Feniletanoidni glikozidi indukuju apoptozu u Eca-109 ćelijama putem puta koji zavisi od mitohondrija

Uvod

Rak jednjaka je jedan od najčešćih tipova karcinoma sa 11. najvećom stopom morbiditeta i 6. najvećom stopom mortaliteta na globalnom nivou, i izazvao je oko 439,000 smrtnih slučajeva u 2015. Učestalost raka jednjaka značajno varira među različitim regijama, sa istočnim Azija i istočna i južna Afrika pokazuju najveće stope incidencije i zapadna Afrika koja pokazuje najniže stope u 2012. U Kini, procijenjeni slučajevi raka jednjaka i smrtnost bili su 477,000 i 375,000, respektivno , u 2015. godini. Iako se stopa morbiditeta od raka jednjaka smanjila u zemljama srednjeg i visokog srednjeg sociodemografskog indeksa između 2005. i 2015. godine, stopa mortaliteta ostaje visoka zbog loše prognoze. Kombinacija kirurške resekcije s kemoterapijom ili radioterapijom korištena je za liječenje raka jednjaka, međutim, zabilježeno je da je između 2003. i 2014. godine 5-godišnja stopa preživljavanja ostala<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studypokazao toCistanche tubulosa feniletanoidni glikozidi(CTPG) može suzbiti rast ćelija melanoma B16-F10 in vitro i in vivo (24). Međutim, loša rastvorljivost CTPG-a u vodi koji je prethodno korišten ograničava razvoj lijeka. Zbog toga je korišćen CTPG rastvorljiv u vodi (CTPG-W) i istražen je antitumorski efekat na ćelije raka jednjaka (Eca-109). Utvrđeno je da CTPG-W može dozno-zavisno inhibirati vitalnost Eca-109 ćelija kroz indukciju apoptoze putem mitohondrijalnog puta.

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materijali i metode

Životinje.

Ženke C57BL/6 miševa (6-8 sedmica, ~25 g) kupljene su od Pekinškog laboratorijskog istraživačkog centra za životinje (Peking, Kina) i smještene u kontroliranu temperaturu (25˚C), lagani ciklus (12/ 12) Ustanova za životinje Univerziteta Xinjiang (Urumqi, Kina). Sve životinje su dobile vodu i hranu bez patogena.

Ćelijska linija i kultura.

Ćelijska linija humanog karcinoma jednjaka (Eca-109) sačuvana je u Ključnoj laboratoriji za biološke resurse i genetičko inženjerstvo Xinjianga (Koledž prirodnih nauka i tehnologije, Univerzitet Xinjiang, Urumqi, Kina) i uzgajana u RPMI{{1} } medijum (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SAD) sa dodatkom 10% toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Kina), 1% L -glutamin (100 mM), 100 U/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina na 37˚C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO2.

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC).

CTPG-W (kat. br. SGJG20170410) je kupljen od Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Šangaj, Kina). Glavna jedinjenja CTPG-a su kvalifikovana i kvantifikovana pomoću HPLC prema našoj prethodnoj studiji (24). Ukratko, HPLC je sprovedena na ZORBAX SB-C18 koloni (250x4,6 mm; 5 µm) na 30˚C i eluirana sa 0,2% rastvorom mravlje kiseline i gradijentom metanola počevši od 23%, pošto je dodavan 1 ml svake minute 45 min dok ne dostigne 31%. Ukupno 10 µl uzorka je ubrizgano i detektovano na 330 nm. Standard ehinakozida je kupljen od Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Šangaj, Kina), a standard akteozida je kupljen od Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka). Standardi su korišteni za analizu komponenti CTPG-W.

MTT test.

Proliferacija ćelija je merena MTT testom. Eca{{0}} ćelije su inokulirane u 96-jažice u gustini od 5x103 ćelije u 100 µl RPMI{{5 }} medijum/bunarić i kultivisan na 37˚C tokom 24 h, zatim tretiran različitim koncentracijama (0, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) CTPG-W ili 0,4% dimetil sulfoksida (DMSO) tokom 24, 48 i 72 h. DMSO je korišten kao kontrola rastvarača (800 µg/ml CTPG-W koji sadrži 0,4% DMSO). Kao pozitivna kontrola korišten je cisplatin (20 µg/ml). Nakon toga, supernatant je odbačen nakon centrifugiranja na 225 xg tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi i 100 µl MTT rastvora (0,5 mg/ml u RPMI-1640 mediju bez FBS) je dodat u svaku jažicu i inkubiran na 37°C tokom 3 h. Formirani kristali formazana su otopljeni u 200 µl DMSO. Vrijednosti optičke gustine (OD) mjerene su na talasnoj dužini od 490 nm pomoću 96-čitača mikroploča (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Kalifornija, SAD). Relativna vitalnost ćelija izračunata je prema formuli: Vijabilnost ćelije (%)=(ODtretirano/ODnetretirano)x100%. Morfologija Eca‑109 ćelija je posmatrana invertovanim fluorescentnim mikroskopom (uvećanje, x200) (Nikon Eclipse Ti‑E; Nikon Corporation, Tokio, Japan).

Za proliferaciju splenocita, miševi C57BL/6 su eutanazirani dislokacijom grlića materice, a slezine su izolirane. Napravljena je jednoćelijska suspenzija i splenociti su zasijani u 96-jažice u gustini od 1x105 ćelija/jažici u 100 µl RPMI-1640 medijuma, a zatim tretirani različitim koncentracijama (0, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) CTPG-W tokom 24, 48 i 72 h na 37˚C sa 5% CO2. Proliferacija splenocita je mjerena MTT testom, prema gore navedenom protokolu. Stimulatorni indeks=ODtreated/ODuntreated.

Mjerenje apoptoze i ćelijskog ciklusa. Eca{{0}} ćelije su kultivisane u posudama od 60 mm pri gustini 2,5x105 ćelija po posudi tokom 24 h i tretirane različitim koncentracijama ({{31} }, 200, 400, 600 i 800 µg/ml) CTPG-W ili 0,4% DMSO tokom 24 h na 37˚C sa 5% CO2. Ćelije su sakupljene i obojene kompletom za otkrivanje apoptoze Aneksin V-fluorescein izotiocijanat (FITC)/Propidijum jodid (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Šangaj, Kina), prema protokolima proizvođača. Uzorci su prikupljeni protočnom citometrijom (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SAD) i analizirani pomoću FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, SAD). Da bi se analizirao efekat CTPG-W na ćelijski ciklus, 2,5x105 Eca-109 ćelija je zasejano u posude za kulturu od 60 mm i tretirano sa CTPG-W (0, 100, 200 i 400 µg/ml) ili 0,4 % DMSO tokom 24 h na 37˚C sa 5% CO2. Sve ćelije su sakupljene i isprane dva puta ledeno hladnim PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), zatim fiksirane u 70% ledeno hladnom etanolu na 4˚C tokom 30 minuta. Nakon dva puta ispiranja ledeno hladnim PBS-om, ćelije su resuspendirane u 300 µl PI/RNase pufera za bojenje (BD Biosciences, San Jose, CA, SAD) 10 minuta na sobnoj temperaturi. Distribucija ćelijskog ciklusa je analizirana pomoću softvera ModFit LT 3.0 protočnom citometrijom (BD FACSCalibur).

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSAAnti FatigueZaštita jetre PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analiza potencijala mitohondrijske membrane (Δψm) i reaktivnih vrsta kiseonika (ROS).Za analizu Δψm, Eca{{0}} ćelije su tretirane sa CTPG-W (0, 400, 600 i 800 µg/ml) ili 0,4% DMSO za 24 h na 37˚C sa 5% CO2 i obojeno kompletom za analizu potencijala mitohondrijske membrane sa JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Šangaj, Kina), prema protokolu proizvođača, 20 minuta na 37˚ C. Nakon dva puta ispiranja sa JC-1 puferom za ispiranje (Beyotime Institute of Biotechnology), uzorci su resuspendirani sa 300 µl JC-1 pufera za ispiranje i analizirani protočnom citometrijom (BD FACSCalibur). Fluorescencija boje JC‑1 u ćelijama Eca‑109 takođe je uočena pomoću invertovanog fluorescentnog mikroskopa (uvećanje, x200; Nikon Eclipse Ti‑E). Za analizu ROS, Eca{21}} ćelije su tretirane sa CTPG-W (0, 400, 600 i 800 µg/ml) tokom 2, 4, 6, 12 i 24 h i obojene testom reaktivnog kiseonika komplet (Beyotime Institute of Biotechnology), prema protokolu proizvođača, 20 min na 37˚C. Nakon tri puta ispiranja ledeno hladnim PBS-om, uzorci su sakupljeni protočnom citometrijom (BD FACSCalibur) i analizirani softverom FlowJo 7.6.

Slika 1. Kvalificirana kontrola CTPG-W. Komponente CTPG-W su kvalitativno i kvantitativno analizirane tečnom hromatografijom visokih performansi i upoređene sa standardima ehinakozida i akteozida. CTPG-W, feniletanoidni glikozidi rastvorljivi u vodiC. tubulosa.

2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) aktivnost uklanjanja radikala. Aktivnost uklanjanja slobodnih radikala CTPG-W određena je DPPH testom slobodnih radikala prema objavljenom protokolu uz manju modifikaciju, jer je metanol zamijenjen etanolom kako bi se rastvorio DPPH (25,26). Za mjerenja u stabilnom stanju, 150 µl DPPH (100 mmol/l) u etanolu je pomiješano sa različitim koncentracijama CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 i 600 µg/ml) u 50 µl PBS, i inkubirano u mraku 30 minuta na sobnoj temperaturi. Apsorbancija na 517 nm je detektirana u prisustvu i odsustvu CTPG-W. Kao pozitivna kontrola korišteno je ukupno 50 µl vitamina C. Aktivnost uklanjanja radikala DPPH izračunata je korištenjem formule: Čišćenje (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, gdje je Ablank apsorbanca kontrole (bez DPPH), Asample je apsorbancija uzorka i A0 je apsorbancija PBS sa DPPH.

Western blot analiza. Eca{{0}} ćelije su tretirane sa CTPG-W (0, 200, 600 µg/ml) ili 0,4% DMSO tokom 24 h na 37˚C sa 5% CO2. Sledeće pranje dva puta sa PBS, ćelije 

Slika 2. Efekat CTPG-W na rast Eca-109 ćelija i splenocita. (A) Eca-109 ćelije su tretirane različitim koncentracijama CTPG-W tokom 24, 48 i 72 h, a zatim je vitalnost ćelija otkrivena MTT testom. (B) Morfološke promjene Eca-109 ćelija nakon tretmana CTPG-W u 24 h. (C) Splenociti C57BL/6 miševa su tretirani različitim koncentracijama CTPG-W tokom 24, 48 i 72 h, a zatim je proliferacija analizirana MTT testom.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

su lizirani u puferu za lizu radioimunoprecipitacije (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Peking, Kina) 20 minuta na ledu. Nakon centrifugiranja na 10,000 xg tokom 10 minuta na 4˚C, supernatanti su sakupljeni, a koncentracije proteina su detektovane kompletom bicinhoninske kiseline (Thermo Fisher Scientific, Inc.) prema protokolima proizvođača. Western blot analiza je provedena prema našem prethodnom opisu (24). Antitijela protiv kaspaze-7 (kat. br. D120077), kaspaze-8 (kat. br. D155240), kaspaze{10}} (kat. br. D220078), B-ćelijskog limfoma{ {13}} (Bcl-2)-povezani X (Bax) (kat. br. D220073) i Bcl-2 (kat. br. D260117), i anti-mišji IgG-peroksidaza hrena (HRP) ) (kat. br. D111050) i anti-zečji IgG-HRP (kat. br. D110058) kupljeni su od BBI Life Sciences (Šangaj, Kina). Antitijela protiv kaspaze-3 (kat. br. E-AB-10050) i aktivne kaspaze-3 (kat. br. E-AB-22115) kupljena su od Elabscience ( Wuhan, Kina). Ostala antitela protiv kaspaze-7 (kat. br. 9492), poli (ADP-riboza) polimeraze (PARP) (kat. br. 9542), citokroma c (kat. br. AC909), c-Jun NH{ {37}}terminalna kinaza (JNK) (kat. br. 9252S) i -aktin (kat. br. 58169) dobijeni su od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, SAD). Sva primarna i sekundarna antitijela su razrijeđena u omjeru 1:1,000. Primarna antitijela su inkubirana na 4˚C preko noći, a sekundarna antitijela su inkubirana na 37˚C 1 h.

Slika 3. Apoptoza Eca-109 ćelija izazvana CTPG-W. Ćelije su tretirane različitim koncentracijama CTPG-W tokom 24 h. (A) Apoptotične i nekrotične Eca-109 ćelije analizirane su protočnom citometrijom. Gornji panel prikazuje pojedinačne tačkice, a donji panel prikazuje zbirne podatke. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

Ciljni proteini su detektovani pomoću kompleta za ispitivanje poboljšane hemiluminiscencije (Beyotime Institute of Biotechnology), prema protokolu proizvođača.

Statistička analiza. Statistička značajnost je izračunata jednosmjernom analizom varijanse sa Tukeyjevim post hoc testom, a rezultati su analizirani korištenjem softvera GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornija, SAD) između tretirane i kontrolne grupe. Svi podaci su predstavljeni kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

EKSTRAKT CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE FUNKCIJE BUBREGA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultati

CTPG-W potiskuje rast Eca-109 ćelija.

Komponente CTPG-W su kvalifikovane i kvantifikovane pomoću HPLC (slika 1), koje su upoređene sa standardima ehinakozida i akteozida. Prema vršnim vremenima retencije i površinama pikova, CTPG-W je sadržavao 39,16% ehinakozida i 2,44% akteozida. Prvo, uticaj CTPG-W na vitalnost Eca-109 ćelija je određen MTT testom. CTPG-W je otopljen u DMSO na 200 mg/ml i razrijeđen sa RPMI-1640 medijumom koji sadrži 10% toplotno inaktiviranog FBS do naznačenih koncentracija. Eca{14}} ćelije su tretirane CTPG-W i vijabilnost ćelija je analizirana MTT testom u naznačenim vremenskim tačkama. Tretman CTPG-W značajno je smanjio vitalnost Eca-109 ćelija na način ovisan o dozi i vremenu (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Slika 4. Efekat CTPG-W na distribuciju ćelijskog ciklusa u Eca-109 ćelijama. Različite koncentracije CTPG-W korištene su za liječenje Eca-109 ćelija tokom 24 h, a distribucija ćelijskog ciklusa je analizirana protočnom citometrijom. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa.

CTPG-W inducira apoptozu u Eca-109 ćelijama. Da bi se ispitalo da li je CTPG-W potisnuo rast Eca-109 ćelija putem indukcije apoptoze ili nekroze, ćelije su tretirane različitim koncentracijama CTPG-W. Nakon 24 h, apoptoza i nekroza Eca-109 ćelija su otkrivene bojenjem Aneksinom V/PI. Kao što je prikazano na slici 3A, ćelije Aneksina V- /PI+ su zatvorene kao nekrotične ćelije, a Aneksin V+ /PI+ i Aneksin V+ /PI- ćelije su zatvorene kao apoptotičke ćelije. CTPG-W primarno je inducirao apoptozu Eca-109 ćelija na način ovisan o dozi, iako su se i nekrotične Eca{16}} ćelije značajno povećale pod tretmanom 600 i 800 µg/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W izaziva zaustavljanje ćelijskog ciklusa u S fazi u Eca-109 ćelijama. Poremećaj ćelijskog ciklusa raka će potisnuti rast ćelija i promovisati apoptozu (27). Distribucija ćelijskog ciklusa u Eca-109 ćelijama je otkrivena PI bojenjem nakon tretmana CTPG-W tokom 24 h. Uočeno je da su se ćelije u S fazi povećale, a da su ćelije u G0/G1 fazama pokazale ukupno značajno smanjenje nakon tretmana CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG‑W smanjuje Δψm i inducira oslobađanje citokroma c. Apoptoza se može inducirati mitohondrijalno zavisnim putem (28,29). Pro- i anti-apoptotički članovi porodice BCL-2 proteina imaju važnu ulogu u regulaciji integriteta mitohondrijalne membrane (30,31). Nakon tretmana CTPG-W tokom 24 h, Δψm je procijenjen korištenjem bojenja JC-1. JC-1 agregat (crvena fluorescencija otkrivena u FL-2) će se raspasti u monomer (zelena fluorescencija otkrivena u FL-1) kada se Δψm smanjuje (32). Kao što je prikazano na slici 5A, frekvencije FL-1+ FL-2-/+ ćelija su se značajno povećale na način ovisan o dozi, što ukazuje da se Δψm ćelija Eca-109 smanjio. Promjene fluorescencije u Eca-109 ćelijama također su uočene pomoću invertovanog fluorescentnog mikroskopa (slika 5B). S povećanjem koncentracije CTPG-W, crvena fluorescencija se smanjila, a zelena povećala, što je u skladu s podacima iz protočne citometrije. Takođe je uočeno da je nivo citokroma c u citosolu značajno povećan (slika 5C), što je rezultat smanjenja Δψm. Ovo potvrđuje zaključak izvučen iz povećanog broja FL-1+ FL-2-/+ ćelija da se Δψm smanjio kao rezultat tretmana CTPG-W. Prijavljeno je da JNK može regulisati aktivaciju porodice proteina BCL-2 izazivajući oslobađanje citokroma c (33-35). Takođe je utvrđeno da je nivo JNK značajno povećan nakon tretmana CTPG-W (slika 5C). Rezultati su pokazali da CTPG-W može inducirati apoptozu Eca-109 ćelija putem mitohondrijski zavisnog puta.

Slika 5. Smanjenje Δψm i povećanje citokroma c i JNK. Eca{1}} ćelije su tretirane različitim koncentracijama CTPG-W tokom 24 h. (A) Δψm je detektovan JC‑1 bojenjem, a uzorci su analizirani protočnom citometrijom. Pojedinačne tačkice prikazuju promjene u fluorescenciji JC‑1. Frekvencije FL-1+ FL-2-/+ ćelija su prikazane u donjem panelu. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Slika 6. Nivoi ROS u Eca-109 ćelijama nakon tretmana CTPG-W i antioksidativna aktivnost CTPG-W. (A) Eca{4}} ćelije su tretirane različitim koncentracijama CTPG-W i nivoi ROS su analizirani protočnom citometrijom u naznačenim vremenskim tačkama. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Učinak CTPG-W na intracelularno stvaranje ROS.ROS bi mogao smanjiti Δψm kako bi inducirao apoptozu (36). Da bi se istražilo može li CTPG-W povećati proizvodnju ROS, Eca-109 ćelije su tretirane različitim koncentracijama CTPG-W. Ćelije su sakupljene u naznačenim vremenskim tačkama i obojene sa DCFH-DA. Proizvodnja intracelularnih ROS u Eca-109 ćelijama određena je protočnom citometrijom. Kao što je prikazano na slici 6A, 800 µg/ml CTPG-W značajno je povećalo proizvodnju ROS od 2-6 h, a smanjilo se sa 12-24 h. Dodatno, 400 µg/ml CTPG-W značajno povećava proizvodnju ROS-a od 12-24 h. Nadalje, 200 µg/ml CTPG-W nije značajno promijenio proizvodnju ROS. Dinamičke promjene u proizvodnji ROS mogu biti povezane s apoptozom Eca{15}} ćelija. Također je utvrđeno da CTPG-W ima aktivnost uklanjanja slobodnih radikala (slika 6B), što može biti povezano sa smanjenom proizvodnjom ROS u Eca-109 ćelijama tretiranim sa 800 µg/ml CTPG-W nakon 12 h.

Slika 7. Nivoi cijepanih kaspaza i cijepanih-PARP nakon tretmana CTPG-W. Proteini su izolovani iz ćelija Eca-109 tretiranih CTPG-W tokom 24 h, a nivoi cijepanih kaspaza i cijepanih-PARP su detektovani Western blot analizom. DMSO, dimetil sulfoksid; CTPG-W, feniletanoidni glikozidi rastvorljivi u vodiC. tubulosa; PARP, poli (ADP-riboza) polimeraza.

CTPG-W pojačava aktivnost kaspaze-3, kaspaze-7, kaspaze-9 i PARP. Oslobađanje citokroma c zbog redukcije Δψm moglo bi aktivirati proteaze kaspaze da induciraju apoptozu (29,30,37). Nakon tretmana CTPG-W tokom 24 h, aktivacija kaspaze-3, 7, 8, 9 i PARP otkrivena je Western blot analizom. U poređenju sa kontrolom, nivoi cijepane kaspaze-9, cijepane kaspaze-7, cijepane kaspaze-3 i cijepane-PARP, ali ne i nivoa cijepane kaspaze{{20 }}, regulisali su CTPG tretman na način koji zavisi od doze (slika 7). Ovi rezultati su pokazali da CTPG-W smanjuje Δψm i potiče oslobađanje citokroma c da aktivira kaspaze koje indukuju apoptozu Eca-109 ćelija.

Diskusija

Tradicionalni CHM bi mogao inducirati apoptozu ćelija raka jednjaka kroz različite puteve, uključujući receptore ekstrinzične smrti i intrinzične puteve stresa mitohondrijalnog i endoplazmatskog retikuluma (29). Naša prethodna studija je pokazala da CTPG, kao glavna komponenta C. tubulosa, inhibira rast ćelija melanoma B16-F10 kroz indukciju apoptoze putem mitohondrijalnog puta (24). U ovoj studiji istražen je antitumorski efekat CTPG-W na Eca-109 ćelije i utvrđeno je da CTPG-W potiskuje rast Eca{8}} ćelija, izaziva apoptozu i zaustavljanje ćelijskog ciklusa, smanjen Δψm, povećano oslobađanje citokroma c i aktivirane kaspaze. CTPG i CTPG-W mogu izazvati apoptozu i zaustavljanje ćelijskog ciklusa u ćelijama raka. Međutim, tačni mehanizmi su različiti zbog različitih komponenti CTPG-a (26,64% ehinakozida, 10,19% akteozida i 1,71% izoakteozida) i CTPG-W (39,16% ehinakozida i 2,44% akteozida). CTPG je zaustavio B16-F10 ćelije u G0/G1 fazama, ali CTPG-W je zaustavio Eca{26}} ćelije u S fazi (24). Proizvodnja ROS je bila dozno-zavisno povećana CTPG-om, ali je ukazivala na promjenu na način ovisan o vremenu visokom dozom CTPG-W, koja se značajno povećala na početku liječenja CTPG-W (2-6 h) i značajno se smanjio nakon 12 h u poređenju sa kontrolom. Mogući razlog je taj što je glavna komponenta CTPG-W ehinakozid. Nekoliko studija je izvijestilo da ehinakozid može inhibirati proizvodnju ROS-a i apoptozu izazvanu ROS-om kako bi pokazao svoje neuroprotektivne efekte i efekte protiv starenja (38-40). Slično, aktivnost uklanjanja slobodnih radikala je uočena u ovoj studiji. Stoga se spekulisalo da neke komponente, uključujući verbaskozid, izo-verbaskozid i salidrozid u visokoj dozi CTPG-W mogu odmah izazvati stvaranje ROS-a da izazove apoptozu Eca-109 ćelija (41,42), a zatim ROS je uklonio echinakozid. Drugi mogući razlog za razlike u proizvodnji ROS-a od strane CTPG-a i CTPG-W je taj što su u ovoj i prethodnoj studiji korištene različite ćelijske linije (24). Dong i saradnici (43) izvještavaju da ehinakozid može inducirati apoptozu ljudskih ćelija raka debelog crijeva SW480 kroz stvaranje oksidativnog oštećenja DNK bez povećanja nivoa ROS.

Tretman CTPG-W smanjio je Δψm i izazvao oslobađanje citokroma c, koji promoviše cijepanje kaspaze-9 (28). Konzistentno, nivoi cijepane kaspaze-9 su regulirani CTPG-W tretmanom. Nakon toga, aktivna kaspaza-9 može aktivirati kaspazu-3 da izazove apoptozu (44). Nivoi cijepane kaspaze-3 su također regulirani CTPG-W tretmanom. Međutim, kaspaza-8 nije aktivirana od strane CTPG-W, što ukazuje da put ekstrinzičnog receptora smrti nije bio uključen u apoptozu izazvanu CTPG-W. Ova zapažanja ukazuju na to da CTPG-W inducira apoptozu Eca-109 ćelija kroz aktivaciju mitohondrijalno-zavisnog puta.

PARP ima važnu ulogu u genomskoj stabilnosti i može se cijepati aktivnim kaspazama, posebno kaspazom-3 i -7 (45). Utvrđeno je da je CTPG-W tretman aktivirao kaspazu-3 i -7, koji mogu cijepati PARP da inhibiraju popravku DNK i uzrokuju apoptozu.

CTPG-W takođe, zavisno od doze i vremena, potiskuje rast ćelija humanog hepatocelularnog karcinoma BEL-7404 (neobjavljeni podaci). Iako CTPG-W inhibira rast Eca-109 i BEL-7404 ćelija, on potiče proliferaciju splenocita, što može biti zbog sadržaja polisaharida (~50%) u CTPG-W (46 ). Slično, nekoliko studija je izvijestilo da polisaharidi mogu promovirati proliferaciju splenocita (46-49). U modelu miša utvrđeno je da CTPG-W značajno povećava indeks slezene, u poređenju s kontrolnom grupom, ali nije utjecao na tjelesnu težinu i indekse drugih organa uključujući srce, jetru, bubrege i pluća (neobjavljeni podaci), što ukazuje da CTPG-W nema citotoksični efekat na normalne ćelije.

Zbirno, podaci ukazuju da CTPG-W inhibira rast Eca-109 ćelija indukcijom apoptoze putem mitohondrijalnog puta ovisnog

PRIRODNI CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%