Kako se inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze Alpelisib koristi za Lowe sindrom/bolest zubaca?

Inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze alpelisib obnavlja organizaciju aktina i poboljšava disfunkciju proksimalnih tubula in vitro i na mišjem modelu Loweovog sindroma i Dentove bolesti

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Marine Berquez^1,5, Jonathan R. Gadsby^2,5, Beatrice Paola Festa^1,5, Richard Butler³ , Stephen P. Jackson², Valeria Berno⁴, Alessandro Luciani1 , Olivier Devuyst^1,6i Jennifer L. Galop^2,6

KLJUČNE REČI: citoskelet; endocitoza; lipidi; proksimalni tubul; bubrežni Fanconijev sindrom

Mutacije gubitka funkcije u OCRL genu, koji kodira fosfatidilinozitol [PI] 4,5-bisfosfat [PI(4,5)P2] 5-fosfatazu OCRL, uzrokuju defektnu endocitozu i disfunkciju proksimalnih tubula inLowe sindrom i Dentova bolest2. Defekt je zbog povećanog nivoa PI(4,5)P2 i aberantne polimerizacije aktina, blokirajući endosomalni promet. PI 3-fosfat [PI(3)P] je nedavno identifikovan kao koaktivator sa PI(4,5)P2 u aktinskom putu. Ovdje smo testirali hipotezu dafosfoinozitid 3-kinaza(PI3K) inhibitori mogu spasiti endocitni defekt nastao gubitkom OCRL, rebalansiranjem fosfoinozitidnih signala u aktin mašineriju. PI3K širokog dometa(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitor copanlisib i klasa IA p110a PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza) inhibitor alpelisibsmanjena aberantna polimerizacija aktina u ljudskim bubrežnim stanicama s nedostatkom OCRL in vitro. Nivoi PI 3,4,5-trisfosfata, PI(4,5) P2 i PI(3)P su svi smanjeni tretmanom alpelisibom, a siRNA srušena katalitička podjedinica PI3K p110a je fenokopirala fenotip aktina. U humaniziranom OcrlY/- modelu miša, alpelisib je smanjio bojenje endosomalnog aktina dok je obnavljao arhitekturu stresnih vlakana i nivoe megalina na plazma membrani ćelija proksimalnih tubula, što se odražava poboljšanim endocitnim unosom proteina niske molekularne težine in vivo. Dakle, naši nalazi podržavaju vezu između fosfoinozitidnih lipida, polimerizacije aktina i prometa endocita u proksimalnom tubulu i predstavljaju dokaz koncepta za prenamjenu alpelisiba uLoweov sindrom/Dentova bolest2.

Translational Statement

Lowe sindrom i Dentova bolest2, uzrokovana mutacijama u fosfoinozitid lipid 5-fosfatazi OCRL, manifestira se disfunkcijom proksimalnih tubula i proteinurijom niske molekularne težine uz samo potpornu njegu. Naši nalazi otkrivaju dafosfoinozitid 3-kinaza inhibitor alpelisib, koji je trenutno odobren za terapiju raka, ublažava aberantnu ravnotežu fosfoinozitida i fenotip aktina povezan s gubitkom OCRL, uzrokujući značajno poboljšanje endocitne mašinerije i apsorpcionog kapaciteta u ćelijskim sistemima i humanizirani mišji model za Loweov sindrom/Dentovu bolest 2. S obzirom na svoj prividni sigurnosni profil, alpelisib je obećavajući kandidat za ponovno korištenje lijekaLowe sindrom i Dentova bolest.

Epitelne ćelije koje oblažu proksimalne tubule (PT) bubrega poseduju efikasan endolizosomski put posredovan receptorima koji se oporavlja i obrađuje esencijalne supstance koje se filtriraju kroz glomerul. Kongenitalni poremećaji koji zahvaćaju endolizozome uzrokuju PT disfunkciju (renalni Fanconijev sindrom) s gubitkom otopljenih tvari u urinu i proteina niske molekularne težine (LMW), često komplicirano metaboličkim komplikacijama i komplikacijama rasta i razvojem kronične bolesti bubrega.¹Inaktivirajuća mutacija u OCRL povezana je sa Dentovom bolešću 2 (MIM #300555), poremećajem koji karakterizira PT disfunkcija, bubrežni kamenci i progresivno zatajenje bubrega, te s okulocerebrorenalnim sindromom Lowea (MIM #309000), koji dodatno pokazuje do PT disfunkcije i zatajenja bubrega, sistemskih manifestacija kao što su kongenitalne katarakte, kognitivni poremećaji i hipotonija.^2-4Trenutni tretmani za Dentovu bolest 2 i Loweov sindrom su samo potporni.

Slika 1|PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitori ublažavaju aberantni sklop aktina na endosomima u modelu ćelija ljudskog bubrega sa nedostatkom OCRL (HK2). (a) Koraci konverzije fosfoinozitidnih lipida relevantni za ovu studiju koji ukazuju na konverzije između PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P2 i PI(3)P s najrelevantnijim enzimima podebljanim, najrelevantnijim konverzije u punim linijama, a ostale u isprekidanim linijama. PI(4,5)P2 je povišen kod Loweovog sindroma zbog nedostatka aktivnosti 5-fosfataze iz OCRL i nastaje fosforilacijom PI fosfatidilinozitol 4-kinazama (PI4Ks) i PI(4) P 5-kinaza (PIP5K). PI(4,5)P2 je fosforiliran od strane PI3K klase I da bi se dobio PI(3,4,5)P3. PI(3,4,5)P3 se može defosforilirati u PI(4,5)P2 pomoću PTEN-a ili u PI(3,4)P2 pomoću SH-2 – koji sadrži inozitol 50 polifosfate (SHIP) 1 i 2, sinaptojanin 1 i 2, kao i OCRL, iako je ovo (nastavak)

Slika 1|(nastavak) smatra se manjim. PI(3,4)P2 je defosforiliran u PI(3)P pomoću inozitol polifosfat-4-fosfataze tipa IA (INPP4A) i B. PI(3)P se također stvara na endosomima putem fosforilacije PI od strane klase III PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza), protein vakuolnog sortiranja Vps34. (b) Western blotovi koji ilustruju gubitak ekspresije OCRL u ćelijskoj liniji HK2 OCRL CRISPR nokaut (KO) u poređenju sa divljim tipom (WT) HK2 kontrolnim ćelijama sa tubulinom kao kontrolom punjenja. (c–e) Reprezentativne Airyscan konfokalne mikrografije i kvantifikacija ranog endosomskog antigena 1 (EEA1)/aktina (izraženo kao postotak ukupnih otkrivenih EEA1þ vezikula) za HK2 WT ili OCRL KO ćelije tretirane bilo dimetilsulfoksidom (DMSO) (d) ili naznačeni inhibitor i fiksiran upotrebom 4-postotnog formaldehidnog fiksiranja. U svim slučajevima, slike ilustruju jedan z-srez iz Airyscan obrađenog konfokalnog hrpa ćelija imunoobilježenih za EEA1 (žuto), faloidin (aktin, magenta) i 40,6-diamidino{ {14}}fenilindol (DAPI) (cijan). Šipke=5 mm. U kvantifikaciji, linije označavaju srednju vrijednost±SEM i svaka tačka podataka je pojedinačna ćelija. U svim eksperimentima tretmani su primijenjeni 16 sati prije fiksacije. U svim kvantifikacijama, statistička značajnost je procijenjena Kruskal-Wallis (KW) analizom varijanse sa Dunnovim testom višestrukih poređenja. (c) WT ili KO ćelije tretirane DMSO ili 100 nM kopanlisiba, demonstrirajući spašavanje aktin-endosomalnog preklapanja. KW test: ***P < 0.0{{50}}1,="" višestruka="" poređenja;="" wt="" dmso="" naspram="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" naspram="" ko="" kopanlisiba="" oba="" ***p="">< 0.001,="" wt="" kopanlisib="" naspram="" ko="" kopanlisiba="" p="0.44" (nije="" značajno="" [ns]).="" n="52," 85,="" 67="" i="" 63="" ćelije="" za="" wt="" dmso,="" wt="" copanlisib,="" ko="" dmso="" i="" ko="" copanlisib,="" respektivno.="" (d)="" wt="" ili="" ko="" ćelije="" tretirane="" dmso="" ili="" 10="" mm="" alpelisiba,="" demonstrirajući="" spašavanje="" aktin-endosomalnog="" preklapanja.="" kw="" test:="" ***p="">< 0,001,="" višestruka="" poređenja;="" wt="" dmso="" naspram="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" naspram="" ko="" alpelisiba="" oba="" ***p="">< 0,001,="" wt="" alpelisib="" naspram="" ko="" alpelisiba.="" p=""> 0,99 (ns). N=31, 30, 43 i 41 ćelija za WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO i KO alpelisib, respektivno. (e) WT ili KO ćelije tretirane DMSO, 10 mM GSK2636771 ili 10 mM idelalisiba, što pokazuje da nijedno jedinjenje nije u stanju značajno smanjiti aktin-endosomalno preklapanje. KW test: ***P < 0,001,="" višestruka="" poređenja;="" wt="" dmso="" naspram="" ko="" dmso,="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" naspram="" ko="" gsk,="" *p="0.04," ko="" dmso="" naspram="" ko="" idelalisiba,="" p=""> 0,99 (ns). N=159, 130, 203, 122, 131 i 145 ćelija za WT DMSO, WT GSK2636771, WT idelalisib, KO DMSO, KO GSK2636771 i KO idelalisib, redom. Da biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte online verziju ovog članka na www.kidney-international.org

Kako se inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze alpelisib koristi za Loweov sindrom/Dentovu bolest?

LMW proteinurija je konzistentna karakteristika uočena kod Loweovog sindroma/Dentove bolesti 2, otkrivajući da OCRL utiče na endocitozu posredovanu receptorima.⁵OCRL kodira fosfatidilinozitol (PI) 4,5-bisfosfat [PI(4,5)P2] 5- fosfatazu OCRL,⁶koji kontroliše identitet lipida u endolizozomalnom putu razgradnjom PI(4,5)P2 (Slika 1a). Nedovoljna degradacija PI(4,5)P2 kroz OCRL je implicirana u neuspjehu uklanjanja vezikula obloženih klatrinom u fibroblastima, praćeno formiranjem "kometnih" struktura polimeriziranog, filamentoznog aktina iz rezultirajućih aberantnih ranih organela sličnih endosomu.^7-9U drugim tipovima ćelija, posebno u PT ćelijama bubrega, nedostatak OCRL dovodi do struktura „košara“ F-aktina koje okružuju aberantne endolizozomske organele.¹⁰Višak F-aktina blokira promet membrane kroz endocitni i endolizosomalni put, i sugerira se da smanjuje recikliranje multiligandnog receptora megalina u apikalnu membranu, pogoršavajući defekt unutar endolizosomalnog puta.¹¹U skladu s glavnom ulogom aberantnog F-aktina, neispravan unos endocita uzrokovan OCRL mutacijama je ublažen ciljanjem aktinske mašinerije latrunculinom B, ili iscrpljivanjem aktinskih regulatornih proteina, kao i malim, interferirajućim RNA (siRNA) posredovanim iscrpljivanjem PI(4)P 5-kinaze za podešavanje sinteze PI(4,5)P2^7,10(Slika 1a).

Polimerizacija aktina se sve više shvata kao posledica ne samo iz PI(4,5)P2 već i iz drugih fosfoinozitidnih lipida. Na primjer, PI(3,4,5)P3 aktivira Rho-tip GTPaze Rac, a PI(3)P djeluje zajedno sa PI(4,5)P2 kako bi stimulirao polimerizaciju aktina nizvodno od druge GTPaze Rho-tipa, Cdc42.^12-14Međusobna konverzija ovih fosfoinozitida povezana je s kretanjem lipida kroz endocitni i endosomalni put. PI(4,5)P2 je fosforiliran pomoću fosfatidilinozitol- 30 -kinaze klase I (PI3K) u PI(3,4,5)P3 na plazma membrani i postaje progresivno defosforiliran u PI(3,4)P2 i PI (3)P ili PI(4,5)P2.^14,15PI(3)P je obogaćen na endosomima, gdje je neophodan za njihovu funkciju i pretežno nastaje direktnom fosforilacijom PI PI3K klase III(fosfoinozitid 3-kinaza), Vps34¹⁶(Slika 1a). U ćelijskoj liniji pigmentiranog epitela retine (RPE) s nedostatkom OCRL, generirane aktinske komete se smanjuju tretmanom s PI3K (fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitori wortmannin i Vps34-IN1, u skladu sa biohemijskim studijama koje pokazuju koregulaciju aktina putem podudarnosti i PI(3)P i PI(4,5)P2.¹⁴

Spašavanje endocitoze uočeno kada se cilja na aktin mašineriju u OCRL pacijentu i knockout (KO) ćelijama,^7,10zajedno sa uzvodnom regulacijom aktina od strane PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)aktivnost¹⁴i visoko međusobno povezana priroda PI konverzije, pruža intrigantnu mogućnost da klasa I PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitori mogu biti korisni kod Loweovog sindroma. Takvi inhibitori, razvijeni za terapiju raka, odobreni su za kliničku upotrebu¹⁷te su stoga potencijalno podložni ponovnoj namjeni lijekova. Iako jedinjenja kao što je copanlisib¹⁸imaju široku specifičnost i nuspojave, nedavno je dokazan uspjeh za specifičnije inhibitore. idealalisib,¹⁹koji cilja PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)podjedinica p110d, odobrena je za kronični limfocitni limfom, a alpelisib, koji cilja na p110a, odobren je za upotrebu kod raka dojke.^20,21Štaviše, alpelisib je pokazao kliničku korist kod djece sa PROS/CLOVES sindromom,²²rijedak sindrom prekomjernog rasta koji je rezultat aktivacije PIK3A.

Ovdje smo testirali hipotezu da klasa I PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitori mogu spasiti endocitni defekt zbog gubitka OCRL, koristeći utvrđene ćelijske i mišje modele.^10,11,23Pokazali smo da inhibicija PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)aktivnost preko copanlisiba ili alpelisiba, ili siRNA posredovano iscrpljivanje alpelisib-ciljne katalitičke podjedinice p110a smanjuje višak polimerizacije aktina u stanicama ljudskog bubrega (HK2) s manjkom OCRL. Fokusirajući se na alpelisib kao najspecifičnije jedinjenje za kliničku upotrebu, pokazujemo da smanjuje polimerizaciju aktina i poboljšava unos kroz endolizosomalni put u PT stanicama iz humaniziranog Ocrl-a.^Y/-miševi in ​​vitro. Nadalje, liječenje alpelisibom in vivo ublažava proteinuriju, smanjuje PT disfunkciju i spašava ćelijske nivoe megalina u humaniziranom Ocrl^Y/-miševi. Ovi rezultati podržavaju alpelisib kao kandidata za ponovno korištenje lijekaLowe sindrom i Dentova bolest 2.

Slika 2|Učinci Alpelisiba na aktin su zavisni od doze i rekapitulirani su pomoću siRNA PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)p110a. (a) Reprezentativne Airyscan konfokalne mikrofotografije (fiksirane korištenjem fiksa sa formaldehidom od 4 posto i imunoobilježene za rani endosomski antigen 1 [EEA1], žuti; aktin [faloidin], magenta; i 4{{40}},{{ 5}}diamidino-2-fenilindol [DAPI], cijan; trake=5 mm) i kvantifikacija divljih (WT) ili nokautiranih (KO) ćelija ljudskog bubrega (HK2) tretiranih dimetilsulfoksidom (DMSO) ili naznačene doze alpelisiba u trajanju od 16 sati, što pokazuje dozno-reaktivno spašavanje aktin-endosomalnog preklapanja. U svim slučajevima, linije označavaju srednju vrijednost±SEM, a tačke označavaju pojedinačne ćelije. N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66 i 67 ćelija za WT kontrolu, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO , i KO 2,5, 5, 10, 15, 25 i 50 mM alpelisiba, respektivno. Statistička značajnost procijenjena Kruskal-Wallisovim (KW) testom sa Dunnovim testom višestrukih poređenja: ukupno ***P < 0,001,="" višestruka="" poređenja;="" wt="" dmso="" naspram="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" naspram="" ko="" 5,="" 15,="" 25="" i="" 50="" mm="" alpelisiba="" sve="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" naspram="" ko="" 2,5="" mm="" alpelisiba="" *p="0.0131," ko="" dm100="" mm="" alpelisib="" **p="0.0043," wt="" dmso="" naspram="" wt="" 10="" i="" 50="" mm="" alpelisiba="" p=""> 0,9999 (nije značajno [ns]). (b) Western blot za p110a i a-tubulin za kontrolu punjenja WT ili KO ćelija tretiranih scramble (Scram.) ili p110a siRNA. (c) Reprezentativne Airyscan konfokalne mikrofotografije (fiksirane korištenjem 4 posto formaldehidne fiksacije i imunoobilježene za EEA1, žuta; aktin [faloidin], magenta; i DAPI, cijan; trake=5 mm) i kvantifikacija tretiranih WT ili KO ćelija sa skremblom (S) ili p110a siRNA, što pokazuje smanjenje preklapanja EEA1-aktina na iscrpljenju p110a. KW test sa Dunnovim testom višestrukih poređenja: ***P < 0,001,="" višestruka="" poređenja;="" wt="" skrembl="" naspram="" ko="" skrembla,="" ko="" skrembl="" naspram="" ko="" p110a="" sirna="" oba="" ***p="">< 0,001.="" n="79," 108,="" 93="" i="" 131="" ćelija,="" respektivno.="" hk2,="" ljudski="" bubreg;="" pi3k,="" fosfatidilinozitol-30="" -kinaza;="" sirna,="" mala="" interferirajuća="" rnk.="" da="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" online="" verziju="" ovog="" članka="" na="">

Slika 3|Nivoi fosfatidilinozitola (PI) 4,5-bisfosfata [PI(4,5)P2] su povišeni sa OCRL nokautom (KO), a PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 , i PI(3)P su potisnuti tretmanom alpelisibom. U svim eksperimentima, naznačeni tretmani su primijenjeni 16 sati prije fiksacije. U kvantifikaciji, linije označavaju srednju vrijednost±SEM, a svaka tačka podataka rezultat je pojedinačne ćelije. U svim kvantifikacijama, statistička značajnost je procijenjena Kruskal-Wallis (KW) analizom varijanse sa Dunnovim testom višestrukih poređenja. Šipke=20mm na svim slikama. (a) Reprezentativne mikrografije širokog polja divljih (WT) ili KO ćelija ljudskog bubrega (HK2) tretiranih dimetilsulfoksidom (DMSO) ili 10 mM alpelisiba, a zatim fiksirane fiksom plazma membrane i imunoobilježene za PI(3,4,5) )P3 (crveni) i 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (cijan), sa kvantifikacijom srednjeg ćelijskog intenziteta označavanja PI(3,4,5)P3, koji pokazuje efikasnost alpelisiba tretman na sintezu PI(3,4,5)P3. N=96, 128 i 109 ćelija za WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO i KO alpelisib, respektivno. KW (nastavak)

Slika 3|(nastavak) test: ukupno ***P < 0.001,="" višestruka="" poređenja;="" wt="" dmso="" naspram="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" naspram="" wt="" alpelisiba="" i="" ko="" dmso="" naspram="" ko="" alpelisiba="" sve="" ***p="">< 0.0{{70}}1.="" (b)="" reprezentativne="" konfokalne="" mikrofotografije="" wt="" ili="" ko="" hk2="" ćelija="" tretiranih="" sa="" dmso,="" 10="" mm-="" ili="" 50-mm="" alpelisibom="" tokom="" 16="" sati,="" a="" zatim="" fiksirane="" golgi="" fiksom="" i="" označene="" pomoću="" m="" ch="" {{10}}xfyve="" pi(3)p="" sonda="" (magenta)="" i="" dapi="" (cijan),="" s="" kvantifikacijom="" broja="" pi(3)p-pozitivnih="" punkta="" otkrivenih="" u="" ćelijama="" tretiranim="" rasponom="" koncentracija="" alpelisiba="" ,="" kao="" što="" je="" naznačeno,="" što="" pokazuje="" da="" su="" pi(3)p-pozitivne="" tačke="" smanjene="" na="" način="" koji="" ovisi="" o="" dozi.="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240="" i="" 215="" ćelija="" za="" wt="" kontrolu,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" i="" ko="" 2.5,="" 5,="" 10,="" 25="" i="" 50="" mm="" alpelisiba,="" respektivno.="" kw="" test:="" ukupno="" ***p="">< 0,001,="" višestruka="" poređenja;="" wt="" dmso="" naspram="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" naspram="" wt="" 10="" i="" 50="" mm="" alpelisiba,="" ko="" dmso="" naspram="" ko="" 50="" mm="" alpelisiba="" sve="" ***p="">< 0,001;="" ko="" dmso="" naspram="" ko="" 2,5="" i="" 5="" mm="" alpelisiba="" oba="" p=""> 0,9999 (nije značajno [ns]); KO DMSO naspram KO 10 mM alpelisiba **P=0.0049; KO DMSO naspram KO 25 mM alpelisiba ***P=0.0002. (c) Reprezentativne mikrografije širokog polja WT ili KO HK2 ćelija tretiranih DMSO ili 10 mM alpelisiba, a zatim fiksiranih fiksom plazma membrane i imunoobilježenih za PI(4,5)P2 (žuto) i DAPI (cijan), s kvantifikacijom srednji intenzitet ćelijskog označavanja PI(4,5)P2, koji pokazuje povećani PI(4,5)P2 plazma membrane u KO ćelijama, koji je smanjen tretmanom alpelisibom, posebno u KO ćelijama. N=126, 112, 85 i 116 ćelija za WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO i KO alpelisib, respektivno. KW test: ukupno ***P < 0,001,="" višestruka="" poređenja;="" wt="" dmso="" naspram="" ko="" dmso="" i="" ko="" dmso="" naspram="" ko="" alpelisiba="" oba="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" naspram="" wt="" alpelisiba="" p="0.4752" (ns).="" (d)="" reprezentativne="" mikrografije="" širokog="" polja="" wt="" ili="" ko="" hk2="" ćelija="" tretiranih="" dmso="" ili="" 10="" mm="" alpelisiba,="" a="" zatim="" fiksiranih="" fiksom="" od="" 4="" posto="" formaldehida="" i="" imunoobilježenih="" za="" pi(4,5)p2="" (žuto)="" i="" dapi="" (cijan),="" s="" kvantifikacijom="" broja="" pi(4,5)p2-pozitivnih="" puncta,="" pokazujući="" povećanu="" pi(4,5)p2="" puncta="" u="" ko="" ćelijama,="" koja="" je="" smanjena="" tretmanom="" alpelisibom,="" posebno="" u="" ko="" ćelijama.="" n="75," 65,="" 52="" i="" 69="" ćelija="" za="" wt="" dmso,="" wt="" alpelisib,="" ko="" dmso="" i="" ko="" alpelisib,="" respektivno.="" kw="" test:="" ukupno="" ***p="">< 0,001,="" višestruka="" poređenja;="" wt="" dmso="" naspram="" ko="" dmso="" i="" ko="" dmso="" naspram="" ko="" alpelisiba="" oba="" ***p="">< 0,001;="" wt="" dmso="" u="" odnosu="" na="" wt="" alpelisib="" p=""> 0,99 (ns). au, proizvoljne jedinice. Da biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte online verziju ovog članka na www.kidney-international.org.

Kako se inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze alpelisib koristi za Loweov sindrom/Dentovu bolest?

1. REZULTATI

1.1 Inhibitori PI3K klase I smanjuju agregaciju aktina u OCRL-KO HK2 ćelijama

Koristili smo CRISPR-Cas9 uređivanje gena za nokautiranje (KO) OCRL u ćelijskoj liniji HK2 kako bismo omogućili testiranje klase I PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitori karakteristične agregacije aktina u endolizosomskim kompartmentima.^7,9,10,14Western blotting je potvrdio smanjenje od 98.0± 0.7 posto u ekspresiji OCRL u lizatima iz KO HK2 ćelija (Slika 1b). OCRL KO je rekapitulirao fenotip aktinske košare u ćelijama HK2, na što ukazuje povećano preklapanje između F-aktina i ranog endosomskog antigena 1 (EEA1), kvantificiranog na Airyscan konfokalnoj mikroskopskoj z-stackovima (Slika 1c–e). Ovo povećano preklapanje uočeno u OCRL KO ćelijama poništeno je tretmanom kopanlisibom (C), PI3K širokog opsega (fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitor koji cilja na p110a i d i u manjoj mjeri na izoforme p110b i g (slika 1c). Vestern blotiranjem ekstrakata celih ćelija HK2 otkrili smo da PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)Regulatorne podjedinice p110 a, b i d bile su dobro izražene i u ćelijama divljeg tipa (WT) i u KO ćelijama, sa prisutnim samo nivoima u tragovima izoforme p110g (dodatna slika S1A).

Odlikovali smo PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)specifičnost inhibicije F-aktina upotrebom alpelisiba (A), selektivnog inhibitora p110a, i GSK2636771 (G) i idelalisiba (I), selektivnih inhibitora p110b i p110d, respektivno (dodatna slika S1A). Iako je tretman alpelisibom dao slično smanjenje polimerizacije endosomskog aktina u poređenju sa kopanlisibom (slika 1d), GSK2636771 i idelalisib su imali mali učinak na akumulaciju aktina (slika 1e). Klasa I PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitori nisu imali povećanu toksičnost na OCRL KO u odnosu na nemodifikovane ćelije, na osnovu MTT testa (dodatna slika S1B).

1.2 Alpelisib i nokdaun p110a spašavaju fenotip aktina u HK2 ćelijama

Za naše studije koje su uslijedile, fokusirali smo se na alpelisib jer je najselektivniji i najmanje toksičan PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitor koji je do sada razvijen, a trenutno se koristi za liječenje mozaične prekomjerne aktivacije PI3K klase Ia kod djece sa PROS/CLOVES sindromom.²²Alpelisib je smanjio aktinske košare u OCRL KO HK2 ćelijama na način koji odgovara dozi (slika 2a). Efekti su uočeni pri dozi od 10 mM već 4 sata nakon tretmana, bez očigledne toksičnosti (dodatna slika S2). Za testiranje da li PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibicija alpelisibom bila je izvor smanjenog bojenja aktina, posebno smo smanjili njegovu metu, p110a podjedinicu, koristeći siRNA (slika 2b). U poređenju sa tretmanom sa kontrolnom (kodiranom sekvencom) siRNA, siRNA protiv p110a je dala smanjenje od 78,3±4,8% i 68,9±7,7% proteina p110a u WT i OCRL KO HK2 ćelijama, respektivno, što se odrazilo na značajno smanjenje aktinskih košara ( Slika 2c).

1.3 Smanjeni nivoi PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 i PI(3)P u HK2 ćelijama tretiranim alpelisibom

Da bismo ispitali kako na fosfoinozitidne lipide utječe liječenje OCRL KO i alpelisibom, bojili smo HK2 stanice antitijelima ili proteinskim domenama protiv PI(3,4,5)P3, PI(3)P i PI(4,5)P2, koristeći optimizirani uvjeti fiksacije za plazma membranu ili intracelularno bojenje.^24,25PI(3,4,5)P3 ima difuznu lokalizaciju na plazma membrani, a tretman alpelisibom (10 mM) doveo je do snažnog smanjenja bojenja za PI(3,4,5)P3 u WT i OCRL KO ćelijama, kao očekuje se od njegovog mehanizma djelovanja i specifičnosti za klasu IA PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)p110a (Slika 3a). Očekuje se da će PI(3,4,5)P3 biti progresivno defosforiliran kako se membrane endocitozuju i prometuju u endosome.^14,26,27Fiksiranjem ćelija tako da se sačuva intracelularni PI(3)P,²⁵otkrili smo da su PI(3)P punctae također smanjene tretmanom alpelisibom (na način koji ovisi o dozi, što je vidljivo iz koncentracija od čak 10 mm za 16-satni tretman) u WT i OCRL KO ćelijama (slika 3b i Dodatna slika S2C). Kao što se očekivalo, KO OCRL u HK2 ćelijama indukovao je značajno povećanje nivoa PI(4,5)P2 i na plazma membrani (slika 3c) i intracelularno (slika 3d), u poređenju sa WT ćelijama.^10,28Tretman alpelisibom je značajno smanjio elevaciju PI(4,5)P2 koju generiše OCRL KO u oba odjeljka, dok nije imao efekta u WT ćelijama (Slike 3c i d). Izvještava se da Alpelisib inhibira PI 4-kinazu b sa 50 posto inhibitornom koncentracijom od 0,5 mM,¹⁹što je mogući izvor smanjenja PI(4,5)P2. Naši podaci sugeriraju zajedno da alpelisib inhibira sklapanje aktina na endosomima OCRL KO putem bispecifičnog efekta na nivoe PI(4,5)P2 i PI(3)P.

Slika 4|Alpelisib ublažava aktinske defekte Orala u kultiviranom humaniziranom Ocrl-u^Y/-PTC miša (m PTC). (a) Reprezentativni konfokalni mikrografi Z-projekcije maksimalnog intenziteta za OcrlY/þ ili Ocrl^Y/-m PTC tretirani dimetilsulfoksidom (DMSO) ili 10 mM alpelisiba 16 sati, a zatim fiksirani fiksom od 4 posto formaldehida i imunoobilježeni na aktin (faloidin) (bijeli) i 40,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (plava), s kvantificiranjem stepena do kojeg su vlakna od stresa prisutna u svakom stanju, pokazujući da su stresna vlakna izgubljena u Ocrl^Y/-m PTC se spašavaju tretmanom alpelisibom. Linije označavaju srednja vrijednost±SEM, a tačke podataka označavaju svaki region snimanja: N=5 regiona za snimanje po stanju (svaki sadrži približno 15-20 ćelija). Značajnost je procijenjena uobičajenom 1-analizom varijanse (ANOVA) sa Holm-Sidakovim testom višestrukog poređenja, **P=0.001, višestruka poređenja; Ocrl Y/þ DMSO u odnosu na Ocrl^Y/-DMSO **

P{0}}.002, Ocrl^Y/-DMSO u odnosu na Ocrl^Y/-alpelisib **P=0.004, OcrlY/þ DMSO u odnosu na Ocrl^Y/- alpelisib P=0.50 (nije značajno [ns]). Šipke=20mm. (b) Reprezentativni 3D prikazi sa velikim uvećanjem Ocrl m PTC-a tretiranih DMSO ili 10 mM alpelisiba tokom 16 sati, a zatim fiksirani fiksom od 4 posto formaldehida i imunoobilježeni za rani endosomski antigen 1 (EEA1) (ljubičasta), aktin ( faloidin, žuti) i DAPI (plavi), i kvantifikacija koja ilustruje spašavanje aktin-endosomalnog preklapanja alpelisibom. Prikazi sa manjim uvećanjem koji ukazuju na preglede (nastavak)

Slika 4|(nastavak) ove regije su prikazane na dodatnoj slici S4B i dodatnim filmovima S1-S3. Linije pokazuju srednju vrijednost±SEM. N=42, 47 i 45 nasumično odabranih polja za OcrlY/þ þ DMSO, Ocrl^Y/-þ DMSO i Ocrl^Y/-þ stanja alpelisiba, respektivno, u svakom slučaju prikupljena iz 4 mišja bubrega po stanju. Značajnost je testirana Kruskal-Wallis (KW) ANOVA sa Dunnovim testom višestrukih poređenja: ukupno ***P < 0.001,="" višestruka="" poređenja;="" ocrly/þ="" dmso="" u="" odnosu="" na="">^Y/-DMSO i Ocrl^Y/-DMSO u odnosu na Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" u="" odnosu="" na="">^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns). Šipke =1 mm. (c) Reprezentativne konfokalne mikrografije OcrlY/þ ili Ocrl^Y/-m PTC-a tretiranih DMSO ili 10-mM alpelisibom, a zatim fiksiranih Golgi fiksom i označenih pomoću m Ch-2xFYVE PI(3)P sonde (magenta) i DAPI (cijan), s kvantificiranjem broj PI(3)P-pozitivnih punkta otkrivenih u ćelijama. N=188, 177, 246 i 206 ćelija iz OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO i Ocrl^Y/-þ alpelisib, respektivno; ćelije su prikupljene iz 3 oralna bubrega po grupi. KW test: ukupno ***P < 0.001,="" višestruka="" poređenja;="" ocrly/þ="" dmso="" u="" odnosu="" na="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO naspram OcrlY/þ alpelisib i Ocrl^Y/-DMSO u odnosu na Ocrl^Y/-alpelisib, sve ***P < 0.001.="" šipke="20" mm.="" (d)="" reprezentativne="" konfokalne="" mikrografije="" ocrly/þ="" ili="">^Y/-m PTC tretirani DMSO ili 10 mM alpelisiba 16 sati, a zatim fiksirani fiksom od 4 posto formaldehida i imunoobilježeni na fosfatidilinozitol (PI) 4,5-bisfosfat [PI(4,5) P2] (žuti) i DAPI (cijan), s kvantifikacijom broja PI(4,5)P2-pozitivnih puncta, pokazujući povećanu PI(4,5)P2 puncta u Ocrl^Y/-stanica, koje se redukuju liječenjem alpelisibom. N=477, 444, 423 i 494 iz OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO i Ocrl^Y/-þ alpelisib, respektivno; ćelije su prikupljene iz 3 oralna bubrega po grupi. KW test: ukupno ***P < 0.001,="" višestruka="" poređenja;="" ocrly/þ="" dmso="" u="" odnosu="" na="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO naspram OcrlY/þ alpelisib i Ocrl^Y/-DMSO u odnosu na Ocrl^Y/-alpelisib, sve ***P < 0.001.="" šipke="20" mm.="" da="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" online="" verziju="" ovog="" članka="" na="">

1.4 Alpelisib smanjuje intracelularne fosfoinozitide i ublažava defekte citoskeleta u Ocrl^Y/-m PTC

Zatim smo testirali da li alpelisib ima iste efekte u primarnim ćelijama PT ćelija izvedenih iz humaniziranog mišjeg modela Ocrldeficijenta (Ocrl^Y/-), koji rekapitulira abnormalnu polimerizaciju aktina i endocitni defekt uočen u ćelijama izvedenim od pacijenta.^10,11PTC-ovi miša (m PTC-a) izraženi su slično kao PI3K klase I (fosfoinozitid 3-kinaza) regulatorne podjedinice za HK2 ćelije u WT i Ocrl^Y/-miševi i pokazali su sličan profil toksičnosti prema alpelisibu kada su procijenjeni MTT testovima (dodatna slika S3). Snimanje konfokalnom mikroskopijom otkrilo je upečatljiv poremećaj normalne arhitekture stresnih vlakana F-aktina u m PTC-ima iz Ocrl-a^Y/-u poređenju sa OcrlY/þ miševima, vjerovatno zbog premeštanja aktinskih regulatornih proteina sa njihovih normalnih staničnih lokacija u endozome, jer veliki sklopovi aktina okružuju ove organele i smatra se da su izvor defekta trgovine.^10,29Liječenje Ocrl^Y/- m PTC sa alpelisibom (10 mM) obnovili su arhitekturu stresnog vlakna (slika 4a).

Kako se inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze alpelisib koristi za Loweov sindrom/Dentovu bolest?

Kao glavni problem uLowe sindrom i Dentova bolest2 je smanjen promet endosoma i posljedična degradacija megalina, pokušali smo razlikovati endosomalni aktin od stresnih vlakana. Sakupili smo konfokalne z-stackove laserskim skeniranjem kroz ćelije, rekonstruisali uzorak bojenja u 3D prikazima površine i koristili oblik/parametre veličine da identifikujemo punktatne aktinske strukture i stepen do kojeg se one preklapaju sa endosomskim strukturama (dodatna slika S4 i filmovi S1 –S3). Ova analiza je otkrila da tretman alpelisibom smanjuje aberantnu polimerizaciju F-aktina na endosomima obojenim EEA1, što se razlikuje od arhitekture stresnog vlakna (Slika 4b). M PTC-a izvedeni iz Ocrl^Y/-miševi su pokazali značajne promjene u intracelularnom bojenju za PI(3)P (smanjen) i PI(4,5)P2 (povećan), u poređenju sa m PTCs miševa WT OcrlY/þ (Slike 4c i d). Tretman m PTC-a iz Ocrl^Y/- miševi sa alpelisibom doveli su do značajnog smanjenja intracelularnog bojenja PI(3)P i PI(4,5)P2 (Slike 4c i d).

1.5 Alpelisib poboljšava unos endocita u Ocrl^Y/-m PTC

Zatim smo procijenili da li je učinak alpelisiba na citoskeletne i vezikularne defekte uočen kod m PTC-a rezultirao promjenama u kapacitetu endocitnog preuzimanja. Da bi se razlikovao učinak alpelisiba na vezivanje i/ili internalizaciju liganda, m PTC su prvo inkubirani s obilježenim goveđim serumskim albuminom (BSA), da bi se inducirao vezivanje sonde sa endocitnim receptorima, a zatim su inkubirani s medijumom za rast, pratite internalizaciju albumina (slika 5a). The Ocrl^Y/-ćelije su pokazale niže vezivanje Alexa 488-goveđeg serumskog albumina za plazma membranu zajedno sa poremećenom internalizacijom albumina u poređenju sa OcrlY/þ ćelijama. Tretman alpelisibom spasio je i vezivanje i unos albumina u Ocrl^Y/-ćelije, sa 50 posto ukupnog spašavanja endocitnog unosa (Slike 5b i c). Ovi podaci su podržani mjerenjem ukupnog unosa albumina (dodatne slike S5a i b). Primijetili smo da je omjer internaliziranog/vezanog Alexa 488-goveđeg serumskog albumina ostao sličan između različitih stanja (Slika 5d), što implicira da je smanjeno uzimanje albumina uglavnom zbog narušenog vezivanja, a ne zbog defektnog procesa internalizacije.

1.6 Alpelisib poboljšava disfunkciju PT i endocitozu posredovanu receptorima u Ocrl^Y/- miševi

Testirali smo potencijalni terapeutski efekat alpelisiba na disfunkciju PT in vivo. Oralnim miševima je davan ili vehikulum ili alpelisib (50 mg/kg tjelesne težine dnevno) oralnom sondom tokom 6 sedmica (slika 6a). Ovaj režim je odabran prema prethodnim in vivo studijama koje su pokazale efikasnost i sigurnost.^22,30U skladu s davanjem alpelisiba poznato je da uzrokuje inzulinsku rezistenciju i hiperglikemiju,²²Liječenje alpelisibom dovelo je do značajnog povećanja glikozurije i kod Ocrl Y/þ i kod oralnog^Y/-miševi, koji bi se mogli smatrati biomarkerom za doziranje lijeka (dodatna tabela S1). Nakon 6 sedmica liječenja alpelisibom, Ocrl^Y/-miševi su pokazali značajno smanjenje urinarnog izlučivanja LMW proteina CC16 (-34 posto) i albumina (-38 posto), u poređenju sa kontrolama tretiranim vehikulom (Slike 6b i c), dok je volumen urin i drugi parametri nisu bili pogođeni (dodatna tabela S1). Miševi oba genotipa tretirani Alpelisibom pokazali su slično smanjenje stope rasta u odnosu na kontrolne miševe, kao što je prethodno opisano.²²Ipak, i miševi sa nosačem i tretirani miševi su dobili tjelesnu težinu, što ukazuje da lijek ne utječe ozbiljno na postnatalni razvoj (slika 6d i dodatna tabela S1).

Da bismo testirali da li efekat alpelisiba na LMW proteinuriju odražava oporavak endocitoze posredovane receptorima u PT ćelijama, pratili smo in vivo unos Cy5-obilježenog b-laktoglobulina u bubrezima miša. Ocrl tretiran Alpelisibom^Y/-miševi su pokazali značajno spašavanje Cy5-obilježenog b-laktoglobulina, blizu stepena internalizacije uočenog kod OcrlY/þ miševa tretiranih nosačem (Slika 6e). Ovo se ogledalo u značajnom spašavanju ekspresije endocitnog receptora megalina u PT ćelijama, što je uočeno imunoobilježavanjem i western blotiranjem lizata bubrega Ocrl tretiranog alpelisibom.^Y/-miševi; imajte na umu da nije došlo do promjene u ekspresiji PT markera AQP1 (slika 6f i g i dodatna slika S5C i D). Ovi podaci pokazuju da PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitor alpelisibindukuje značajno poboljšanje PT endocitne mašinerije i smanjuje LMW proteinuriju u humaniziranom mišjem modelu za Loweov sindrom.

Slika 5|Alpelisib poboljšava endocitni unos humaniziranog Ocrl^Y/-PTC miša (m PTC). (a) Šematski prikaz eksperimenta pulsne chase koji se koristi za ispitivanje vezivanja i internalizacije Alexa 488-goveđeg serumskog albumina (BSA) u m PTC. Ćelije su bile izložene Alexa 488-BSA (0.2 mg/ml) 1 sat na 4 stepena kako bi se omogućilo da se BSA veže za receptore na površini ćelije (puls), a zatim zagrijane na 37 stepeni u ćelijskom mediju 20 minuta prije fiksacije kako bi se omogućila internalizacija liganda (chase). (b) Reprezentativne konfokalne mikrografije OcrlY/þ ili Ocrl^Y/-m PTC tretirani dimetilsulfoksidom (DMSO) ili 10 mM alpelisiba tokom 16 sati i podvrgnuti Alexa 488-BSA (zelenom) eksperimentu pulsne chase, prije nego što su fiksirani i označeni za 40,6-diamidino{ {6}}fenilindol (DAPI) (plava). Faza pulsa eksperimenta prikazana je na gornjoj ploči za svako stanje, sa potragom ispod. Šipke =20 mm. (c) Kvantifikacija površine ćelije Alexa 488-BSA (i) i internalizovane Alexa 488-BSA (ii), procijenjena kao srednji intenziteti FL fluorescencije po ćeliji. Alpelisib spašava spašeno BSA vezivanje i internalizaciju uočeno u Ocrl^Y/-ćelije. N=209, 228, 186 i 196 ćelija za OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, OcrlY/ DMSO i Ocrl^Y/-uslovi alpelisiba, redom u (i) i N=203, 183, 199 i 233 ćelija za OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, Ocrl^Y/-DMSO i Ocrl^Y/-stanja alpelisiba, odnosno u (ii), u svakom slučaju prikupljena iz 2 mišja bubrega po stanju; svaka tačka podataka predstavlja srednji intenzitet FL fluorescencije u pojedinačnoj ćeliji. Značajnost je testirana Kruskal-Wallis (KW) analizom varijanse (ANOVA) sa Dunnovim testom višestrukih poređenja: za (i) ćelijsku površinu BSA, ukupno ***P < 0.001,="" višestruka="" poređenja:="" ocrly/þ="" dmso="" u="" odnosu="" na="">^Y/-DMSO i Ocrl^Y/-DMSO u odnosu na Ocrl^Y/-alpelisib ***P < {{0}}.001;="" ocrly/þ="" dmso="" naspram="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.60" (nije="" značajno="" [ns]);="" za="" (ii)="" internalizirani="" bsa,="" ukupno="" ***p="">< 0,001,="" višestruka="" poređenja:="" ocrly/þ="" dmso="" naspram="">^Y/-DMSO i Ocrl^Y/-DMSO u odnosu na Ocrl^Y/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" naspram="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.66" (ns).="" (d)="" kvantifikacija="" omjera="" između="" alexa="" 488-="" bsa="" površine="" ćelije="" i="" internaliziranog="" intenziteta="" fluorescencije="" alexa="" 488–bsa="" fl,="" ne="" pokazujući="" značajne="" razlike="" u="" omjerima="" između="" svakog="" stanja.="" svaka="" tačka="" predstavlja="" prosjek="" omjera="" u="" polju="" koje="" sadrži="" približno="" 15-20="" ćelija="" (n="13," 13,="" 10="" i="" 11="" nasumično="" odabranih="" polja="" za="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="">^Y/-DMSO i Ocrl^Y/-alpelisib stanja, respektivno, u svakom slučaju prikupljena iz 2 mišja bubrega po stanju). Značajnost je testirana KW ANOVA sa Dunnovim testovima višestrukih poređenja: ukupni P=0.46 (ns), višestruka poređenja: OcrlY/þ DMSO naspram Ocrl^Y/-DMSO i Ocrl^Y/-DMSO u odnosu na Ocrl^Y/-alpelisib P > 0.99 (ns); OcrlY/þ DMSO naspram OcrlY/þ alpelisib P=0.84 (ns). Da biste optimizirali gledanje ove slike, pogledajte online verziju ovog članka na www.kidney-international.org.

Slika 6|Alpelisib poboljšava funkciju proksimalnih tubula (PT) OcrlY/L miševa, vraćajući unos liganda i ekspresiju megalina. (a) Eksperimentalna postavka. Oralni miševi su tretirani tokom 6 sedmica dnevnom oralnom dozom karboksimetilceluloze 1 posto (nosač) ili alpelisiba (50 mg/kg tjelesne težine). Posljednjeg dana tretmana, miševima je ubrizgan Cy5-obilježen b-laktoglobulin (N=6 Ocrl^Y/-, ili 8 ocrl^Y/-miševi po grupi). (b–d) Prikazane D vrijednosti ukazuju na srednju promjenu od BL do D42 za stanje±SEM. (b) Clara ćelijski protein 16 (CC16), (c) izlučivanje albumina u mokraći (oba u roku od 15 sati) i (d) tjelesna masa je izmjerena kod OcrlY/- miševa tretiranih bilo nosačem ili alpelisibom u naznačenom vremenu. Svaka tačka predstavlja 1 miša. Značajnost je procijenjena 2-uparenim studentovim t-testom; u (b) CC16 (nastavak)

Slika 6|(nastavak) promjena izlaza u odnosu na osnovnu liniju; þ vozilo, P=0.9802 (nije značajno [ns]), þ alpelisib, *P=0.0334; u (c) promjena proizvodnje albumina u odnosu na početnu liniju; þ vozilo, P=0.0502 (ns), þ alpelisib, ***P ¼ 0,0006; u (d) promjena tjelesne mase u odnosu na početnu liniju; þ vozilo, ***P < 0,0001,="" þ="" alpelisib,="" **p="0.0083." (e)="" reprezentativne="" konfokalne="" mikrografije="" koje="" prikazuju="" cy5-obilježeni="" b-laktoglobulin="" (magenta)="" 15="" minuta="" nakon="" injekcije="" u="" venu="" repa="" i="" označen="" za="" 40,6-diamidino{18}}fenilindol="" (dapi)="" (cijan),="" plus="" kvantifikacija="" odgovarajućih="" fl="" fluorescentnih="" signala="" iz="" ocrl="" mišjih="" bubrega="" (n="412," 500,="" odnosno="" 588="" tubula,="" respektivno,="" za="" ocrly/þþ="" vozilo,="">^Y/-þ vozilo, i Ocrl^Y/-þ alpelisib) za 3 miša po tretiranoj grupi. Unos b-laktoglobulina je spašen tretmanom alpelisibom. Šipke ¼ 20 mm. U kvantifikaciji, svaka tačka predstavlja intenzitet fluorescencije FL normalizovan po površini tubula; prikazani podaci ukazuju na srednju vrijednost±SEM. Značajnost je procijenjena Kruskal-Wallisovim (KW) testom nakon čega je uslijedio Dunn-ov test višestrukog poređenja; ***P < 0,001,="" višestruka="" poređenja;="" ocrly/þþ="" vozilo="" u="" odnosu="" na="">^Y/-þ vozilo i Ocrl^Y/-þ vozilo u odnosu na Ocrl^Y/-þ alpelisib, oba ***P < 0.001.="" (f)="" western="" blot="" i="" denzitometrijska="" analiza="" nivoa="" megalina="" u="" lizatima="" cijelog="" bubrega="" oralnih="" miševa.="" a-tubulin="" je="" korišten="" kao="" kontrola="" opterećenja.="" smanjena="" ekspresija="" megalina="" u="">^Y/-je spašen alpelisibom. U kvantifikaciji denzitometrijske analize, svaka tačka predstavlja 1 miša (N=4 OcrlY/þþ vozilo i Ocrl^Y/-þ vozilo i N=3 Ocrl^Y/-þ alpelisib miševi); linije pokazuju srednju vrijednost±SEM. Značajnost je procijenjena 2-repom neuparenim Studentovim t-testom: OcrlY/þþ vozilo naspram Ocrl^Y/-þ vozilo; **P ¼ 0.0057, ocrl^Y/-þ vozilo u odnosu na Ocrl^Y/- þ alpelisib, *P=0.0246. (g) Reprezentativne konfokalne mikrografije sa umetcima velikog povećanja i kvantifikacijom intenziteta megalina (žutog) u AQP1þ PT (magenta) iz oralnih bubrega također su označene za DAPI (cijan) ilustrirajući spašavanje nivoa megalina nakon tretmana alpelisibom. Šipke =20 mm. U kvantifikaciji, svaka tačka predstavlja intenzitet fluorescencije FL normalizovan po površini tubula; ucrtani podaci pokazuju srednju vrijednost±SEM; N=142, 191, odnosno 266 tubula za OcrlY/þþ vozilo, Ocrl^Y/-þ vozilo, i Ocrl^Y/-þ alpelisib za 3 miša po tretiranoj grupi. Značajnost je procijenjena KW analizom varijanse praćeno Dunnovim testom višestrukog poređenja; ukupno ***P < 0.001,="" višestruka="" poređenja;="" ocrly/þþ="" vozilo="" u="" odnosu="" na="">^Y/-þ vozilo i Ocrl^Y/-þ vozilo u odnosu na Ocrl^Y/-þ alpelisib, oba ***P < 0.001.="" da="" biste="" optimizirali="" gledanje="" ove="" slike,="" pogledajte="" online="" verziju="" ovog="" članka="" na="">

Kako se inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze alpelisib koristi za Loweov sindrom/Dentovu bolest?

2. DISKUSIJA

Trenutno ne postoji tretman za ublažavanje defektne endocitoze koja uzrokuje PT disfunkciju uLowe sindrom i Dentova bolest2. Naši nalazi otkrivaju da alpelisib ublažava fenotip aberantnog aktina smanjenjem nivoa PI(4,5)P2 i PI(3)P, uzrokujući značajno poboljšanje endocitnog mehanizma i apsorpcionog kapaciteta u ćelijskim sistemima i humaniziranog mišjeg modela za Loweov sindrom/Dentova bolest 2. Ovi rezultati podržavaju vezu između fosfoinozitidnih lipida, polimerizacije aktina i prometa endocita, sa neposrednim značajem za visoko aktivne epitelne ćelije uključene u ključne homeostatske procese (Slika 7). S obzirom na nedostatak efikasnih terapija i očiglednu sigurnost ove klase PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitori, alpelisib je obećavajući kandidat za prenamjenu lijeka uLowe sindrom i Dentova bolest.

LMW proteinurija je najkonzistentnija karakteristika koja se sreće kod pacijenata saLowe sindrom i Dentova bolest2 zbog inaktivirajućih mutacija u OCRL.⁴Ovi LMW proteini se mogu lako otkriti i kvantificirati, nudeći vjerni biomarker defektne endocitoze posredovane receptorima u PT stanicama.1 LMW proteinurija je posebno relevantna, jer se detektira konzistentnije i često ranije od drugih otopljenih tvari (npr. glukoza, fosfat, aminokiseline) koji su dio klasičnog "renalnog Fanconi sindroma" - barem kod kongenitalnih poremećaja endolizosomalnog puta.¹Ovdje pokazujemo da alpelisib spašava apikalni endocitni kapacitet PT stanica in vitro i in vivo, zbog obnovljenih nivoa megalinskog receptora na plazma membrani. Ovaj efekat se ogleda u značajnom smanjenju urinarnog gubitka LMW proteina (CC16 i albumina) u Ocrl^Y/-miševi tretirani alpelisibom tokom 6 sedmica. Ovi efekti alpelisiba uočeni su kod m PTC-a, koji zadržavaju svoju apikalnu diferencijaciju i posebno su pogodni za istraživanje endocitoze posredovane receptorima u fiziologiji i bolesti.⁹ Konkretno, dobili smo m PTC-a iz humaniziranog mišjeg modela koji izražava ljudski INPP5B u Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/-pozadinu, koja nam omogućava da istražimo specifične posljedice gubitka OCRL aktivnosti.^11,23

Spašavanje endocitoze alpelisibom objašnjava se njegovim učinkom na aktinske mašinerije, što je jasno dokazano u OCRL KO HK2 ćelijama i m PTC. Naša zapažanja stoga potvrđuju i proširuju prethodne studije koje pokazuju vezu između kontrole ravnoteže fosfoinozitida i F-aktina u ranom endosomalnom putu kod OCRL pacijenata i KO ćelija.^7,10Funkcionalni gubitak OCRL aktivnosti narušava degradaciju PI(4,5)P2, što, zauzvrat, dovodi do neuspjeha u uklanjanju vezikula obloženih klatrinom, što rezultira aberantnim endosomskim organelama u različitim tipovima ćelija uključujući PT ćelije.^7-10Nedavno smo pokazali da višak F-aktina smanjuje reciklažu multiligandnog receptora megalina u apikalnu membranu PT ćelija, uzrokujući defektnu endocitozu i LMW proteinuriju.¹¹

Naši podaci ukazuju da mehanizam djelovanja alpelisiba na endosomalni aktin proizlazi iz bispecifičnog učinka inhibicije alpelisiba: prvo na proizvodnju PI(3,4,5)P3 i njegovu konverziju u PI(3)P, a drugo na proizvodnja PI(4,5)P2. Smanjenje nivoa PI(4,5)P2 direktno se suprotstavlja nedostatku OCRL i u skladu je s prethodnim radom na ublažavanju viška aktina i povećanju endocitnog efluksa smanjenjem nivoa fosfatidilinozitol 4-fosfat 5-kinaze , enzim koji stvara PI(4,5)P2.¹⁰Alpelisib ima 0.5 mM 50 posto inhibitornu koncentraciju na PI(4,5)P2 generirajuću kinazu PI4Kb, što može biti odgovorno, ili može biti rezultat općenitijih efekata na ravnotežu fosfoinozitida kao rezultat kombinacije OCRL KO i alpelisib tretman. Identifikovali smo da klasa IA PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibicija alpelisibom je relevantna za inhibiciju aktina jer smanjenje p110a posredovano siRNA inhibira akumulaciju aktina slično liječenju alpelisibom i kopanlisibom (za koji nije prijavljeno da inhibira PI4Ks). U RPE ćelijama smo prethodno uočili da siRNA INPP4A, koja pretvara PI(3,4)P2 u PI(3)P, inhibira sklapanje aktina u OCRL KO ćelijama, obezbeđujući put od inhibicije PI(3,4,5) Proizvodnja P3 do smanjenja endosomskog PI(3)P. Pokazali smo da ostaje nešto PI(3)P, vjerovatno grupa proizvedena na ranom endosomu od strane klase III PI3K, Vps34, jer smo otkrili da je endosomalni promet poboljšan, a ne potisnut tretmanom alpelisibom. Kompleksna koregulacija metabolizma PI i njegova važnost za inaktivaciju OCRL također je naglašena u nedavnoj studiji u kojoj nekatalitičke funkcije fosfoinozitid 3- fosfataze PTEN aktiviraju degradaciju PI(4,5)P2 putem PLCXD, ublažavajući ćelijski fenotip apsorpcije ligandi u modelu zebrice.³¹

Ublažavanje fenotipa aktina smanjenim nivoima PI(4,5)P2 i PI(3)P tretmanom alpelisibom slaže se sa sinergističkim djelovanjem PI(4,5)P2 i PI(3)P u regrutovanju SNX9 za aktivaciju aktin mašinerija na endosomima Ocrl,¹⁴što sugerira vrlo efikasno podudaranje specifičnosti alpelisiba za manipuliranje molekularnom regulacijom aktivacije aktina na endosomima. Zauzvrat, kao što je prethodno pokazano, smanjeno sastavljanje endosomalnog aktina, zauzvrat, dovodi do poboljšanja PT endocitoze u ćelijama sa nedostatkom OCRL.¹⁰Dalja karakterizacija će biti potrebna kako bi se bolje razumjelo da li je regulacija aktina putem metabolizma fosfoinozitida pravi izvor terapeutskog efekta koji opažamo kod alpelisiba u Ocrl-u.^Y/-model miša. Jer klasa I PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)reguliraju puteve koji kontroliraju rast stanica, proliferaciju, preživljavanje, metabolizam i autofagiju,³²ne možemo isključiti da je endocitno spašavanje posljedica direktnog djelovanja na PI(3,4,5)P3 i kombinovanog efekta na druge puteve modulirane PI3K klase I. Takođe je potrebno više rada da se testira da li PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitori takođe mogu ublažiti neurološke i druge kliničke manifestacije pacijenata koji imaju OCRL mutacije.⁴

Nedavno iskustvo s alpelisibom kod pedijatrijskih pacijenata sa PROS/CLOVES sindromom sugerira da lijek ima potencijal da se dobro podnosi. Alpelisib se uzima oralno, selektivno cilja na izoformu PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)klase I, i pokazuje manji profil toksičnosti u poređenju sa pan-PI3K inhibitorima. Kako alpelisib ne blokira u potpunosti PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)aktivnosti, čime se održavaju funkcije signalnog puta, može biti posebno pogodan za dugotrajnu upotrebu. Zanimljivo je da se hiperglikemija koja nastaje upotrebom alpelisiba može izbjeći promjenama u ishrani.²²Budući da je PT disfunkcija prva manifestacija bubrežne bolesti uočena kod male novorođenčadi s Dent-ovom bolešću 2 i Loweovim sindromom, rano liječenje takve PT disfunkcije, što dovodi do poboljšanja metaboličkog profila i rasta, može stoga usporiti progresiju do kronične bolesti bubrega i stoga imati značajan uticaj na životni vijek i kvalitetu života.³³Iako su manifestacije bolesti OCRL mutacije posebno široke, nedavne studije zasnovane na velikoj kohorti genotipiziranih pacijenata sa Loweovim sindromom Dentove bolesti 2 nisu dokazale značajne efekte tipa mutacije ili lokacije mutacije na preživljavanje bubrega.³⁴Zajedno, naši podaci ističu potencijal za prenamjenu alpelisiba za liječenje PT disfunkcije kod Loweovog sindroma/Dentove bolesti 2, čime se pruža osnova za brzu i isplativu primjenu u kliničkim ispitivanjima na ljudima.

3. METODE

3.1 Potpuni detalji mogu se naći u Dodatnim metodama.

HK2 ćelije su tretirane kopanlisibom, alpelisibom, GSK2636771 ili idelalisibom u naznačenim koncentracijama tokom 16 sati osim ako nije drugačije navedeno. Proteini su ekstrahovani standardnim metodama iz ćelija ili tkiva bubrega, a Western blotting je izveden korišćenjem objavljenih ili komercijalno dostupnih antitela. Nokdaun siRNA je izveden pomoću 2 transfekcije 72 i 24 sata prije analize. Koristili smo OcrlY/þ; Inpp5b^{- /-}; i Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/- mišje leglo koje nose ekspresiju BAC-INPP5B. Primarne kulture m PTC generisane su iz bubrega sakupljenih od 8 sedmica starih Ocrl miševa, a endocitni kapacitet Oral m PTC je procijenjen mjerenjem unosa albumina. Tretmani Alpelisibom bili su 10 mM tokom 16 sati osim ako nije drugačije navedeno. Upijanje albumina u m PTC je procijenjeno korištenjem "pulse-chase" protokola za procjenu apikalnog vezivanja i rezultirajućeg unosa. m PTC su obojeni preko noći odgovarajućim primarnim antitijelima i 45 minuta odgovarajućim sekundarnim antitijelima konjugiranim sa FL fluoroforom i/ili Alexa{9}} faloidinom. PI(3)P bojenje na m PTC-a izvedeno je pomoću FYVE domenske sonde. Analiza slike je izvedena pomoću CellProfifiler-a, koristeći prilagođene cevovode za mjerenje aktin/EEA1 preklapanja i broja punkta, i sa ImageJ za mjerenje intenziteta imunofluorescencije i otkrivenih rubova za izračunavanje rezultata stresnih vlakana. Kvantitativni podaci su izraženi kao srednja vrijednost±standardna greška srednje vrijednosti. Za in vivo eksperimente, miševi stari 6 sedmica tretirani su vehikulom ili alpelisibom 50 mg/kg tjelesne težine. Urin je sakupljan svakih 14 dana, a životinje su žrtvovane nakon 42 dana tretmana, uz vađenje krvi i bubrega. PT endocitni kapacitet oralnih miševa ispitan je mjerenjem unosa b-laktoglobulina.

4. OTKRIVANJE

JLG ima sredstva od AstraZeneca za studente u njenoj laboratoriji. SPJ je u savjetodavnim odborima i ima vlasnički kapital u kompanijama Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics i Adrestia Therapeutics, te je naučni partner za Ahren Innovation Capital. Svi ostali autori su se izjasnili da nema suprotstavljenih interesa.

5. ZAHVALNICE

Ovaj rad je podržan od strane Europskog istraživačkog vijeća Grant 281971, Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, Wellcome Trust Trust Developing Concept Fund 209749/Z/17/18, Grant za istraživanje Newton Isa. (j) JLG-u i Wellcome Investigator Award 206388/Z/17/Z SPJ-u, i priznajemo finansiranje Gurdon Instituta od Wellcome Trust-a (092096) i CRUK-a (C6946/A14492). Zahvalni smo Fondaciji za istraživanje cistinoze (Irvine, Kalifornija), Švicarskoj nacionalnoj naučnoj fondaciji (grant za projekat 310030_189044), programu prioritetnih kliničkih istraživanja (KFSP) RADIZ (Inicijativa za rijetke bolesti Zurich) UZH-a, Švicarskoj

Nacionalni centar kompetentnosti u istraživanju (NCCR) bubrežna kontrola homeostaze (Kidney.CH) za podršku, te NIDDK/NIH i Lowe Syndrome Trust/UK za podršku razvoju oralnih miševa. Zahvaljujemo Robertu L. Nussbaumu (Invitae Corporation i UCSF, San Francisco, Kalifornija) i Maria Antonietta De Matteis (Telethon institut za genetiku i medicinu, Univerzitet Federico II Napulj, Napulj, Italija) za osnivanje kolonije Oral miša;

i Eric Olinger (UZH, Cirih) za plodne diskusije. Zahvaljujemo Nadine Näegele i Danieli Nieri na pružanju tehničke pomoći tokom prikupljanja i analize urina; Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Pariz) za podelu sa nama detaljnog protokola za pripremu Alpelisiba za in vivo tretman; i Renata Kozyraki i Pierre Verroust za obezbjeđivanje reagensa. Takođe se zahvaljujemo Centru za mikroskopiju i analizu slike Univerziteta u Cirihu (Cirih, Švajcarska) i ustanovi za integrativnu fiziologiju glodara u Cirihu (ZIRP) za obezbeđivanje opreme za akviziciju slike i tehničku podršku tokom in vivo eksperimenata.

Kako se inhibitor fosfoinozitid 3-kinaze alpelisib koristi za Loweov sindrom/Dentovu bolest?

6. DODATNI MATERIJAL

Dodatni fajl (PDF)

Dopunske metode i reference.

Tabela S1. Parametri tjelesne težine, urina i krvi tijekom vremena kod oralnih miševa liječenih alpelisibom ili vehikulom.

Slika S1. ekspresija izoforme p110 i testovi citotoksičnosti doza-odgovor lijeka u HK2 stanicama.

Slika 2. PI3Kinhibitor alpelisibobnavlja aktin-endosomalno preklapanje i smanjuje nivoe PI(3)P na način koji ovisi o dozi 4 sata nakon liječenja lijekom u HK2 stanicama.

Slika S3. Ekspresija izoforme p110 i toksičnost alpelisiba u Ocrl mPTC.

Slika S4. Tok rada analize preklapanja EEA1/aktina u Ocrl mPTC-ovima.

Slika S5. Alpelisib vraća unos albumina u Ocrl^Y/-mPTCs. Aqp1 ekspresija je nepromijenjena. Dodatni fajl (filmovi)

Film S1. Imaris 3D prikaz preklapanja EEA1/aktina u OcrlY/þ mPTC-ima tretiranim DMSO. Reprezentativno 3D prikazivanje površine konfokalnog hrpa OcrlY/þ mPTC-a tretiranih DMSO 16 sati, a zatim fiksiranih fiksom od 4 posto formaldehida i imuno označenih za EEA1 (ljubičasta), aktin (faloidin; žuta) i DAPI (plava), ilustrujući malo aktin/endosomalna asocijacija. Šipka =5 mm.

Film S2. Imaris 3D prikaz preklapanja EEA1/aktina u Ocrl^Y/-mPTC tretirani DMSO. Reprezentativno 3D prikazivanje površine konfokalnog hrpa OcrlY/– mPTC-a tretiranih DMSO-om 16 sati, a zatim fiksiranih fiksom od 4 posto formaldehida i imuno označenih za EEA1 (ljubičasta), aktin (faloidin; žuta) i DAPI (plava), ilustrujući punktat aktin koji se povezuje u blizini endosomalnih struktura. Bar{4}}mm.

Film S3. Imaris 3D prikaz preklapanja EEA1/aktina u Ocrl^Y/- mPTC liječeni alpelisibom. Reprezentativno 3D prikazivanje površine konfokalne grupe OcrlY/– mPTC-a tretiranih sa 10 mM alpelisiba 16 sati, a zatim fiksiranih fiksom od 4 posto formaldehida i imunoobilježenih za EEA1 (ljubičasta), aktin (faloidin; žuta) i DAPI (plava) , ilustrujući spašavanje aktinskih punktatnih struktura oko endosoma. Šipka =5 mm.

REFERENCE

1. van der Wijst J, Belge H, Bindels RJM, Devuyst O. Učenje fiziologije iz nasljednih poremećaja bubrega. Physiol Rev. 2019;99:1575–1653.

2. Loi M. Lowe sindrom. Orphanet J Rare Dis. 2006;1:16.

3. Lewis RA, Nussbaum RL, Brewer ED. Lowe sindrom. U: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., ur. GeneReviews® [internet]. Seattle (WA): Univerzitet Washington, Seattle; 1993-2020. Dostupno na: HTTPS:// www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/. Objavljeno 24. jula 2001; Ažurirano 18. aprila 2019. Pristupljeno 8. avgusta 2019.

4. De Matteis MA, Staiano L, Emma F, Devuyst O. 5-fosfataza OCRL uLowe sindrom i Dentova bolest2. Nat Rev Nephrol. 2017;13: 455–470.

5. Devuyst O, Luciani A. Transporteri hlorida i endocitoza posredovana receptorima u proksimalnom tubulu bubrega. J Physiol. 2015;593:4151–4164.

6. Zhang X, Jefferson AB, Auethavekiat V, Majerus PW. Deficit proteina kod Loweovog sindroma je fosfatidilinozitol-4,5-bisfosfat 5- fosfataza. Proc Natl Acad Sci US A. 1995;92:4853–4856.

7. Nández R, Balkin DM, Messa M, et al. Uloga OCRL-a u dinamici jama obloženih klatrinom i odstranjivanju prevlake otkrivena studijama ćelija Loweovog sindroma. eLife. 2014;3:e02975.

8. Mehta ZB, Pietka G, Lowe M. Ćelijske i fiziološke funkcije proteina OCRL1 Loweovog sindroma. Saobraćaj. 2014;15:471–487.

9. De Leo MG, Staiano L, Vicinanza M, et al. Fuzija autofagozom-lizozom pokreće lizosomalni odgovor posredovan TLR9 i kontroliran OCRL. Nat Cell Biol. 2016;18:839–850.

10. Vicinanza M, Di Campli A, Polishchuk E, et al. OCRL kontroliše promet kroz rane endozome putem PtdIns4,5P(2) zavisne regulacije endosomalnog aktina. EMBO J. 2011;30:4970–4985.

11. Festa BP, Borquez M, Gassama A, et al. Nedostatak OCRL narušava endolizozomalnu funkciju u humaniziranom mišjem modelu zaLowe sindrom i Dentova bolest. Hum Mol Genet. 2019;28:1931–1946.

12. Welch HC, Coldwell WJ, Ellson CD, et al. P-Rex1, PtdIns(3,4,5)P3- i Gbetagamma-regulisani faktor zamjene guanin-nukleotida za Rac. Cell. 2002;108:809–821.

13. Galop JL, Walrant A, Cantley LC, Kirschner MW. Fosfoinozitidi i zakrivljenost membrane mijenjaju način polimerizacije aktina putem selektivnog regrutiranja Toca-1 i Snx9. Proc Natl Acad Sci US A. 2013;110:7193–7198.

14. Datum F, Nalog A, Holst MR, et al. Kontrola polimerizacije aktina putem koincidencije fosfoinozitida i visoke zakrivljenosti membrane. J Cell Biol. 2017;216:3745–3765.

15. Malek M, Kielkowska A, Chessa T, et al. PTEN reguliše PI(3,4)P2 signalizaciju nizvodno od klase I PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza). Mol Cell. 2017;68:566–580.e510.

16. Gillooly DJ, Morrow IC, Lindsay M, et al. Lokalizacija fosfatidilinozitol 3-fosfata u ćelijama kvasca i sisara. EMBO J. 2000;19:4577–4588.

17. Fruman DA, Chiu H, Hopkins BD, et al. PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)put u ljudskoj bolesti. Cell. 2017;170:605–635.

18. Liu N, Rowley BR, Bull CO, et al. BAY 80-6946 je visoko selektivan intravenski PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibitor sa snažnim p110alfa i p110delta aktivnostima u tumorskim ćelijskim linijama i modelima ksenotransplantata. Mol Cancer Ther. 2013;12:2319–2330.

19. Fritsch C, Huang A, Chatenay-Rivauday C, et al. Karakterizacija romana i specifični PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)alfa inhibitor NVP-BYL719 i razvoj strategije stratifikacije pacijenata za klinička ispitivanja. Mol Cancer Ther. 2014;13:1117–1129.

20. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA, et al. Otkriće NVP-BYL719, snažnog i selektivnog inhibitora fosfatidilinozitol-3 alfa kinaze odabranog za kliničku procjenu. Bioorg Med Chem Lett. 2013;23:3741–3748.

21. Andre F, Ciruelos E, Rubovszky G, et al. Alpelisib za uznapredovali karcinom dojke s PIK3CA mutiranim, hormonski pozitivnim receptorima. N Engl J Med. 2019;380:1929–1940.

22. Venot Q, Blanc T, Rabia SH, et al. Ciljana terapija kod pacijenata sa PIK3CA sindromom prekomjernog rasta. Priroda. 2018;558:540–546.

23. Bothwell SP, Chan E, Bernardini IM, et al. Mišji model za bubrežnu tubulopatiju Lowe sindrom/Dent Disease 2. J Am Soc Nephrol. 2011;22: 443–448.

24. Chen R, Kang VH, Chen J, et al. Monoklonsko antitijelo za vizualizaciju PtdIns(3,4,5)P(3) u stanicama. J Histochem Cytochem. 2002;50:697–708.

25. Hammond GR, Schiavo G, Irvine RF. Imunocitokemijske tehnike otkrivaju višestruke, različite ćelijske grupe PtdIns4P i PtdIns(4,5)P(2). Biochem J. 2009;422:23–35.

26. He K, Marsland R III, Upadhyayula S, et al. Dinamika konverzije fosfoinozitida u endocitnom prometu posredovanom klatrinom. Priroda. 2017;552:410–414.

27. Bilanges B, Poor Y, Vanhaesebroeck B. PI3K(fosfoinozitid 3-kinaza)izoforme u ćelijskoj signalizaciji i prometu vezikula. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20:515–534.

28. Montjean R, Aoidi R, Desbois P, et al. OCRL-mutirani fibroblasti pacijenata sa Dent-2 bolešću pokazuju INPP5B nezavisnu fenotipsku varijabilnost u odnosu na ćelije Loweovog sindroma. Hum Mol Genet. 2015;24: 994–1006.

29. Suchy SF, Nussbaum RL. Nedostatak PIP2 5-fosfataze kod Loweovog sindroma utiče na polimerizaciju aktina. Am J Hum Genet. 2002;71:1420–1427.

30. Mizrachi A, Shamay Y, Shah J, et al. PI3K specifičan za tumor(fosfoinozitid 3-kinaza)inhibicija putem nanočestica ciljane isporuke u karcinomu skvamoznih ćelija glave i vrata. Nat Commun. 2017;8:14292.

31. Mondin VE, Ben El Kadhi K, Cauvin C, et al. PTEN reducira endosomalni PtdIns(4,5)P2 na način nezavisan od fosfataze putem PLC puta. J Cell Biol. 2019;218:2198–2214.

32. Jean S, Kiger AA. Koordinacija između regulacije i funkcija RAB GTPaze i fosfoinozitida. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012;13: 463–470. 33. Devuyst O, Knoers NV, Remuzzi G, et al. Rijetke nasljedne bolesti bubrega: izazovi, mogućnosti i perspektive. Lancet. 2014;383: 1844–1859. 34. Zanies M, Bokenkamp A, Kolb M, et al. Dugoročni bubrežni ishod kod djece s OCRL mutacijama: retrospektivna analiza velike međunarodne kohorte. Transplantacija Nephrol Dial. 2018;33:85–94.

Od: Kidney International (2020) 98, 883–896; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.040

Autorska prava ª 2020, Međunarodno društvo za nefrologiju. Objavio Elsevier Inc. Ovo je članak otvorenog pristupa pod licencom CC BY (HTTP:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Institut, Univerzitet u Cambridgeu, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QN, UK. E-mail: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; ili Olivier Devuyst, Institut za fiziologiju, Univerzitet u Cirihu, Cirih, Švajcarska. E-mail: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ Ovi autori su podjednako doprinijeli ovom radu.⁶Ovi autori su korežirali studiju. Primljeno 8. avgusta 2019.; revidirano 1. maja 2020.; prihvaćeno 15. maja 2020; objavljeno online 9. septembra 2020