila voda (0,2% fosforna kiselina) i acetonitril pri brzini protoka od 1,0 mL/min, a odgovarajući volumni odnosi su bili 60:40 i 15:85 (v/v) za analizu COS-BA i BA, respektivno. . Talasna dužina detekcije bila je 213 nm. Za ispitivanje endocitnih puteva COS-BA/Ce6 NP-ova, 4T1 ćelije su posađene u 6-jažice i inkubirane 24 h prije nego što su prethodno tretirane različitim inhibitorima endocitoze 30 minuta, uključujući inhibitor mikropinocitoze [50 mmol/L , etil izopropil amilorid (EIPA) (#N132356, Aladdin)], inhibitor endocitoze posredovan klatrinom [20 mmol/L, hlorpromazin (#C7010, Solarbio)], inhibitor endocitoze posredovan caveolama [25 mmol/L, caveolae #IN0260, Solarbio)], i inhibitor acidifikacije lizosoma [50 mmol/L, hlorokin fosfat (#C9720, Solarbio)]35. Zatim su ćelije dalje kultivisane sa 2 mL COS-BA/Ce6 NP (Ce6: 1,7 mg/mL, COS-BA: 19,5 mg/mL) tokom 2 h i snimljene pod FIM (UP Optotech). Ćelije inkubirane bez endocitnog inhibitora na 37 C postavljene su kao kontrolne i na inkubaciji na niskoj temperaturi (4 C) za procjenu energetski zavisne endocitoze. U međuvremenu, srednji intenzitet fluorescencije ćelija takođe je određen protočnom citometrijom.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

Kliknite ovdje za pregled proizvoda Cistanche Enhance Immunity

【Zatražite više】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Ispitivanje citotoksičnosti

4T1 ćelije su posađene u 96-ploču sa jažicom. Zatim su ćelije tretirane različitim koncentracijama COS-BA NP tokom 24 h. Nakon toga, 10 mL MTT (#M158055, Aladdin) boje (5 mg/mL) je dodat u jažicu i inkubiran dodatna 4 h, a zatim je dodato 150 mL DMSO da se rastvori kristali formazana . Apsorbancija svake jažice na 492 nm zabilježena je čitačem mikroploče. Za grupu na zračenju, ćelije su tretirane lijekovima 4 h, zatim ozračene 10 min svjetlošću 675  10 nm i inkubirane dodatnih 20 h. Citotoksičnost COS-BA/ Ce6 NP (1 mg/mL Ce6 odgovara 11,5 mg/mL COS-BA i 6,4 mg/mL BA) na druge ćelije (MCF-7, HepG2, LO2 i L929) su takođe određene istim MTT testom samo sa različitim medijumom. U međuvremenu, kombinovani indeks je izračunat softverom CompuSyn 2.0 koristeći izračun Chou Talalay teorema36.

2.6. Životinjski modeli

Svi eksperimentalni postupci izvedeni su prema protokolima odobrenim od strane Komiteta za njegu i korištenje životinja Medicinskog univerziteta Harbin. 4T1 ćelije su suspendovane u medijumu RMPI-1640 i subkutano ubrizgane u desnu stranu svake ženke BALB/c miša (18e22 g, 6e7 nedelja).

2.7. In/ex vivo fluorescentno snimanje

200 mL COS-BA/Ce6 NPs 5% rastvora glukoze (ekvivalent Ce6: 0,35 mg/mL, COS-BA: 4,02 mg/mL) je ubrizgan kroz repnu venu miševima koji nose tumor. Nakon toga, izvršeno je fluorescentno snimanje tumorskih mjesta u unaprijed određeno vrijeme korištenjem AniView 100/600 multi-model in vivo sistema za snimanje životinja (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Kina) sa ekscitacijom na 630 nm. Nakon 24 h nakon injekcije, glavni organi (srce, jetra, slezina, pluća i bubrezi) i tumor su prikupljeni za ex vivo fluorescentno snimanje. Osim toga, evaluirane su ex vivo fluorescentne slike tumora i glavnih organa u različito vrijeme nakon iv injekcija Ce6 ili COS-BA/Ce6 NP.

2.8. In vivo kemoterapija/PDT

4T1-miševi koji nose (75e100 mm3) su nasumično podijeljeni u šest grupa (n Z 5): 1) 5% rastvor glukoze; 2) Ce6; 3) Ce6 sa zračenjem; 4) COS-BA (40,2 mg/kg, pri čemu BA: 22,3 mg/kg); 5) COS-BA/Ce6 NP; 6) COS-BA/Ce6 NP sa zračenjem. Za svaku grupu, miševima je ubrizgano 200 mL COS-BA/Ce6 NP (ekvivalent Ce6: 3,5 mg/kg tijela) kroz repnu venu 0, 2. i 4. dana. Za grupe na zračenju, na 4 h nakon injekcije nakon svake primjene, svi miševi su anestezirani izofluranom, a mjesta tumora su ozračena 675  10 nm (150 mW/cm2) svjetlošću tokom 15 minuta. Zapremine tumora i tjelesna težina miševa se također bilježe svaki drugi dan. Volumen tumora se izračunava po formuli: VZ širina2 dužina/2. Nakon 14 dana tretmana, tumori su izrezani i izmjereni kako bi se izračunao omjer inhibicije tumora (TIR) ​​po uobičajenoj jednačini: TIRZ (1 uzorak/kontrola) 100%. Pri čemu su uzorak i kontrola bili prosječna težina tumora svake tretirane grupe i grupe sa 5% vodenog rastvora glukoze, respektivno.

2.9. In vivo kemoterapija/PDT/imunoterapija

Da bi se demonstrirao potencijal COS-BA/Ce6 NP u kombinaciji sa imunoterapijom, bilateralni model tumora je dizajniran kroz subkutanu injekciju 4T1 ćelija u lijevi i desni bok. Kada su se tumori približili 75e100 mm3, miševi su podijeljeni u pet grupa. (1) Kontrola; (2) COS-BA/ Ce6 NP (COS-BA Z 40,2 mg/kg, gdje je BA Z 22,3 mg/kg); (3) COS-BA/Ce6 NPs þ svjetlo; (4) COS-BA/Ce6 NP þ anti-PDL1; (5) COS-BA/Ce6 NP þ anti-PD-L1 þ svjetlo. Dana 0, 200 mL 5% rastvora glukoze (Grupa 1) ili COS-BA/Ce6 NP (Ce6 Z 3,5 mg/kg) (Grupa 2, 3, 4, 5) je iv ubrizgano miševima. Nakon 4 h nakon injekcije, desni tumori Grupe 3 i 4 su zračeni 15 minuta. Miševi su anestezirani izofluranom i kotrljani na jednu stranu kako bi se izbjeglo izlaganje lijevog tumora. Zatim je anti-PD-L1 antitijelo (BioXcell, broj proizvoda: BE0101, broj klona: 10F.9G2) iv ubrizgano miševima za Grupe 4 i 5 dana 2, 4 i 6 (15 mg po mišu po injekciji). Dužina i širina svakog tumora su praćeni svaki drugi dan. Nakon 14 dana tretmana, krvni serum miševa je sakupljen za procjenu interferona-gama (IFN-g) (#KMC4021) i faktora tumorske nekroze (TNF-a) (#BMS607-3) koristeći ELISA test (eBioscience ). Tumori su sakupljeni, disocirani, tretirani puferom za lizu crvenih krvnih zrnaca i isprani sa PBS centrifugiranjem. Zatim je suspenzija ćelija obojena anti-CD3-FITC (#MA1-10187, klon 145-2C11, eBioscience) i anti-CD8a-PE (#12-0081-85, klon 53-6.7, eBioscience). Nakon toga, infiltracija citotoksičnih T limfocita (CTL) u desnom i lijevom tumoru nakon različitih tretmana procijenjena je protočnom citometrijom.

3. Rezultati i diskusija

3.1. Sinteza, proizvodnja i karakterizacija COS-BA/ Ce6 NP

U ovoj studiji dizajnirali smo novi prolijek male molekule COS-BA na bazi kitozan oligosaharida topljivog u vodi (COS), koji može povećati kemoterapeutsku aktivnost pentacikličke triterpene betulinske kiseline (BA) poboljšanjem preuzimanja stanica kroz povećanje hidrofilnosti. Ovdje korišteni COS (stepen polimerizacije, DP: 2e6) pripremljen je našim prethodno opisanim metodom30. Zatim je COS-BA sintetiziran reakcijom kondenzacije dehidratacije. U kombinaciji sa analizom glavnih komponenti COS-a, smatralo se da je hemijska struktura COS-BA disaharidom (DP:2) modifikovana BA (popratne informacije slika S1), što je potvrđeno 1H NMR, 13C NMR i ESIeMS (Pomoćne informacije, slike S2eS4). Analiza reprezentativnog 1H NMR pokazala je jasan protonski signal COS oko 2,64e3,93 ppm i C]CH2 vrhova (4,60, 4,73 ppm) BA, demonstrirajući uspješnu sintezu COS-BA (slika 1A). Za pripremu spojenog sinergističkog antitumorskog reagensa COS-BA/Ce6 NP, korišćen je svestrani pristup reprecipitacije u saradnji sa visoko efikasnim fotosenzibilizatorom Ce6. Promjenom početnih molarnih omjera, obje formulacije za komontažu COS-BA/Ce6 mogle bi formirati sferične nanostrukture sa moduliranim veličinama (slika 1B i prateće informacije slika S5). U različitim ulaznim omjerima COS-BA/Ce6, hidrofilni promjeri COS-BA/Ce6 NP bili su blizu 200e300 nm sa negativnim z-potencijalom. S obzirom da su NP pripremljeni u formulaciji 8:1 pokazali niži indeks polidisperznosti (PDI, 0,143) sa relativno manjom veličinom (249 nm), dovoljna količina hemoterapeutskog agensa COS-BA je takođe bila potrebna za kombinatorni tretman. Stoga smo za sljedeću studiju odabrali formulacije COS-BA/Ce6 (8:1). Pod ovom optimizacijom, COS-BA/Ce6 NP su pokazali usku distribuciju veličine (slika 1C) i dobru topljivost u vodi, što ukazuje na njihovu koloidnu prirodu (slika 1D). Da bi se istražili razlozi koji stoje iza ove uspješne ko-sastavljanja, primarno ponašanje slobodnog COS-BA istraženo je pomoću skenirajuće elektronske mikroskopije (SEM) (Slika 1E), što je sugeriralo da COS-BA može formirati visoko ujednačenu nano- sfera od w168 nm, što implicira da hemijska modifikacija COS ne menja sposobnost samosastavljanja samog BA (Popratne informacije, slika S6). To je to svojstvo koje na kraju dovodi do uspješne izgradnje kosklopova. Značajno je da osim čvrste nanostrukture potvrđene transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM), COS-BA/ Ce6 NP-ovi su pokazali izrazitu strukturu ljuske bez COS-BA NP-a, a prosječna debljina ljuske bila je približno 2,35 nm. Druga fizičko-hemijska karakterizacija je sažeta na slici 1F. Osim toga, COS-BA/Ce6 NP su pokazali negativan z-potencijal od 5,38 mV i hidrodinamičku veličinu od w249 nm, veći od one dobijene iz SEM (w182 nm). Istovremeno, efikasnost punjenja Ce6 i inkapsulacije iznosila je 8,1 odnosno 96%, što je utvrđeno tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC). Takođe, FT-IR podaci (slika 1G) dodatno su potvrdili ovu ko-sastavljanje jer su COS-BA/Ce6 NP pokazivali karakteristične C]N, CeN i C]CH pikove Ce6 koji se pojavljuju na 1633, 1078 i 633 cm 1 , odnosno.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

3.2. Zajednički mehanizam i formiranje strukture ljuske

Nakon toga, da bismo bolje razumjeli mehanizam komontaže, prvo smo istražili primarni proces formiranja NP-a. Otkrili smo da ko-sastavljanje COS-BA sa Ce6 može biti spontano jer bi ove dvije vrste također mogle formirati sferičnu nanostrukturu čak i bez ultrazvuka (Podaci za podršku, slika S7), što može biti posljedica negativne Gibbsove promjene slobodne energije (DG ) u kosklopovima37. Ovo spontano sklapanje je takođe sugerisalo jaču intermolekularnu interakciju između COS-BA i Ce6. Generalno, intermolekularne interakcije u supramolekularnim samo (ili ko-) sklopovima su nekovalentno p‒p-slaganje, vodonične veze i van der Waalsove sile 38,39. Za ovu analizu, zatim smo istražili UV apsorpciju COS-BA/Ce6 NP (slike 1H i F), što je sugeriralo crveno pomaknute Soretove (410 nm) i Qy (667 nm) trake u poređenju sa slobodni Ce6 (405 i 665 nm, respektivno). U međuvremenu, značajna crveno-pomaknuta karakteristika apsorpcije COS-BA također se može pronaći, što ukazuje na moguće intermolekularno slaganje pp između COS-BA i Ce640. Štaviše, nakon inkubacije sa surfaktantom natrijum dodecil sulfatom (SDS, 0,2% w/v) (Popratne informacije, slika S8), COS-BA/Ce6 NPs su pokazali novo plavo pomaknutu Qy traku na 641 nm i dramatično obnovljenu fluorescenciju, demonstrirajući da su hidrofobne interakcije također doprinijele zajedničkom sastavljanju28. Budući da su ove asocijativne nekovalentne interakcije, ko-sklopovi su pokazali značajno gašenje fluorescencije (98,2%) u vodi (slika 1I). Kolektivno, razumno je vjerovati da p‒p slaganje i hidrofobne interakcije mogu biti glavne pokretačke snage za izgradnju kosklopova. Nakon toga, da bismo intuitivnije vizualizirali proces sklapanja i otkrili osnovne razloge zašto se NP-ovi sa strukturom ljuske mogu formirati, izveli smo pojednostavljeni simulacijski model molekularne dinamike (MD) koji sadrži 16 optimiziranih COS-BA molekula i dodatna dva Ce6 u kutiji za vodu. . U početku smo procijenili moguću interakciju/vezivanje COS-BA samosklopa unutar 5 ns vremena simulacije (slika 2A i prateće informacije, slika S9). Otkrili smo da se, osim brojnih intramolekularnih vodoničnih veza u COS frakciji, može uočiti i nekoliko parova intermolekularnih H-veza između COS-BA (slika 2B i prateće informacije, slika S10), što ukazuje da vodikova veza može biti jedna glavnih pokretačkih snaga za formiranje COS-BA NP. Posebno je zanimljivo, u samosastavljanju COS-BA, svi COS-BA molekuli formiraju naizgled simetričnu strukturu (slika 2C). Ovaj fascinantni fenomen motivirao nas je da istražimo moguću vezu između ove osobine i formiranja COSBA NP-ova sa strukturom ljuske. Zatim smo pokušali da proširimo jedinice kutije. Iznenađujuće, povezane kutije koje se sastoje od COS-BA molekula bile su raspoređene na pravilan način što je rezultiralo "ortogonalnim" šupljim mrežnim strukturama (Pomoćne informacije, slika S11). Što je još važnije, nasumično smo izračunali debljinu molekula ljuske i otkrili da su u skladu sa TEM (w2,35 nm) (slika 2D). Ova tendencija formiranja šupljih mrežnih struktura može biti odgovorna za formiranje NP-ova sa strukturom ljuske. Da bi se testirala ova ideja, simulirana je MD struktura kosklopova COS-BA/ Ce6 (slika 2E i prateće informacije, slika S12). Slično kao kod samosklopa COS-BA, veliki broj intramolekularnih i intermolekularnih H-veza je takođe pronađen u kosklopovima (slika 2F i prateće informacije, slika S13). Dodatno, moguće pp slaganje između C]C COS-BA i aromatičnog prstena Ce6 uočeno je u kosklopovima (slika 2G), što je u skladu s podacima iz prethodnih UV istraživanja. Nakon proširenja broja kutija, slične šuplje mrežne strukture se i dalje mogu naći, samo sa smanjenom pravilnošću i ortogonalnošću (Popratne informacije, sl. S14). Ovo može biti mogući razlog za neujednačenu morfologiju COS-BA/Ce6 NP u odnosu na COSBA NP. Štaviše, udaljenost molekularne ljuske-sloj je takođe bliska debljini ljuske (w2,35 nm) NP kao što se vidi korišćenjem TEM (slika 2H). Zajedno, spekulisali smo da bi se formiranje COS-BA/Ce6 NP-ova ili COS-BA NP-ova u velikoj meri moglo pripisati ovoj tendenciji molekula da se sastavljaju u šuplje mrežne strukture ljuske.

Slika 1. Izrada i karakterizacija hitozanskih oligosaharida modificiranih betulinskom kiselinom (COS-BA) prolijekova posredovanih nano-sklopova COS-BA/Ce6 NP. (A) Pojačane ključne pozicije 1 H NMR COS-BA. (B) Priprema ko-sastavljenih COS-BA/Ce6 NP sa različitim omjerima COS-BA/Ce6. (C) Distribucija veličine COS-BA/Ce6 NP koristeći COS-BA i Ce6 (molarni omjer, 8:1) kao gradivne blokove. (D) Rastvorljivost u vodi i Tyndallov efekat kosklopa ukazuju na koloidnu prirodu. (E) SEM i TEM slike slobodnih COS-BA samosklopa i ko-sastavljenih COS-BA/Ce6 NP-ova. (F) Sažetak fizičko-hemijskih svojstava COS-BA/Ce6 NP. (G) FT-IR spektri, (H) UV Vis spektri i (I) emisioni spektri fluorescencije slobodnih Ce6, COS-BA i ko-sastavljenih COS-BA/Ce6 NP u vodi.

Slika 2. Strukture (A) COS-BA samosklopa i (E) ko-sastavljenih COS-BA/Ce6 NP nakon simulacije molekularne dinamike (MD) u trajanju od 5 ns sa molarnim omjerom strukturne jedinice od 8:1 (COS-BA /Ce6, izračunato na osnovu efikasnosti opterećenja Ce6). Model linije je korišten za H2O, a modeli štapića predstavljaju COS-BA ili Ce6 molekule, gdje su C atomi Ce6 označeni ljubičastom bojom. Informacije o vodikovim vezama između molekula COS-BA u (B) njegovim samosklopovima i (F) ko-sklopovima COS-BA/Ce6 NP. (C) Naizgled simetrična struktura molekularnog rasporeda COS-BA nakon MD simulacije. (G) Moguće molekularne interakcije između COS-BA i Ce6 pokazuju potencijalno pp slaganje. Naznačena debljina molekula ljuske u "ortogonalnoj" šupljoj mrežnoj strukturi nakon proširenja odgovarajućih MD kutija (D) slobodnih COSBA samosklopova i (H) COS-BA/Ce6 NP kosklopova.

3.3. Energetski mehanizam poboljšane proizvodnje 1 O2

Zatim smo dalje ispitali stvaranje singletnog kiseonika (1 O2), jedne od kritičnih reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) za performanse PDT koristeći DPBF (1,3-difenilizobenzofuran) kao sondu. Nakon dugotrajnog zračenja rastvora smeše COS-BA/ Ce6 NP sa DPBF-om, UV apsorpcija DPBF-a se smanjila u intenzitetu, što ukazuje na 1 O2 generisanje (slika 3A). Nakon poređenja sa referencom metilen plavog (MB), F ( 1 O2) COS-BA/ Ce6 NP je izračunat kao 0.26, nešto više od slobodnog Ce6 (FZ0.19) (slika 3B). Generalno, energija koju apsorbuju fotosenzibilizatori će proći kroz tri puta relaksacije koji uključuju fluorescenciju, efekat zagrevanja preko vibracijske relaksacije i generisanje ROS kroz međusistemsko ukrštanje (ISC)41. U skladu sa značajno ugašenom emisijom fluorescencije, COS-BA/ Ce6 NP također nisu promovirali nikakav efekat grijanja u vodi (Popratne informacije, slika S15), što je impliciralo poboljšani ISC proces nakon ko-montaže Ce6 sa COS-BA, što je dovelo do na poboljšanu 1 O2 generaciju. Da bismo dalje razjasnili molekularni mehanizam takvog efekta, pokušali smo optimizirati i izračunati mogući jednomolekulski model COS-BA/Ce6 koji se sastoji od potencijalnog pp slaganja dobivenog iz MD simulacije teorijom funkcionalne gustine (DFT) (slika 3C) . Iznenađujuće, COS-BA/Ce6 je pokazao vidljivu crvenilo pomaknutu UV apsorpciju od 581,24 nm od one slobodnog Ce6 (579,30 nm), što ukazuje na pojavu pp slaganja (slika 3D). Iako je energetski minimalizirana geometrija COS-BA/Ce6 pokazala male strukturne razlike s unesenom MD konfiguracijom, još uvijek je bilo vidljivo karakteristično slaganje između C]C ili C]O veza COS-BA sa porfinskim prstenom Ce6, dodatno potvrđujući da iznad p‒p slaganje je moguće. U međuvremenu, nedavno je pokazano da povećana efikasnost doniranja elektrona p‒p slaganjem može olakšati ISC proces42, dok je ISC stopa (KISC) proporcionalna (1/DEST) 2,43. To jest, niži energetski jaz (DEST) fotosenzibilizatora će poboljšati ISC proces promovišući efikasno generisanje ROS. Zatim smo izračunali najniže pobuđeno singletno stanje (S1) i tripletno stanje (T1) Ce6 i COS-BA/Ce6 (slika 3E), respektivno. Rezultati su pokazali da je COS-BA/Ce6 pokazao smanjeni DEST od 1,1892 eV u poređenju sa slobodnim Ce6 (1,2001 eV), potvrđujući poboljšani ISC proces. Smanjenje DEST-a je korisno za proizvodnju 1 O2, što je također potvrđeno u drugim nanofotosenzibilizatorima44. Uzeto zajedno, čini se da p-slaganje smanjuje DEST Ce6 nakon zajedničkog sastavljanja sa COS-BA, što dovodi do poboljšane 1 O2 generacije.

Slika 3. Energetski mehanizam poboljšane proizvodnje 1 O2 izazvanog COS-BA/Ce6 NP. (A) UV Vis spektri fotodekompozicije 1,3-difenilizobenzofurana (DPBF) nakon produženog zračenja COS-BA/Ce6 NP. (B) U dijagramima prvog reda DPBF UV apsorpcijskih promjena (DOD), prinos 1 O2 je procijenjen korištenjem metilen plavog (MB) (FZ 0.52) u DMSO kao referentnog jedinjenja. (C) Energetski minimizirane strukture mogućeg modela COS-BA/Ce6 sa jednom molekulom gledano sa strane i sprijeda, koji je dobiven prema početnoj molekularnoj konfiguraciji između Ce6 i COS-BA nakon MD simulacije i nakon DFT proračuna. (D) Predviđeni prijelazi spektra UV Vis apsorpcije (vertikalne trake) slobodnog Ce6 i optimizirani model COS-BA/Ce6. (E) Izračunati energetski nivoi njihovog najnižeg pobuđenog singletnog stanja (S1) i najnižeg tripletnog stanja (T1), respektivno, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Gdje je DEST izračunat kao ES1 ET1.

3.4. Karakteristike mirovanja kemoterapije

Nakon toga, da bi se potvrdio koncept dizajna u ovoj studiji da bi razvoj amfifilnog COS-BA molekula mogao učinkovito povećati terapeutski učinak BA poboljšanjem preuzimanja stanica kroz povećanje hidrofilnosti, a u međuvremenu dalje konstruiranjem na stimulanse i potpuno hidrofilnog COS-BA/Ce6 NP-ovi su olakšali njegovo mirovanje u normalnim tkivima i aktivaciju na tumorskim mjestima. Da bismo testirali ovu hipotezu, prvo smo istražili ponašanje oslobađanja lijeka COS-BA/Ce6 NP u različitim puferskim otopinama (slika 4A). Rezultati su pokazali da su COS-BA/Ce6 NP pokazali pH-responzivno ponašanje sa kumulativnim oslobađanjem Ce6 od 88% pri pH 5,6 i 57% pri pH 7,4 nakon 24 h, respektivno. Ova karakteristika je vjerovatno nastala zbog razaranja brojnih vodoničnih veza koje su postojale u COS-BA/Ce6 NP nakon uvođenja kiselog Hþ45, što je dovelo do povećanog oslobađanja Ce6 (slika 4B). Ovo je dalje potvrđeno rastavljanjem COS-BA/Ce6 NP-a nakon direktnog inkubiranja u kiseloj sredini (slika 4C). Ova karakteristika koja reaguje na pH može biti korisna za efikasnu antitumornu terapiju zbog slabo kiselog mikrookruženja tumora34. U međuvremenu, COS-BA/Ce6 NP-ovi su imali bolju stabilnost jer se nisu mogle primijetiti značajne promjene veličine ili PDI nakon inkubacije u PBS-u i 1640-RMPI mediju za ćelijsku kulturu tokom 10 dana (pomoćne informacije slika S16), što bi bilo važno za njihovu potencijalnu upotrebu za dalju biomedicinsku primjenu. Zatim su sprovedena dalja istraživanja procjenom citotoksičnosti slobodnog lipofilnog BA (kontaktni ugao q: 133,3 ) i amfifilnog COS-BA (q: 52 ) (slika 4D) pomoću standardnog metil tiazolil-difenil tetrazolium bromida (MTTT) Kao što je predviđeno, bilo za 4T1 ćelije raka ili normalne LO2 hepatocite, pojedinačni COS u suštini nema antikancerogenu aktivnost pri relativno niskim dozama. Ovo može biti zbog antiproliferacijskih efekata COS koji se aktiviraju putem induciranja NF-kB signalnog puta samo pri visokim koncentracijama (približno na nivou miligrama)30. Dok, COS-BA ima značajno povećanu citotoksičnost s ekstremno niskim vrijednostima IC50 (6,03 mg/mL za 4T1 i 9,92 mg/mL za LO2) u poređenju sa onima BA (17,63 mg/mL za 4T1 i 20,53 mg/mL za LO2) čak i pri istim masenim koncentracijama (sl. 4E i J). Dobijeni rezultati su implicirali da modifikacija COS rastvorljivog u vodi uveliko povećava efikasnost ćelijske apsorpcije lipofilnog BA, što dovodi do snažnog antikancerogenog delovanja COS-BA. Da bi se kvantifikovala efikasnost apsorpcije, akumulacija BA ili COS-BA unutar 4T1 ćelija direktno je određena HPLC-om (Pomoćne informacije, slika S17). Rezultati jasno potvrđuju da amfifilni COS-BA pokazuje značajno veći unos od slobodnog BA (otprilike 36-puta nakon 3 h inkubacije), što pokazuje povećanu hemoterapeutsku aktivnost COS-BA. Gornji zaključak je dodatno potkrijepljen značajno poboljšanom citotoksičnošću amfifilne COSBA protiv ćelija raka HepG2 i MCF-7 (Pomoćne informacije, slika S18), koje su dobro u skladu sa konceptom dizajna. Nakon ko-sastavljanja sa Ce6, otkrili smo da COS-BA/Ce6 NP bez zračenja pokazuju značajno inhibiranu citotoksičnost protiv 4T1 ćelija raka u poređenju sa ekvivalentnim COS-BA, posebno pri 11,5 mg/mL, ali osnovna aktivnost PDT nije bila pogođena ( Slika 4F). Da bismo potpunije potvrdili ovaj fenomen, dodatno smo istražili in vitro citotoksičnost COS-BA/Ce6 NP-a na druge ćelije raka, uključujući MCF-7 i HepG2. Zanimljivo je da je amfifilni COS-BA pokazao veoma jaču citotoksičnost protiv MCF-7 ćelija (slika 4G), ali se hemoterapeutska aktivnost značajno smanjila nakon ko-sastavljanja sa Ce6, tj. neozračenim COS-BA/Ce6 NP. Slični rezultati su takođe primećeni u HepG2 ćelijama samo uz blagi pad (slika 4H). Da bismo dodatno potkrijepili gornje zaključke, također smo procijenili hemoterapeutske efekte nano-sklopova i COS-BA protiv normalnih ćelija L929 fibroblasta miša i ljudskih LO2 hepatocita (slika 4I). Rezultati su pokazali da sastavljeni COS-BA/Ce6 NP značajno smanjuju originalni visokotoksični amfifilni lijek COS-BA, pokazujući odličnu biokompatibilnost. Analizom citotoksičnosti, IC50 vrijednosti amfifilnog COS-BA bile su značajno niže od onih ko-sastavljenih COS-BA/Ce6 NP bez obzira na rak ili normalne ćelije (slika 4J). Odnosno, izgradnja potpuno hidrofilnih i nano kosklopova koji reaguju na stimuluse može unaprijed učinkovito potisnuti visoku citotoksičnost amfifilnog lijeka COS-BA. Uzimajući u obzir karakterističnu karakteristiku koja reagira na pH, čini se da će COS-BA/Ce6 NP biti neaktivni u normalnim tkivima sa željenom niskom toksičnošću kemoterapije, ali aktivni u tumorskim tkivima zbog njihovog stimulirajućeg oslobađanja visoko toksičnog COS-BA u slabo kiselom tumoru. mikrookruženje. Uzeti zajedno, za razliku od općeprijavljene neofunkcionalizacije kemoterapijskih reagensa koji imaju pojačanu aktivnost protiv raka22,23, amfifilni nano-sklopovi posredovani COS-BA ne samo da pokazuju pametnu karakteristiku "uspavanja" s podmuklim efektima kemoterapije, već također zadržavaju specijaliziranu aktivnost PDT-a, pokazujući ogroman potencijal. za pametnu antitumorsku terapiju.

Slika 4 (A) Profili oslobađanja Ce6 in vitro iz COS-BA/Ce6 NP u PBS-u (pH 7,4, 6,5 ili 5,6) koji sadrži Tween 80 (0,5%, v/v) na 37 C. (B) Mogući mehanizam koji reagira na pH koji Hþ pokreće rastavljanje NP-ova. (C) Rastavljanje COS-BA/Ce6 NP nakon direktne inkubacije u vodi približno pH 4.0. (D) Kontaktni ugao slobodnih BA, Ce6, COS-BA i COS-BA/Ce6 NP, respektivno. (E) Ćelijska citotoksičnost slobodnog BA, COS i amfifilnog COS-BA protiv reprezentativnih ćelija raka 4T1 i normalnih LO2 ćelija. Vijabilnost ćelija (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 ćelija raka nakon inkubacije sa slobodnim COS-BA, COS-BA/Ce6 NP sa/bez zračenja pri naznačenoj ekvivalentnoj koncentraciji COS-BA za 24 h. (I) Ćelijska citotoksičnost slobodnih COS-BA, neozračenih COS-BA/Ce6 NP protiv normalnih LO2 i L929 ćelija. (J) IC5{47}} analiza COS-BA protiv raka i normalnih ćelija. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost SD (n Z 6). *P ˂ 0.05, **P ˂ 0,01 i ***P ˂ 0,001 pokazuju značajne razlike.

Da bi se istražili mogući razlozi koji stoje iza ove karakteristike mirovanja kemoterapije, vremenski ovisno o ćelijskom preuzimanju COS-BA/Ce6 NP-ova procijenjeno je sukcesivno inkubacijom sa 4T1 ćelijama raka. Rezultati su pokazali da, iako su COS-BA/Ce6 NP pokazali značajno gašenje fluorescencije, oni su i dalje pokazali poboljšanu fagocitnu efikasnost u poređenju sa slobodnim Ce6 zbog jače citoplazmatske crvene fluorescencije, kao što je utvrđeno kvantitativnom analizom protočne citometrije (Slika 5A). Ova poboljšana ćelijska internalizacija NP-a može se pripisati endocitozi21. Uzeti zajedno, spekulisali smo da, iako su visokotopivi ko-sklopovi COS-BA/Ce6 NP-a (kontaktni ugao q: 36,7 ) pokazuju poboljšanu ćelijsku endocitozu od lipofilnog Ce6 (q: 132,6, blizu BA), smanjenu efikasnost fagocitoze NP-ovi se mogu pojaviti u poređenju sa amfifilnim COS-BA molekulom, čime se čini da potisnu hemoterapeutsku citotoksičnost COS-BA/Ce6 NP-a. Odnosno, efikasnost apsorpcije ćelije od visoke do niske kao takva sekvenca: amfifilni COS-BA, hidrofilni COS-BA/Ce6 NP, lipofilni BA ili Ce6. Što je još važnije, neadekvatno rastavljanje ćelijskih NP-a može biti još jedan važan razlog za oslabljen hemoterapeutski učinak, a sve to može biti povezano sa pametnim mirovanjem kemoterapije COS-BA/Ce6 NP-a. Osim toga, budući da je rastavljanje NP-a specifično provedeno u kiseloj sredini tumorskih ćelija, da bismo demonstrirali svojstvo osjetljivosti na pH, pokušali smo dalje uporediti efekte preuzimanja COS-BA/Ce6 NP u normalnim LO2 stanicama (slika 5B) . Međutim, COS-BA/Ce6 NP nisu pokazivali značajno inhibiranu Ce6 crvenu fluorescenciju u LO2 ćelijama. Suprotno tome, ponašanje LO2 u preuzimanju bilo je slično onom kod ćelija raka 4T1, što sugerira da se COS-BA/Ce6 NP također mogu rastaviti čak iu normalnim stanicama, što može biti rezultat slabo kiselog pH unutarćelijskih odjeljaka (endosomi/lizozomi) koji postoje unutar i raka i normalnih ćelija46. Budući da ćelijski unos NP-a ovisi o procesu endocitoze, direktna inkubacija lijeka možda neće naglasiti pH-odgovor COS-BA/Ce6 NP-a na ćelijskom nivou. Ipak, tumorsko mikrookruženje (TME) je visoko kiselo u poređenju sa normalnim tkivima47. Bez obzira na intracelularni karcinom ili TME, COS-BA/ Ce6 NP-ovi mogu reagirati na pH i rastaviti se kako bi pokrenuli oslobađanje visoko toksičnog COS-BA. Dok se u normalnim tkivima COS-BA/Ce6 NP-ovi mogu rastaviti tek nakon ulaska u normalno ćelijsko okruženje, smanjujući vjerovatnoću oslobađanja COSBA. Prema tome, zaključujemo da je karakteristika mirovanja kemoterapije karakteristična za COS-BA/Ce6 NP na tumorsko mikrookruženje valjana i pouzdana, a ideja dizajna u ovoj studiji je izvodljiva.

3.5. In vitro kemoterapija/PDT antikancerogena efikasnost COS-BA/ Ce6 NP

Osim toga, prije detaljne in vitro kemoterapije/PDT antikancerogene učinkovitosti COS-BA/Ce6 NP-a i da bismo dalje otkrili mehanizam endocitoze, proučavamo četiri glavna puta endocitoze dodavanjem odgovarajućih endocitnih inhibitora uključujući hlorpromazin (posreduje klatrinom), hlorokin (hlorokin). inhibitor acidifikacije lizosoma), nistatin (posreduje kaveolama) i inhibitor makropinocitoze EIPA (etilizopropil amilorid) (sl. 5C i D). Primećujemo da bi uvođenje nistatina i hlorpromazina moglo efikasnije da inhibira fagocitnu efikasnost od EIPA i hlorokin fosfata, pokazujući značajno smanjenu ćelijsku fluorescenciju u poređenju sa normalnim 37 C. Ovi rezultati ukazuju da su COS-BA/Ce6 NP internalizovani preko više mehanizama, uglavnom putevi endocitoze posredovani klatrinom i kaveolama. Pošto je povećana generacija 1 O2 putem intermolekularnih interakcija, COS-BA/Ce6 NP pokazuju značajno povećani međućelijski prinos ROS od onog kod Ce6, što pokazuje jača zelena fluorescencija DCFH sonde (slika 5E), što implicira veću fotodinamičku efikasnost. MTT testovi pokazuju da COS-BA/Ce6 NP pod zračenjem imaju značajno pojačan inhibicijski efekat na 4T1 ćelije nego kod ekvivalentnog Ce6, dok sa relativno umerenom citotoksičnošću bez zračenja (slika 5F). Značajno je da je IC50 Ce6 ​​(0,53 mg/mL) u COS-BA/Ce6 NP bio mnogo niži od slobodnog Ce6 (1,39 mg/mL) (slika 5G), što ukazuje na značajno poboljšanu efikasnost PDT-a, koja je bila dalje savršeno demonstrirano citotoksičnošću COSBA/Ce6 NP protiv humanih ćelija raka MCF-7 i HepG2 (Popratne informacije, slika S19). Isto tako, u poređenju sa slobodnim Ce6, relativno niže vrijednosti IC25, IC50 i IC75 također su uočene u kosklopovima (slika 5G). U međuvremenu, u poređenju sa samo Ce6 PDT i jednom kemoterapijom NP-ova u mraku, COS-BA/Ce6 NP-ovi pod zračenjem su postigli efikasniju kombinovanu kemoterapiju/PDT protiv gornje tri ćelije raka, pokazujući sinergizam (indeks kombinacije: CI ˂ 1) ( Slika 5I). Osim toga, dvostruko bojenje fluorescencije žive/mrtve ćelije korištenjem kalcein-acetoksimetil estera (kalcein-AM) i propidijum jodida (PI) dodatno je potvrdilo da COS-BA/Ce6 NP mogu efikasno inducirati ćelijsku apoptozu i nekrozu, jer su tretirane ćelije bile gotovo obojene. sa crvenim PI fluorescentnim signalom kada se uzgaja dodatnih 10 h nakon ozračivanja (slika 5H). U međuvremenu, neozračeni COS-BA/Ce6 NP (veća doza Ce6: 3,2 mg/mL) takođe su imali određenu hemoterapeutsku aktivnost što se vidi istovremeno po AM i PI signalima. Ova značajno poboljšana PDT aktivnost COS-BA/Ce6 NP je dodatno potvrđena AM/PI bojenjem nakon tretmana u trajanju od dodatnih 20 h (Popratne informacije, slika S20). Štaviše, kada se 4T1 ćelijama tretiranim sa COS-BA/Ce6 NPs-PDT-tretiranim COS-BA/Ce6 NPs-PDT ćelijama, očito povećana vitalnost ćelija (DM), posebno specijalnog gasitelja 1 O2 i $OH48, očito povećana vitalnost ćelije implicira da Fotoreakcije tipa I ($OH) i tipa II (1 O2) dogodile su se istovremeno u PDT procesu posredovanom COSBA/Ce6 NPs (slika 5J). Nadalje, COS-BA/Ce6 NP posebno posjeduju bolju kompatibilnost s krvlju na što ukazuje zanemarljiva hemoliza crvenih krvnih zrnaca (slika 5K), što sugerira potencijal za biomedicinsku primjenu putem intravenske primjene.

3.6. In vivo biodistribucija COS-BA/Ce6 NP

Nakon toga, prije in vivo ispitivanja distribucije, procijenili smo farmakokinetiku COS-BA/Ce6 NP praćenjem koncentracije Ce6 u krvi nakon intravenske injekcije s ekvivalentnim Ce6 ili COS-BA/Ce6 NP-ovima. Profili koncentracije i vremena Ce6 u krvi (Slika 6A) i uporedni farmakokinetički parametri (Tabela s pratećim informacijama S1) jasno potvrđuju da COS-BA/Ce6 NP imaju produženu cirkulaciju u krvotoku, što može omogućiti veću akumulaciju na tumoru web stranice. Konkretno, COS-BA/Ce6 NP su pokazali brzu eliminaciju krvi u roku od 2 h, što implicira povoljnu biorazgradljivost. U skladu s tim, istražili smo in vivo biodistribuciju i sposobnost akumulacije tumora COS-BA/Ce6 NP (sl. 6B i C). Slično univerzalno prijavljenim Ce6 nanokompozitima33, COS-BA/Ce6 NP se mogu brzo distribuirati po cijelom tijelu. Naročito tokom prva 4 h, sklopovi su pokazali očito jaču emisiju fluorescencije na mjestima tumora od slobodnog Ce6, što ukazuje na poboljšanu retenciju i sposobnost akumulacije ciljane na tumor COS-BA/Ce6 NP, što se vjerovatno pripisuje efektu pasivne povećane retencije permeabilnosti (EPR). koje pružaju nanočestice14. Nakon 6 h nakon injekcije, intenzitet fluorescencije na mjestima tumora postepeno se brzo smanjivao. Primjetno, za razliku od uobičajeno prijavljenih nanokompozita sa značajno povećanom akumulacijom tumora u poređenju sa slobodnim pozitivnim lijekom29, COS-BA/Ce6 NP nisu pokazali vrlo izraženu akumulaciju na mjestima tumora 24 sata nakon injekcije nego slobodni Ce6 (slika 6C), koji je bio dodatno potkrijepljeno snimanjem izrezanog tumora (sl. 6D i E). Odlična biorazgradivost NP-a može biti odgovorna za uvođenje prirodnih malih organskih molekula. Ovo je uočeno i kod drugih terpenoidnih nano-sklopova posredovanih malim molekulima49. Osim toga, COS-BA/Ce6 NP su također pokazali sličnu distribuciju tkiva kao slobodni Ce6 (slika 6E), a prosječni intenzitet fluorescencije ex vivo bio je generalno niži od onog predstavljenog in vivo, što dalje ukazuje na dobru biorazgradljivost. Uz to, uzimajući u obzir blisku razliku u nivou fluorescencije između 2 i 4 h nakon injekcije NP-a i Ce6, kao i eksperimentalnu operabilnost koja omogućava dovoljne intervale za zračenje, 4 h nakon primjene odabrano je kao svjetlosna vremenska tačka za naknadnu PDT terapiju.

Uzimajući u obzir ne baš izraženu akumulaciju tumora za 24 sata od slobodnog Ce6, da bismo dodatno potvrdili povećani efekat EPR koji COS-BA/Ce6 NP imaju, odmah smo pratili ex vivo fluorescentne slike tumora u različito vrijeme nakon intravenozne injekcije nanolijekova ( sl. 6F i G). Zanimljivo, bilo 20 minuta ili 12 h nakon injekcije, COS-BA/Ce6 NP su zaista pokazale jaču emisiju fluorescencije na tumorskim mjestima od slobodnog Ce6, pokazujući odličnu i poboljšanu sposobnost akumulacije tumora. U međuvremenu, kako je vrijeme prolazilo, intenziteti fluorescencije zadržani u tumorskom tkivu postepeno su slabili (slika 6G), što je u potpunosti u skladu s rezultatima in vivo fluorescentnog snimanja životinja. Jasno je da su ovaj brzi biološki metabolizam i pojačana akumulacija tumora izbjegli potencijalnu dugotrajnu akumulaciju toksičnosti, garantirajući visoko efikasnu antitumornu terapiju s boljom biosigurnošću.

Slika 5 In vitro antikancerogena efikasnost COS-BA/Ce6 NP. Ćelijska internalizacija (A) 4T1 ćelija raka i (B) LO2 normalnih ćelija inkubiranih u slobodnim Ce6 ili COS-BA/Ce6 NP tokom 0.5 i 3 h, i odgovarajuća protočna citometrijska analiza intenziteta fluorescencije. (C) Inhibicija apsorpcije specifičnih studija endocitnog puta i (D) odgovarajući intenzitet fluorescencije ćelija meren protočnom citometrijom nakon inkubacije sa COSBA/Ce6 NP sa/bez endocitnih inhibitora uključujući hlorpromazin, hlorokin, nistatin i etilizopropil (EIPA). Razmjerne trake Z 20 mm. (E) Generacija ROS ćelija izazvana slobodnim Ce6 ili COS-BA/Ce6 NP (ekvivalent Ce6: 1,6 mg/mL). Razmjerne trake Z 20 mm. (F) Vijabilnost ćelija 4T1 ćelija nakon različitih tretmana tokom 24 h. (G) IC25, IC50, IC75 analiza slobodnih Ce6 i COS-BA/Ce6 NP protiv 4T1, MCF-7 i HepG2 ćelija, respektivno. (H) Kalcein-AM/propidijum jodid (PI) živo/mrtvo bojenje COS-BA/Ce6 NP (Ce6: 1,6 mg/mL) tretiranih 4T1 ćelija nakon inkubacije od dodatnih 10 h, kao i neozračenih COS- BA/Ce6 NP (Ce6: 3,2 mg/mL). Skala bar Z 50 mm. (I) Kombinacijski indeks (CI) COS-BA/Ce6 NP na 4T1, MCF-7 i HepG2 ćelijama, kao što je određeno izračunom Chou Talalay teoreme. (J) PDT mehanizmi (Tip I i ​​Tip II) inducirani zračenjem COS-BA/Ce6 NP i procijenjeni specifičnim 1 O2 i $OH gasiteljem natrijum azida (SA) i D-manitola (DM), respektivno. (K) Procenat hemolize crvenih krvnih zrnaca nakon inkubacije sa COS-BA/Ce6 NP tokom 4 h. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost SD (n Z 3). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 i ***P ˂ 0,001 pokazuju značajne razlike.

Slika 6 In vivo cirkulacija krvi i biodistribucija COS-BA/Ce6 NP. (A) Ce6 koncentracijsko-vremenski profili u krvi nakon iv injekcija ekvivalentnog Ce6 ili ko-sastavljenih COS-BA/Ce6 NP-ova (n Z 3). (B) Fluorescentne slike cijelog tijela miševa koji nose tumor 4T1 nakon iv injekcija indiciranih lijekova u različitim vremenskim točkama. (C) Prosječni intenzitet fluorescencije dobiven sa tumorskih mjesta u (B). (D) Ex vivo fluorescentne slike tumora i glavnih organa izrezanih od gornjih miševa nakon 24 h, i odgovarajući (E) kvantitativni rezultat intenziteta fluorescencije (n Z 3). (F) Ex vivo fluorescentne slike tumora i glavnih organa u različito vrijeme nakon iv injekcija Ce6 ili COS-BA/Ce6 NP, i (G) odgovarajuća analiza intenziteta fluorescencije tumora. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost SD (n Z 3).

3.7. In vivo kemoterapija/PDT kombinatorni antitumorski tretman 

Motivisana jedinstvenom karakteristikom mirovanja, dobrom biorazgradljivošću i PDT aktivnošću, istražena je in vivo kombinacija kemoterapije/PDT antitumorske terapije. Miševi sa tumorom 4T1 su nasumično podijeljeni u 6 grupa i intravenozno im je ubrizgan ekvivalent Ce6 (3,5 mg/kg tijela) svaka 2 dana za ukupno tri doze. 4 h nakon injekcije, tumorska mjesta miševa u svijetlim grupama su ozračena 15 minuta (slika 7A). U međuvremenu, odgovarajući volumeni tumora ili tjelesne težine bilježeni su svaki drugi dan. Nakon 14 dana tretmana (slika 7B), slobodni Ce6 sa zračenjem i slobodni COS-BA bili su neefikasni u supresiji tumora, vjerovatno zbog ograničene akumulacije lijeka u tumorskom tkivu. Nasuprot tome, nakon zračenja COS-BA/Ce6 NP, uočena je najznačajnija inhibicija tumora, što potvrđuje odličnu efikasnost kombinacije hemoterapije/PDT. Prosječna težina tumora (slika 7D) i odgovarajuće fotografije seciranih tumora (slika 7E) obje su pokazale najbolju antitumornu efikasnost COS-BA/Ce6 NP pod zračenjem, jer su tretirani miševi pokazali najmanju veličinu tumora od onih u drugim grupama. Prosječni omjer inhibicije tumora COS-BA/Ce6 NP tretiranih PDT-om dostigao je 80,3%, veći od onih kod slobodnog Ce6 PDT (42,4%) i slobodnog COS-BA (38,5%). Primjetno, iako su prethodne in vitro studije pokazale da su COS-BA/Ce6 NP bez svjetla pokazali uspavanu funkciju hemoterapeutske aktivnosti, oni i dalje imaju povećanu antitumorsku efikasnost (49,5%) u poređenju sa slobodnim COS-BA (slika 7D). Nagađali smo da dva moguća razloga doprinose ovom rezultatu, jedan je veća akumulacija COS-BA/Ce6 NP-ova u tumoru zbog općeprijavljenog EPR efekta. Drugi faktor je slabo kiselo mikrookruženje tumora koje je stimuliralo oslobađanje visoko toksičnog COS-BA. Zbog veće kritične koncentracije micela (CMC, 187 mg/mL) COS-BA (Popratne informacije, slika S21), mogao bi postojati u stanju monomera u okruženju tumora, čime bi se favorizirala poboljšana kemoterapija neozračenog COS-a. BA/Ce6 NP. Osim toga, da bi se dodatno potvrdila superiorna antikancerogena efikasnost COS-BA/Ce6 NP, izvršeno je bojenje tumora hematoksilinom i eozinom (H&E) (slika 7G).

Slika 7 Studija efikasnosti sa modelom potkožnog 4T1 ksenografta. (A) Šematski prikaz in vivo PDT tretmana. (B) Profili rasta tumora, (C) promjene tjelesne težine i (D) mase izrezanog tumora koje sadrže omjere inhibicije tumora kod miševa koji nose 4T1- nakon različitih tretmana u naznačenim grupama (n Z 5 za svaku grupu). (E) Slike izrezanih tumora reprezentativnih miševa nakon tretmana. (F) Biohemijska analiza seruma nakon tretmana sa COS-BA/Ce6 NP tokom 14 dana. (G) Reprezentativno H&E bojenje ekscidiranih tumorskih sekcija nakon različitih tretmana. Razmjerne trake Z 50 mm. (H) TUNEL bojenje slobodnih Ce6 i COS-BA/Ce6 NPs PDT tretiranih sekcija tumora. Skaliranje Z 20 mm **P < 0,01 ukazuje na značajne razlike.

Rezultati su pokazali da su COS-BA/Ce6 NPs-PDT tretirani preseci tumora pokazali ozbiljno propadanje tkiva i nedostatak jezgara, dok je u drugim grupama uočena umjerena nekroza tkiva. Istovremeno, u poređenju sa slobodnim Ce6 svjetlom, COS-BA/Ce6 NP-ovi pod zračenjem značajno su povećali broj TUNEL-pozitivnih ćelija koje pokazuju jače smeđe nuklearno bojenje (slika 7H), dodatno potvrđujući odličnu kombinaciju kemoterapije/PDT terapije. Štaviše, nisu uočene očigledne varijacije telesne težine u svim grupama (slika 7C). Čak i ako su COSBA/Ce6 NP ili Ce6 lake grupe imale skroman gubitak tjelesne težine tokom primjene, tjelesne težine su se vratile na normalu nakon nekoliko dana. Nije bilo evidentnog oštećenja ili upalnih lezija u glavnim organima uzetim na kraju tretmana (Popratne informacije, slika S22), što ukazuje na nisku/nema sistemske toksičnosti i dobru biosigurnost COS-BA/Ce6 NP. Nadalje, iako se COS-BA/Ce6 NP-ovi uglavnom akumuliraju u tkivu jetre, odgovarajući markeri funkcije jetre (ALT, AST i ALP) nisu pokazali značajne promjene u poređenju sa normalnim zdravim miševima (slika 7F), što ukazuje na bolju biokompatibilnost. Osim toga, činilo se da su markeri bubrežne funkcije (BUN, CRE i UA) i biohemijski parametri (ALB i TBIL) slični normalnim miševima, što dalje ukazuje na bolju biosigurnost. Jasno je da ovaj organski mali molekul prolijeka COS-BA-posredovani ko-sklopovi COS-BA/Ce6 NP posjeduju višestruka povoljna terapeutska svojstva koja otvaraju atraktivne mogućnosti za primjenu u kliničkoj medicini.

3.8. Antitumorska imunost kombinovane kemoterapije/PDT i blokade anti-PD-L1

Nedavno su brojne inovativne studije pokazale da bi kombinacija imunoterapije raka s drugim modalitetima liječenja mogla djelotvorno potaknuti tumor-specifične imunološke odgovore na eliminaciju primarnih ili udaljenih tumora1. Potaknuti jedinstvenom funkcijom mirovanja kemoterapije i odličnom kemoterapijskom/PDT antitumorskom djelotvornošću COS-BA/Ce6 NP-a, stoga se pitamo može li to također pokrenuti imunološki odgovor uz pomoć imunološkog adjuvansa anti-PD-L1 da izazove visoko efikasnu antitumorsku terapiju . Može li liječiti udaljene tumore koji se ne mogu liječiti direktno korištenjem PDT tretmana, pružajući tako alternativnu strategiju za kliničke primjene protiv raka? Da bi se testirala ova hipoteza, u ovoj studiji je uspostavljen model "dva tumora" i detaljne eksperimentalne procedure su prikazane na slici 8A. Tipično, dva 4T1 tumora su inokulirana na lijevom i desnom boku svakog miša. S obzirom da sam anti-PD-L1 nema upadljiv imunoterapijski učinak50, eksperimenti su podijeljeni u 5 grupa uključujući neliječenu grupu, COS-BA/Ce6 NP, COS-BA/Ce6 NP sa anti-PD-L1, COS- BA/Ce6 NP sa svjetlom, COS-BA/Ce6 NP sa svjetlom i anti-PD-L1. Nakon jedne iv injekcije NP-a (Ce6: 3,5 mg/kg), desni tumori (primarni tumor) u svijetlim grupama su zračeni 15 minuta kako bi se procijenili imunološki efekti PDT/kemoterapije, dok su tumori lijeve strane (udaljeni tumori) u svim grupama bez ikakvog tretmana odabrani su za individualnu kemoterapiju. Nakon toga, 2., 4. i 6. dana, miševima u imunološkim grupama je iv ubrizgano anti-PD-L1 antitijelo (15 mg po mišu po injekciji) za ukupno tri doze. Značajno, bez obzira na PDT tretman ili ne, COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 mogu efikasno inhibirati progresiju primarnog tumora (slika 8B). I odgovarajući prosječni omjer inhibicije tumora odvojeno je dostigao 86,7% (zračenje) i 76,5% (bez zračenja), daleko više od individualne kemoterapije (5,7%) ili kemoterapije/PDT (27,4%) tretmana (slika 8C) . Fotografije seciranih tumora (Slika 8D) i 4T1-koje nose miševe (Podaci za podršku, Slika S23) nakon 14 dana tretmana također su vizuelno podržale gornji zaključak. Ovi rezultati sugeriraju da i kemoterapija zasnovana na NP i hemoterapija/PDT mogu efikasno aktivirati antitumorski imunitet. U međuvremenu, što je najupečatljivije, blokada anti-PD-L1 plus NP-ovi također su ponudili izvanredan učinak inhibicije tumora na neozračene udaljene (lijeve) tumore (slike 8E i F), općenito jači od samih COS-BA/Ce6 NP-ova, koji su takođe potvrđeno odgovarajućim seciranim tumorima i slikama miševa nakon tretmana (sl. 8D i slika S23), dodatno demonstrirajući efikasan antitumorski imuni odgovor izazvan COS-BA/Ce6 NP.

Da bi se u potpunosti istražio ovaj efikasan antitumorski imunološki odgovor, CD8þ citotoksični T limfociti (CTL), kritični imunocit za imunoterapiju raka4, dalje su procijenjeni analizom imunoloških ćelija u desnom ili lijevom tumoru nakon 14 dana liječenja. Utvrđeno je da COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 sa ili bez PDT tretmana izazivaju robusnu CD8þ CTL infiltraciju u primarnim tumorima (sl. 8H i J). CD8þ CTL infiltracija je bila do 11,3% nakon kemoterapije zasnovane na COS-BA/Ce6 NPs/PDT plus anti-PD-L1 tretmana, nešto više od COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 (9,63%), i mnogo veći nego u drugim grupama bez anti-PD-L1, uključujući tretman hemoterapijom zasnovanom na COS-BA/ Ce6 NPs (5,12%) ili samo hemoterapijom/PDT (4,07%). Slično, u poređenju sa neimunim grupama, značajno povećana CTL infiltracija je takođe uočena u levim (udaljenim) tumorima kod miševa nakon COS-BA/Ce6 NP plus antiPD-L1 sa ili bez PDT tretmana (sl. 8I i K), dalje što podrazumijeva visoko efikasne imunološke odgovore inducirane kemoterapijom ili kombinacijom kemoterapije/PDT terapije. U međuvremenu, nakon uvođenja anti-PD-L1, i kemoterapija na bazi COS-BA/Ce6- i kemoterapija/PDT dovele su do snažne proizvodnje višestrukih citokina koji igraju ključnu ulogu u regulaciji citotoksičnih funkcija CTL8, uključujući tumor faktor nekroze-alfa (TNF-a) (slika 8L) i interferon-gama (IFN-g) (slika 8M) u uzorcima seruma miševa nakon 14 dana tretmana, što dalje potvrđuje da je postojao efikasan antitumorski imuni odgovor. Osim toga, nisu uočene nikakve očigledne promjene u tjelesnoj težini u različitim terapijskim grupama (slika 8N), što ukazuje na povoljnu biosigurnost ove kombinovane hemoterapije/PDT/imunoterapije. Uzeti zajedno, otkrili smo da iako anti-PD-L1 plus COSBA/Ce6 NP sa svjetlom pokazuju nešto veći omjer inhibicije tumora (86,7%) od neozračene grupe (76,5%) protiv pravih tumora zbog uticaja PDT (Slika 8B‒D), nisu uočene značajne razlike u terapijskim efektima na tumore lijeve strane u prisustvu (77,8%) ili odsustvu (78,4%) PDT (Slika 8E‒G). Pretpostavljamo da sljedeći mogući razlozi dovode do ovog fenomena. Prvo, za mehanizam kemoterapije ili PDT-a koji pojačava imunološke efekte blokade anti-PD-L1 kontrolne tačke, akumulirane studije su pokazale da ovi modaliteti liječenja mogu pokrenuti akutnu upalu u području tumora, čime se povećava prezentacija antigena povezanih s tumorom na T. ćelije, čime se ćelije raka podvrgavaju ICD8,9. Tumorske ćelije koje su podvrgnute ICD bi pojačale regulaciju signala "pojedi me" izlaganjem kalretikulina (CRT) na površinama imunogeno umirućih tumorskih ćelija i signalima "opasnosti" oslobađanjem kutije 1 grupe visoke pokretljivosti (HMGB1), promovišući aktivaciju dendritskih ćelija da aktiviraju CTL, čija aktivnost može biti pojačana anti-PD-L1, što rezultira značajno poboljšanom imunoterapijom protiv raka51.

Slika 8 Antitumorski efekat hemoterapije/PDT zasnovane na COS-BA/Ce6 NPs plus blokada kontrolne tačke anti-PD-L1 imunoterapije. (A) Šematska ilustracija hemoterapije/PDT zasnovane na CNPs sa anti-PD-L1 terapijom. (BeD) (B) Profili rasta tumora, (C) prosječne težine tumora i (D) slike izrezanih tumora reprezentativnih miševa za primarne (desne) tumore nakon različitih tretmana tokom 14 dana kako je indicirano. (EeG) (E) Krivulje rasta tumora, (F) prosječne težine tumora i (G) slike ekscidiranih tumora za neozračene udaljene (lijeve) tumore nakon različitih tretmana prema indikacijama. (H) Populacije CD8þ T ćelija u desnim tumorima i (J) procenti CTL infiltracije su kvantitativno detektovani protočnom citometrijom nakon 14 dana tretmana. (I, K) Populacije CD8þ T ćelija u levim tumorima 14. dana su kvantitativno detektovane protočnom citometrijom (n Z 3). Sekrecija citokina u serumima nakon 14 dana tretmana uključujući (L) IFN-g i (M) TNF-a mjereno ELISA testom (n Z 3). (N) Promjene tjelesne težine miševa tokom različitih tretmana. *P < 0.05, **P < 0.01 i ***P < 0,001 pokazuju značajne razlike.

Drugo, u ovom radu, COS-BA/Ce6 NP-ovi bi mogli biti raspoređeni na lijevi i desni tumor istovremeno, i lijeva kemoterapija i desna kemoterapija/PDT imaju ogroman potencijal da induciraju tumorske ćelije koje prolaze kroz ICD. U međuvremenu, COS-BA/Ce6 NP se daju samo u jednoj dozi, imunoterapija uglavnom zavisi od tri doze anti-PD-L1, bilo da se radi o hemoterapiji ili hemoterapiji/PDT, oni su samo početnici. Terapijske razlike u izazivanju ICD ćelija tumora između individualne kemoterapije i kombinovane hemoterapije/PDT tretmana možda neće biti jako izražene. Procenat CD8þ CTL-ova na lijevoj (sl. 8I i K) i desnim tumorima (sl. 8H i J) također podržava gornju spekulaciju, nije uočena značajna razlika u CD8þ CTL-ovima u prisustvu ili odsustvu PDT-a. Stoga su COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 sa ili bez zračenja postigli sličnu antikancerogenu efikasnost protiv tumora lijeve strane. Nadalje, budući da ćelije 4T1 eksprimiraju niske razine PD-L152, široko je dokazano da sam anti-PD-L1 ima bilo kakav upadljiv imunoterapijski učinak na 4T1 karcinom dojke53,54. Uprkos tome što ICD efekti posredovani COS-BA/Ce6 NP zahtijevaju daljnje istraživanje, predstavljeni rezultati su pokazali da COS-BA/Ce6 NP postižu značajno pojačane imunološke odgovore uz pomoć anti-PD-L1. Zajedno, čini se da su COS-BA/Ce6 NP-ovi zaista potencirali imunoterapiju raka anti-PD-L1, a ne samo kombinovanu terapiju. Iako anti-PD-L1 plus COS-BA/Ce6 NP sa ili bez PDT tretmana nisu pokazali značajne razlike u terapijskim efektima, oba su pokazala očigledno povećanu antitumorsku efikasnost u poređenju sa jednom dozom COS-BA/Ce6 NP. Odnosno, čak i bez tretmana svjetlom, nakon što je uveden imunološki adjuvans antiPD-L1, imunogenost ostataka tumora nakon kemoterapije COS-BA/Ce6 NPs može se pojačati, što rezultira izvanrednim sistemskim antitumorskim imunološkim odgovorima, što dovodi do učinkovite supresije. primarnih ili udaljenih tumora. Stoga bi trebalo biti moguće eliminirati primarne i metastatske tumore tokom kliničke antikancerogene imunoterapije ponovljenim tretmanima NP. Jasno je da ovi rezultati zajedno pružaju dokaze o visoko efikasnim i sinergističkim antitumorskim imunološkim odgovorima izazvanim COS-BA/Ce6 NP u kombinaciji sa anti-PD-L1 blokadom, bilo sa samo hemoterapijom ili u kombinaciji sa hemoterapijom/PDT.

cistanche tubulosa-poboljšava imuni sistem

4. Zaključak

Ukratko, namjerno smo dizajnirali, sintetizirali i razvili biokompatibilni, biorazgradivi, nisko toksični, ali visoko učinkoviti i klinički dostupni transformirani foto-kemoterapeutski nano-predlijek COS-BA/Ce6 NP kombiniranjem tri multifunkcionalne komponente samosastavljene prirodne male molekule betulinske kiseline (BA), COS rastvorljiv u vodi i niskotoksični fotosenzibilizator Ce6 za kombinovanu hemoterapiju/PDT. Nakon toga pokreće visoko učinkovite i sinergističke antitumorske imune odgovore u kombinaciji s blokadom anti-PD-L1, bilo sa samo kemoterapijom ili u kombinaciji s kemoterapijom/PDT. Konkretno, pokazujemo da molekularni raspored šuplje mreže može olakšati formiranje nanočestica strukturiranih u ljusci. Modifikacije COS-a rastvorljivog u vodi mogle bi uvelike povećati antikancerogenu aktivnost lipofilnih prirodnih malih molekula konstruiranjem amfifilnog prolijeka. Također pokazujemo da su rezultirajući nanolijekovi pokazali višestruka povoljna terapeutska svojstva, posebno pametnu funkciju "uspavanja" s podmuklim efektima kemoterapije. U kombinaciji sa karakterističnom reakcijom na pH, ovi kosklopovi imaju nisku toksičnost i biološku sigurnost s normalnim tkivom, ali su visoko toksični za tumorska tkiva. Zajedno sa poboljšanom generacijom 1 O2, dobrom biorazgradljivošću i biokompatibilnošću, sve je to doprinijelo visoko efikasnoj, sinergističkoj i sigurnoj kemoterapiji protiv raka/PDT/imunoterapiji. Posebno, individualna kemoterapija bez PDT tretmana može aktivirati sistemske antitumorske imune odgovore, otvarajući atraktivne mogućnosti za klinički sinergističku imunoterapiju kemoterapije protiv raka. Sve u svemu, ovaj rad pruža obećavajući uvid za razvoj prirodnih multifunkcionalnih visoko bioaktivnih i niskotoksičnih nano-imunostimulansa za kliničku imunoterapiju.

Reference

1. Sang W, Zhang Z, Dai YL, Chen XY. Nedavni napredak u sinergističkoj kombinovanoj imunoterapiji raka zasnovanoj na nanomaterijalima. Chem Soc Rev 2019;48:3771e810.

2. Li XY, Guo XM, Ling JB, Tang Z, Huang GN, He LZ, et al. Imunoterapija raka zasnovana na nanomedicini razvijena reprogramiranjem makrofaga povezanih s tumorom. Nanoscale 2021;13:4705e27.

3. Chao Y, Xu LG, Liang C, Feng LZ, Xu J, Dong ZL, et al. Kombinirana lokalna imunostimulirajuća radioizotopna terapija i sistemska blokada imunoloških kontrolnih tačaka daju snažne antitumorske odgovore. Nat Biomed Eng 2018;2:611e21.

4. Wen YY, Chen X, Zhu XF, Gong YC, Yuan GL, Qin XY, et al. Integrisane nanočestice fototermalne kemoterapije sa odgovorom mikrookruženja tumora poboljšale su indukciju imunogene ćelijske smrti za efikasan tretman kolorektalnog karcinoma. ACS Appl Mater interfejsi 2019;11:43393e408.

5. Peng JR, Xiao Y, Yang Q, Liu QY, Chen Y, Shi K, et al. Intracelularna agregacija peptidima reprogramiranih nanosklopova malih molekula poboljšava kemoterapiju raka i kombinatornu imunoterapiju. Acta Pharm Sin B 2021;11:1069e82.

6. Song W, Kuang J, Li CX, Zhang MK, Zheng DW, Zeng X, et al. Poboljšana imunoterapija zasnovana na fotodinamičkoj terapiji za eradikaciju tumora primarne i metastaze pluća. ACS Nano 2018;12: 1978e89.

7. Wang C, Xu LG, Liang C, Xiang J, Peng R, Liu Z. Imunološki odgovori izazvani fototermalnom terapijom ugljičnim nanocjevčicama u kombinaciji sa anti-CTLA-4 terapijom za inhibiciju metastaza raka. Adv Mater 2014;26:8154e62.

8. He CB, Duan XP, Guo NN, Chan C, Poon C, Weichselbaum RR, et al. Koordinacijski polimeri jezgra i ljuske kombinuju kemoterapiju i fotodinamičku terapiju za potenciranje imunoterapije raka kod blokade kontrolnih tačaka. Nat Commun 2016;7:12499.

9. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Imunogena smrt ćelija kod raka i zaraznih bolesti. Nat Rev Immunol 2017; 17: 97e111.

10. Chiang CS, Lin YJ, Lee R, Lai YH, Cheng HW, Hsieh CH, et al. Kombinacija magnetnih nanočestica na bazi fukoidana i imunomodulatora poboljšava imunoterapiju lokaliziranu tumorom. Nat Nanotechnol 2018;13:746e54.

11. Zheng XL, Ge JC, Wu JS, Liu WM, Guo L, Jia QY, et al. Biorazgradiva nanovezikula derivata hipokretina kao teranostik koji pokreće skoro infracrveno svjetlo za dvostruko fotoaktivno snimanje raka i terapiju. Biomaterials 2018;185:133e41.

12. Spicer CD, Jumeaux C, Gupta B, Stevens MM. Nanočestice peptida i proteina konjugiraju svestrane platforme za biomedicinske primjene. Chem Soc Rev 2018;47:3574e620.

13. Mei YL, Wang RB, Jiang W, Bo Y, Zhang TF, Yu JL, et al. Nedavni napredak u nanomaterijalima za isporuku nukleinske kiseline u imunoterapiji raka. Biomater Sci 2019;7:2640e51.

14. Zheng YL, Ye JX, Li ZY, Chen HJ, Gao Y. Nedavni napredak u sono foto dinamičkoj terapiji raka: od razvijenih novih senzibilizatora do strategija za povećanje efikasnosti zasnovanih na nanotehnologiji. Acta Pharm Sin B 2021;11:2197e219.

15. Li SK, Zou QL, Li YX, Yuan CQ, Xing RR, Yan XH. Pametni supramolekularni fotodinamički metalo-nano lijekovi zasnovani na peptidima dizajnirani višekomponentnim koordinacijskim samosastavljanjem. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.

16. Zhi KK, Wang JC, Zhao HT, Yang X. Gel prirodnog proizvoda malih molekula koji se sam sastavlja za isporuku lijekova: proboj u novoj primjeni prirodnih proizvoda malih molekula. Acta Pharm Sin B 2020; 10: 913e27.

17. Yang X, Ma C, Chen ZM, Liu J, Liu FY, Xie RB, et al. Pojedinačne male molekule sastavljene nanočestice posreduju efikasnoj oralnoj isporuci lijeka. Nano Res 2019;12:2468e76.

18. Zhi KK, Zhao HT, Yang X, Zhang H, Wang JC, Wang J, et al. Gelatori prirodnih proizvoda i opća metoda za njihovo dobivanje iz organizama. Nanoscale 2018;10:3639e43.

19. Cheng JJ, Fu SY, Qin Z, Han Y, Yang X. Samosastavljene prirodne male molekularne diterpenske kiseline sa povoljnom antikancerogenom aktivnošću i biosigurnošću za sinergistički poboljšanu antitumornu hemoterapiju. J Mater Chem B 2021;9:2674e87.

20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. Istraživanje prirodnog aktivnog procesa punjenja lijeka malim molekulama i visoko efikasne sinergističke antitumorske efikasnosti. ACS Appl Mater interfejsi 2020;12:6827e39.

21. Cheng JJ, Zhao HT, Yao L, Li Y, Qi BK, Wang J, et al. Jednostavni i multifunkcionalni prirodni samosastavljeni steroli sa supramolekularnim fotosenzibilizatorima posredovanim antikancerogenom aktivnošću za poboljšanu antitumornu fotodinamičku terapiju. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11: 29498e511.

22. Cheng JJ, Zhao HT, Wang JC, Han Y, Yang X. Bioaktivna prirodna mala molekula podešena komontaža fotosenzitivnih lijekova za visoko efikasnu sinergističku i poboljšanu fotokemoterapiju tipa I. ACS Appl Mater interfejsi 2020;12:43488e500.

23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Nanomedicine-cum-nosač ko-sastavljanjem prirodnih malih proizvoda za sinergijski pojačan antitumor sa zaštitnim djelovanjem tkiva. ACS Appl Mater interfejsi 2020;12:42537e50.

24. Xi JC, Liu HP. Nedavni napredak u dizajnu amfifilnih lijekova i vakcina koji se samostalno isporučuju. Adv Ther 2019;3:1900107.

25. Zhang RS, Qin XF, Kong FD, Chen PW, Pan GJ. Poboljšanje ćelijske apsorpcije terapeutskih entiteta kroz interakciju sa komponentama ćelijske membrane. Drug Deliv 2019;26:328e42.

26. Pujals S, Giralt E. Prolinom bogati, amfipatski penetrirajući peptidi u ćelije. Adv Drug Deliv Rev 2008;60:473e84.

27. Karimi M, Ghasemi A, Sahandi Zangabad P, Rahighi R, Moosavi Basri SM, Mirshekari H, et al. Pametne mikro/nanočestice u sistemima za isporuku lekova/gena koji reaguju na stimulans. Chem Soc Rev 2016; 45: 1457e501.

28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. Triterpenski prolijekovi bez nosača sa odgovorom na glutation i biosigurnošću za sinergistički poboljšanu fotokemoterapiju. ACS Appl Mater interfejsi 2021;13:245e56.

29. Li XS, Lee SY, Yoon J. Supramolekularni fotosenzibilizatori podmlađuju fotodinamičku terapiju. Chem Soc Rev 2018;47:1174e88.

30. Zou P, Yuan SJ, Yang X, Guo YZ, Li LN, Xu CW, et al. Strukturna karakterizacija i antitumorski efekti hitozanskih oligosaharida protiv ortotopskog tumora jetre putem NF-kB signalnog puta. J Funct Foods 2019;57:157e65.

31. Zhai XC, Yuan SJ, Yang X, Zou P, Li NL, Li GY, et al. Hitozanski oligosaharidi indukuju apoptozu u humanom karcinomu bubrega putem stresa endoplazmatskog retikuluma ovisnog o vrsti kisika. J Agric Food Chem 2019; 67:1691e701.

32. Deng G, Ma C, Zhao HT, Zhang SQ, Liu J, Liu FY, et al. Kombinirana terapija protiv edema i antioksidansa za ishemijski moždani udar putem nanočestica betulinske kiseline napunjenih gliburidom. Theranostics 2019; 9: 6991e7002.

33. Liu K, Xing RR, Zou QL, Ma GH, Mo¨hwald H, Yan XH. Jednostavno peptidno podešeno samosastavljanje fotosenzibilizatora prema fotodinamičkoj terapiji protiv raka. Angew Chem Int Ed Engl 2016;55:3036e9.

34. Li Y, Lin JY, Wang PY, Luo Q, Lin HR, Zhang Y, et al. Samociljajući virus koji reaguje na mikrookruženje tumora nanolijek je inspirirao nanolijekom za blisku infracrvenu-II fototermalnu kemoterapiju vođenu slikama. ACS Nano 2019;13:12912e28.

35. Sawada SI, Sato YT, Kawasaki R, Yasuoka JI, Mizuta R, Sasaki Y, et al. Nanogel hibridni sklop za intracelularnu isporuku egzosoma: efekti na endocitozu i fuziju inženjeringom površinskih polimera egzosoma. Biomater Sci 2020;8:619e30.

36. Chou TC. Teorijska osnova, dizajn eksperimenta i kompjuterizovana simulacija sinergizma i antagonizma u studijama kombinacija lijekova. Pharmacol Rev 2006;58:621e81.

37. Zhao YP, Zhao YN, Ma QS, Sun B, Wang QP, Ding Z, et al. Dvostruko funkcionalne nanošipke bez nosača putem samosastavljanja čistih molekula lijeka za sinergističku kemofotodinamičku terapiju. Int J Nanomed 2019;14:8665e83.

38. Ma X, Zhao YL. Biomedicinske primjene supramolekularnih sistema zasnovanih na interakcijama domaćin-gost. Chem Rev 2015;115:7794e839.

39. Qin XH, Zhang MZ, Hu X, Du Q, Zhao ZP, Jiang Y, et al. Nanoinženjering novodizajniranog derivata klorina e6 za pojačanu fotodinamičku terapiju putem regulacije metabolizma laktata. Nanoscale 2021;13:11953e62.

40. Du Q, Qin XH, Zhang MZ, Zhao ZP, Li Q, Ren XM, et al. Nanolijek bez nosača koji može regulisati mitohondrijski metabolizam za pojačavanje osjetljivosti fototermalne terapije. Chem Commun (Camb) 2021;57:8993e6.

41. Li XS, Yu S, Lee D, Kim G, Lee B, Cho Y, et al. Lakši supramolekularni pristup aktivirajućim nanoteranostikama vođenim nukleinskim kiselinama koji prevazilaze nedostatke fotodinamičke terapije. ACS Nano 2018; 12:681e8.

2. Gilson RC, Black KC, Lane DD, Achilefu S. Hibridni TiO2-rutenijum nano-fotosenzibilizator sinergistički proizvodi reaktivne vrste kiseonika iu hipoksičnim i u normoksičnim uslovima. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:10717e20.

43. Xu SD, Yuan YY, Cai XL, Zhang CJ, Hu F, Liang J, et al. Podešavanje singlet-triplet energetskog jaza: jedinstveni pristup efikasnim fotosenzibilizatorima sa karakteristikama emisije izazvane agregacijom (AIE). Chem Sci 2015;6:5824e30.

44. Wu WB, Mao D, Xu SD, Kenry, Hu F, Li XQ, et al. Fotosenzibilizacija pojačana polimerizacijom. Chem 2018;4:1937e51.

45. Kundu PK, Samanta D, Leizrowice R, Margulis B, Zhao H, Bo¨rner M, et al. Svjetlo kontrolirano samosastavljanje nanočestica koje ne reagiraju na foto. Nat Chem 2015;7:646e52.

46. ​​Miyazaki M, Yuba E, Hayashi H, Harada A, Kono K. pH-osjetljivi polimer-modificirani liposomi na bazi hijaluronske kiseline za ćelijske specifične intracelularne sisteme isporuke lijekova. Bioconjug Chem 2018;29:44e55.

47. Zhang JY, Liu ZN, Lian P, Qian J, Li XW, Wang L, et al. Selektivno snimanje i smrt ćelija raka putem bliske infracrvene fluorescencije i fototermalnih efekata koja se može prebaciti na pH. Chem Sci 2016;7:5995e6005.

48. Cheng JJ, Tan GH, Li WT, Zhang HY, Wu XD, Wang ZQ, et al. Jednostavna sinteza fluorescentnih nanočestica uz pomoć hitozana za fotodinamičku terapiju. New J Chem 2016;40:8522e34.

49. Cheng JJ, Wang S, Zhao HT, Liu Y, Yang X. Istraživanje mehanizma samosastavljanja i efikasne sinergističke antitumorske kemofototerapije biorazgradivog fotosenzitivnog nanolijeka posredovanog prolijekom ursolne kiseline koji reaguje na glutation. Biomater Sci 2021;9: 3762e75.

50. Yang Y, Xu J, Sun Y, Mo LT, Liu B, Pan XS, et al. Logička računarska reakcija zasnovana na aptameru na živim ćelijama kako bi se omogućila terapija blokade kontrolnih tačaka imunog sistema bez antitijela. J Am Chem Soc 2021;143:8391e401.

51. Kuai R, Yuan WM, Son SJ, Nam J, Xu Y, Fan YC, et al. Eliminacija ustanovljenih tumora kombiniranom kemoimunoterapijom na bazi nanodiska. Sci Adv 2018;4:eaao1736.

52. Lesniak WG, Chatterjee S, Gabrielson M, Lisok A, Wharram B, Pomper MG, et al. Detekcija PD-L1 u tumorima upotrebom [(64)Cu]atezolizumaba sa PET-om. Bioconjug Chem 2016;27:2103e10.

53. Sagiv-Barfi I, Kohrt HEK, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. Terapijski antitumorski imunitet blokadom kontrolnih tačaka je poboljšan ibrutinibom, inhibitorom i BTK i ITK. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.

54. Liang C, Chao Y, Yi X, Xu J, Feng LZ, Zhao Q, et al. Interna radioizotopna terapija posredovana nanočesticama za lokalno povećanje permeabilnosti vaskularne žile tumora za sinergistički poboljšane terapije raka. Biomaterials 2019;197:368e79.