Sadržaj fenolnih jedinjenja i genetska raznolikost na nivou populacije širom prirodnog područja rasprostranjenosti medvjeđe bobice (Arctostaphylos Uva-ursi, Ericaceae) na Iberijskom poluotoku

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

sažetak:Medvjed (Arctostaphylos uva-ursi) je ljekovita biljka koja se tradicionalno koristi za liječenje infekcija mokraćnih puteva zbog visokog sadržajaarbutin(hidrokinon-D-glukozid), koji se danas uglavnom koristi kao prirodno sredstvo za izbjeljivanje kože u kozmetici. Medvjed je također predložen kao prirodanantioksidansaditiva zbog visokog sadržaja fenolnih jedinjenja u listovima. Proučavali smo varijacije fenolnih jedinjenja u 42 divlje populacije medvjeđe bobice, sa ciljem da razjasnimo da li unutrašnji biološki, klimatski i/ili geografski faktori utiču na sadržaj fenola u njegovoj prirodnoj distribuciji na Iberijskom poluostrvu. Listovi medvjeđe bobice sakupljeni su tokom jeseni tokom trogodišnjeg perioda (2014–2016) u populacijama na različitim širinama i visinskim gradijentom. Ekstrakti metanolice su pokazali širok raspon varijacija u sadržaju ukupnih fenola i različite fenolne profile u pogleduarbutin(nivoi ovog glavnog sastojka varirali su od 87 do 232 mg/g dr. wt), ali i sadržaja katehina i miricetina, na koje su uticali geografski i klimatski faktori. Umjereni nivoi varijacija u veličini genoma – procijenjeni protočnom citometrijom – i na dva regiona plastidne DNK također su otkriveni među populacijama. Genetska i citogenetska diferencijacija populacija bila je slaba, ali značajno povezana s fitokemijskom raznolikošću. Elitni genotipovi medvjeđeg bobica sa višimantioksidanskapaciteti su naknadno identifikovani.

Ključne riječi: arbutin; genetska i fitokemijska varijabilnost; veličina genoma; haplotipovi;prirodniantioksidansi

cistanche su prirodni antioksidansi

1. Uvod

Sinteza biljnih specijaliziranih metabolita varira u vremenu (tj. ontogenezi, fenologiji i induciranim odbrambenim snagama) i prostoru, jer igra ključnu ulogu u adaptaciji biljaka na uslove okoline, dok genetska varijacija također doprinosi hemodiverzitetu [1]. Među ovim spojevima, fenoli imaju raznolik niz mono- i polimernih struktura koje ispunjavaju širok raspon fizioloških uloga [2]. Na biosintezu specijalizovanih metabolita u velikoj meri utiču faktori okoline kao što su temperatura, padavine ili sunčevo zračenje, koji su zauzvrat često izloženi širinskim, uzdužnim ili visinskim gradijentima. Konkretno, akumulacija fenolnih jedinjenja je opšti odgovor na povećane nivoe UV-B (280-315 nm) zračenja. Prijavljene su specifične varijacije jedinjenja u biljkama koje rastu u mediteranskom regionu tokom ljeta i na velikim nadmorskim visinama, gdje se javlja veća incidencija UV-B, a cimetne kiseline i flavonoidi pokazuju najveću stopu UV apsorpcije [3].

Arbutin(hidrokinon -D-glukozid) je jednostavno jedinjenje fenola sa ograničenom pojavom u listovima nekih vrsta koje pripadaju rodovima kao što su Arbutus, Arctostaphylos, Pyrus ili Vaccinium. Glavni prirodni izvor arbutina, medvjeda bobica (Arctostaphylos uva-ursi ( L.) Spreng.) se stoljećima koristio za liječenje infekcija urinarnog trakta i drugih bubrežnih bolesti [4], a biljne formulacije se pripremaju i danas [5]. U posljednjih nekoliko godina, spektar primjenearbutinproširio se, uglavnom kao prirodno sredstvo za izbjeljivanje kože u kozmetičkoj industriji [6] i u kliničkim terapijama zbog svogantioksidans, antibiotska, protuupalna i antitumorska svojstva [7]. Shodno tome, postoji sve veći interes za pronalaženje dodatnih prirodnih izvoraarbutin, kao i biotehnološki procesi koji mogu zamijeniti kemijsku sintezu [8,9]. U tom kontekstu, in vitro proizvodnja arbutina pomoću Datura inoxia ćelijskih kultura dostigla je pilot skalu [10].

Pored togaarbutin, druga fenolna jedinjenja doprinose aktivnim svojstvima A. uva-ursi, kao što su flavonoidi i tanini [11,12], od kojih su katehin i korilagin najrelevantniji dodaci, respektivno [13]. U prehrambenoj industriji prirodni spojevi kao biljni fenoli zamjenjuju sintetičkeantioksidanskonzervansi [14]. A. uva-ursi se koristi kao dodatak, posebno u mesnim proizvodima [15–19], ali iu aktivnom pakovanju [20]. Konačno, nedavno je predložen potencijal A. uva-ursi kao izvora štavljenja za industriju kože [21].

Monografija "list medvjeđeg bobica" Evropske agencije za lijekove [5] predložila je najmanje 7 postoarbutinsadržaj u osušenom lišću kao uslov za biljne preparate. Istraživanja provedena u proteklim decenijama opisala su sadržaj arbutina u listovima medvjeđeg bobica koji varira od 0 posto do 18 posto, objašnjeno analitičkim procedurama, prirodnom varijabilnosti, uslovima rasta i datumom berbe [4]. Sadržaj arbutina se obično određuje tečnom hromatografijom visokih performansi [4,12,22–24], a prethodne studije su otkrile višearbutinSadržaji u biljkama medvjeđeg voća sakupljenim u jesen nego u onim sakupljenim u proljeće [4]. Opisani su različiti kemotipovi medvjeđeg bobica povezani sa geografskom distribucijom i intraspecifičnom diferencijacijom u podvrstama A. uva-ursi. Najupečatljivija prijavljena fitokemijska varijacija je odsustvo arbutina u A. uva-ursi subsp. stipitata Packer i Denford, ali su navedene i razlike u sadržaju metil-arbutina, elaginske kiseline ili miricetina. Kvercetin je također prisutan u listovima medvjeđe bobice, u kojima su oba aglikona, kao i njihovi 3-O-glikozidi, najčešće pronađeni flavonoidi [4]. Međutim, većina ovih istraživanja obavljena je prije nekoliko desetljeća, a danas se smatra da je intraspecifična varijacija medvjeđeg bobica kontinuirana. Opisanih 14 podvrsta, uključujući jednu iz Španije (A. uva-ursi subsp. crassifolius (Braun-Blanq.) Rivas Mart. ex Torre, Alcaraz i MB Crespo), trenutno su neprihvaćena imena i sinonim za A. uva-ursi [ 25]. Stoga su potrebna nova istraživanja kako bismo poboljšali naše znanje o jedinjenjima koja su stvarno prisutna u sirovini koja je ubrana sa različitih lokacija u industrijske svrhe, jer je opisano da hemijski profil listova A. uva-ursi uključuje raznoliku lepezu fenola, tanina, i flavonoidi u novijim studijama sprovedenim za istraživanje razlika na interspecifičnom nivou [23,26,27].

Genetska (uključujući citogenetsku) raznovrsnost na nivou populacije promiče adaptaciju na različite uslove okoline [28]. Učinci poliploidizacije na proizvodnju specijaliziranih metabolita u ljekovitim i aromatičnim biljkama nedavno su pregledani [29]. U tom kontekstu, veličina genoma je u velikoj mjeri korišten parametar u procjenama varijabilnosti biljaka, budući da se intraspecifične varijacije često otkrivaju ([30] i reference u njima), u korelaciji s mnogim drugim biološkim osobinama i igra relevantnu ulogu u evolucijskim procesima [31-35 ]. Međutim, studije koje se bave povezanostom količine nuklearne DNK (tj. veličine genoma) i fitokemijske raznolikosti su vrlo rijetke [36,37]. Odnos između fitokemijske i genetske raznolikosti procijenjen je korištenjem nuklearnih, ali posebno plastidnih DNK markera [38], posebno u ljekovitim [39] i kultiviranim [40] biljnim vrstama.

Medvedka bobica je široko rasprostranjena po cirkumborealnom području, ali većina sakupljenih divljih populacija u Evropi nalazi se u istočnim zemljama, Austriji, Švajcarskoj, Italiji i Španiji. Arctostaphylos uva-ursi raste u istočnom srednjem delu Španije, u planinama, u nadmorske visine od 550 do 2350 m nadmorske visine. Češći je na sjeveru jer su populacije smještene na nižim geografskim širinama rjeđe i obično imaju manje jedinki. Postojeće studije o varijabilnosti sadržaja arbutina u Španjolskoj su se odnosile na vrijednosti u rasponu od 8 posto u sjeveroistočnim populacijama [41] i 19 posto u španjolskom biljnom materijalu procijenjene u studiji sprovedenoj u Njemačkoj [42]. Naša studija ima za cilj da razjasni faktore, uključujući veličinu genoma i genetsku raznolikost, objašnjavajući fitokemijske varijacije u prirodnoj distribuciji medvjeđeg bobica u Španiji. Naši rezultati mogli bi doprinijeti odabiru biljnog materijala za farmaceutsku, kozmetičku i prehrambenu industriju.

hrana za izbjeljivanje kože:CISATNCHE

2. Rezultati i diskusija

2.1. Analiza hemijskog diverziteta

Listovi medvjeđe bobice uzorkovani sa ukupno 249 biljaka koje rastu na 42 španske lokacije, a tokom trogodišnjeg perioda, 2014–2016 (Slika 1, Tabela S1), pokazali su različite procente suve težine (dr wt), u rasponu od 46,7 (LO) do 55,1 posto (CP), sa prosjekom od 50,1 ± 2,7 posto (podaci nisu prikazani). Ekstrakti metanolice pripremljeni iz uzoraka prikupljenih 2014. i 2015. godine korišteni su za određivanje sadržaja ukupnih fenola i arbutina. Uočili smo širok raspon kontinuiranih varijacija za oba parametra sa značajnim razlikama (p < 0,001)="" među="" biljkama.="" ekstrakti="" listova="" 80="" biljaka="" uzorkovanih="" u="" jesen="" 2014.="" (slika="" 2a)="" pokazali="" su="" ukupan="" sadržaj="" fenola="" u="" rasponu="" od="" 103,3="" ±="" 4,8="" mg="" gae/g="" dr="" wt="" (uzorak="" li-4)="" do="" 206,4="" ±="" 6,5="" mg="" gae/g="" dr="" wt="" (sr="" -2),="">arbutinsadržaj je fluktirao od 92.0 ± 3.0 mg/g dr wt (AN-6) do 194,2 ± 5,6 mg/g dr wt (SE-8). Analiza ekstrakata pripremljenih od listova sakupljenih u 2015 od 94 biljke (slika 2b) također je pokazala široku fitokemijsku varijaciju, od 110,5 ± 3,6 mg GAE/g dr wt(PI-4) do 200,9 ± 9,8 mg GAE/g dr wt (LO-4) u ukupnom sadržaju fenola, dok se sadržaj arbutina kretao između 87,1 ± 0,4 mg/g dr wt (ET-2) i 211,5 ± 5,9 mg/g dr wt (LI -2). Nadalje, bez obzira na godinu sakupljanja, značajne razlike u ukupnim fenolima iarbutinsadržaj je detektovan kod biljaka medvjeđe bobice koje rastu na istoj lokaciji za većinu populacija (podaci nisu prikazani). Nivo arbutina je u značajnoj korelaciji sa ukupnim sadržajem fenola u ekstraktima listova medvjetke jer smo procijenili značajne Pearsonove koeficijente od {{0}} .332 (p=0.003) za 2014. i 0.289 za podatke iz 2015. (p=0.005). Sadržaj arbutina u 48 biljaka uzorkovanih u obje godine nije značajno varirao (p=0.380).

Uprkos varijabilnosti uočenoj unutar populacija, i bez obzira na godinu berbe, analiza varijanse je pokazala da sadržaj arbutina u ekstraktima listova medvjetke također zavisi (p < {{0}}.00="" 1)="" na="" lokaciji="" populacije="" (slika="" 3a,b),="" kao="" što="" se="" desilo="" za="" ukupan="" sadržaj="" fenola="" u="" listovima="" medvjeđe="" bobice="" analiziran="" u="" 2015="" (p="">< 0.001,="" slika="" 3b).="" nasuprot="" tome,="" značajne="" razlike="" u="" sadržaju="" ukupnih="" fenola="" nisu="" uočene="" (p="0.080)" među="" 10="" populacija="" uzorkovanih="" 2014.="" godine,="" koje="" su="" se="" nalazile="" na="" relativno="" malom="" području,="" ali="" raspoređene="" u="" širokom="" rasponu="" nadmorske="" visine,="" od="" 424="" (ba="" populacija)="" do="" 1410="" m="" nm="" (populacija="" pa).="" ova="" varijacija="" u="" nadmorskoj="" visini="" povezana="" je="" sa="" razlikama="" u="" klimatskim="" uslovima="" (tabela="" s1),="" budući="" da="" su="" lokacije="" na="" većim="" nadmorskim="" visinama="" karakterisale="" niže="" srednje="" temperature="" (pearsonov="" koeficijent="" korelacije,="" r="-0,666," p="">< 0,001)="" i="" veće="" godišnje="" padavine="" (="" r="0.485," p="">< 0.001),="" što="" je="" rezultiralo="" nižim="" globalnim="" nivoima="" radijacije="" (r="-0.390," p="">< 0.001).="" nadalje,="" iz="" ovog="" skupa="" podataka="" procijenjena="" je="" niska,="" ali="" značajna="" pozitivna="" korelacija="" između="" godišnjih="" padavina="" i="" ukupnog="" sadržaja="" fenola="" u="" biljkama="" medvjeđeg="" bobica="" (spearmanov="" koeficijent="" rho="0.256," p="0.022)," dok="" iz="" seta="" podataka="" iz="" 2015.="" kada="" smo="" uzorkovali="" populacije="" na="" većem="" području,="" otkrili="" smo="" značajnu="" pozitivnu="" korelaciju="" između="" godišnjih="" padavina="" i="" sadržaja="" arbutina="" (rho="0.246," p="0.017)." ova="" značajna="" korelacija="" ukazuje="" na="" to="" da="" su="" biljke="" medvjeđeg="" bobica="" koje="" rastu="" na="" sjevernim="" lokacijama="" i="" na="" relativno="" većim="" nadmorskim="" visinama="" pokazale="" često="">arbutinsadržaj (rho=0.217, p=0.035 i rho=0.269, p=0.009, respektivno). Kao što je spomenuto, ovi viši sadržaji arbutina značajno su korelirali sa višim sadržajem ukupnih fenola u listovima medvjeđe bobice, koji su bili slični (u prosjeku 154,4 ± 19,6 mg GAE/g dr. wt) onima pronađenim u vodenim ekstraktima drugih biljnih vrsta korištenih kaoantioksidansaditivi u prehrambenoj industriji [43], kao što su ruzmarin (185.0 mg GAE/g dr. wt), čaj (149,3 mg GAE/g dr wt) ili guava (154,4 mg GAE/g dr wt). Ovi rezultati su u skladu s prethodnim referencama i potvrđeni su u studiji koju su proveli Wrona et al. [20] koristeći neke od uzoraka listova španjolske medvjetke prikupljene 2015. godine, za koje je višeantioksidanskapacitet je bio povezan sa višimarbutinsadržaja. Elitni genotipovi medvjeđeg bobica također se mogu identificirati za ovu svrhu, kao što su jedinke 1, 4, 7 i 8 iz LO populacije, koje su akumulirale u prosjeku 183,3 ± 16,4 mg GAE/g dr wt u dvije godine istraživanja.

Kako bismo dodatno razjasnili klimatske i geografske faktore koji utiču na obrasce fenolvarijacije, izvršili smo iscrpnije prikupljanje uzoraka u jesen 2016:140 biljaka medvjeđeg bobica koje rastu na 29 lokacija, a kvantificirali smo pet fenolnih jedinjenja (Slika S1a) koji su identifikovani ko-eluiranjem sa standardima u gradijentu acetonitril/voda (Slika S1b). Analiza je pokazala širok raspon kontinuiranih varijacija sadržaja arbutina, kafeinske kiseline, katehina, miricetina i kvercetin glukozida, sa značajnim razlikama među biljkama koje su također općenito uočene unutar populacija (podaci nisu prikazani). Za glavne fenolne sastojke, otkrili smo da se sadržaj arbutina kretao od 91,1 ± 5.0 (LB{{10}}) do 232,4 ± 2,8 mg/g težine (PT{{15 }}), dok se sadržaj katehina kretao od 4,1 ± 0,1 (AF{{20}}) do 45,5 ± 1,4 mg/g dr. wt (LB-5). Što se tiče druga dva utvrđena flavonoida, miricetin nije detektovan u nekim biljkama iz nekoliko populacija, dok je dostigao 21,2 ± 1,2 mg/g dr. wt u PO{{30}}, a kvercetin glukozid je varirao od 3,8 ± 0,1 (CO -3) do 22,8 ± 0,8 mg/g težine (BT-3). U ekstraktima listova medvjeđe bobice utvrđen je manji sadržaj kafeinske kiseline, koji je varirao od 1,8 ± 0,0 (IZ-1) do 7,1 ± 0,3 mgBiljke/g dr wt (SI-4).

Uprkos varijacijama uočenim među pojedincima, značajne razlike među populacijama su također procijenjene za ovih pet jedinjenja (Kruskal-Wallis testovi, p < {{0}}.001="" i="" p="0." 009="" sadržaj="" forkafeinske="" kiseline).="" veći="" sadržaji="" arbutina="" utvrđeni="" su,="" u="" prosjeku,="" u="" biljkama="" prirodnih="" populacija="" ab,="" gu,="" ln="" i="" lo="" (slika="" 4a),="" koje="" su="" se="" značajno="" razlikovale="" (nakon="" korekcije="" bonferronika)="" od="" niskih="" sadržaja="" pronađenih="" u="" biljkama="" iz="" populacije="" lb="" (186,7="" ±="" 22,3,="" 193,9="" ±="" 12,1,169,5="" ±="" 10,0="" i="" 169,2="" ±="" 5,2="" mg/g="" dr.="" wt="" napred="" do="" 111,8="" ±="" 16,0="" mg/g="" dr="" wt,="" respektivno).="">arbutinsadržaj biljaka koje su uzorkovane iu 2015 nije značajno varirao između godina (p=0.821). Populacija LB je zauzvrat pokazala viši srednji nivo katehina (Slika 4b), koji se značajno razlikovao od niskog srednjeg sadržaja ovog flavonoida otkrivenog u populacijama AF i LC (32,8 ± 9,8 sprijeda do 5,7 ± 1,9 i 5,3 ± {{2{{62} }}}.5 mg/g dr wt, respektivno). Srednji sadržaj glukozida miricetina i kvercetina prikazan je na slici 4c, sa značajnim razlikama među populacijama AB, CG, LB i PO, sa većim sadržajem miricetina (15,1 ± 4.0, 14,6 ± 5,7, 10 ,7 ± 2,8, odnosno 17,2 ± 3,9 mg/g dr wt, u poređenju sa niskim nivoima koji su akumulirani na prosječnim biljkama iz populacija CO i OD (1,2 ± 1,5 i 2,4 ± 3,6 mg/g dr wt, respektivno) , a takođe znači i sadržaj kvercetin glukozida određen u populacijama AA, BT, CP, IZ i LB (15,2 ± 3,7, 15,9 ± 4,6, 11,8 ± 2,3, 15,7 ± 3,4 i 13,1 ± 4,6 t, značajno se razlikuju po težini) od onog u populaciji CO (4.0 ± 0,1 mg/g dr wt). Nasuprot tome, srednji sadržaj kofeinske kiseline oscilirao je od 2,1 ± 0,2 mg/g dr wt u populacijama AB, CE, PT i SA, do 3,5 ± 1,2 mg/g dr wt u populaciji AF ili 3,4 ± 2,2 mg/g dr wt u stanovništvo SI; stoga, značajne razlike nisu uočene zbog varijacije unutar populacije (prosječni sadržaj 2,7 ± 0,8 mg/g dr wt). Ovi rezultati dopunjuju varijacije na fenolnim metabolitima koje su uočili Wrona et al. [20], za osam lokacija uzorkovanih medvjeđih plodova 2015. godine koje su analizirane pomoću UPLC®-ESI-Q-TOF sa MSE tehnologijom.

Za razliku od rezultata dobijenih u analizi rađenoj na uzorcima medvjetke iz 2014. i 2015. godine,arbutinsadržaji utvrđeni u 2{{10}}16 uzoraka pokazali su nisku, ali značajnu pozitivnu korelaciju sa zračenjem (rho=0.256, p=0.002), i maksimalne srednje temperature (rho{ {5}}.183, p=0.030), i stoga su u obrnutoj korelaciji sa godišnjim vrijednostima padavina (rho=−0.265, p=0.002). Ove razlike su bile povezane i sa varijacijama u nadmorskoj visini (rho=−0.192, p=0.023), ali je ova negativna korelacija objašnjena pomenutim niskimarbutinsadržaj biljaka iz populacije LB koje se nalaze na 1720m. Sličan obrazac varijacije uočen je za sadržaj miricetina jer su viši nivoi ovog jedinjenja značajno povezani sa biljkama medvjeđeg bobica koje rastu na lokacijama pod višim nivoima zračenja (rho=0.226, p=0.{{1{{ 12}}}07). Za katehin je uočen suprotan obrazac od arbutina, budući da je procijenjena pozitivna korelacija između ovog flavonoida i godišnjih padavina (rho=0.398,p < 0.0{{23="" }}1),="" a="" negativne="" korelacije="" su="" shodno="" tome="" detektovane="" sa="" zračenjem="" i="" sa="" maksimalnom="" srednjom="" temperaturom="" (rho="−0.307," p="">< 0.001="" i="" rho="−0.470," p="">< 0.001,="" odnosno).="" ova="" varijacija="" u="" klimatskim="" faktorima="" objasnila="" je="" da="" su="" i="" nadmorska="" visina="" i="" geografska="" širina="" uticale="" na="" sadržaj="" katehina="" u="" listovima="" medvjeđe="" bobice="" (rho="0.410" i="" 0.490,="" respektivno,="" p="">< 0.001).="" analiza="" glavnih="" komponenti="" obavljena="" s="" fitohemijskim,="" klimatskim="" i="" geografskim="" podacima="" koji="" odgovaraju="" 29="" lokacija="" uzorkovanih="" 2016.="" godine,="" u="" kojoj="" su="" dvije="" prve="" komponente="" objasnile="" 60="" posto="" uočenih="" varijacija,="" potvrdila="" je="" ove="" rezultate="" (slika="" 5).="" nismo="" otkrili="" nikakvu="" značajnu="" korelaciju="" između="" sadržaja="" kofeinske="" kiseline="" ili="" kvercetin="" glukozida="" u="" biljkama="" medvjeđeg="" bobica="" i="" klimatskih="" ili="" geografskih="" faktora,="" iako="" smo="" procijenili="" blage,="" ali="" značajne="" korelacije="" između="" sadržaja="" miricetina="" i="" kvercetin="" glukozida="" (rho="0.184," p="" {{31}="" }.030)i="" između="" sadržaja="" miricetina="" i="" kafeinske="" kiseline="" (rho="−0.176," p="0.037)" biljaka="" medvjeđeg="">

Uočeni kontrastni klimatski obrasci variranja uarbutinSadržaj biljaka medvjeđeg bobica sugerira da, iako je biosinteza ovog metabolita vjerovatno povećana u uvjetima veće radijacije i temperature, vjerovatno je nedostatak vode ograničavajući faktor za A. uva-ursi u mediteranskim i južnim regijama. Del Valle i dr. [44] izvijestili su o geografskoj širini akumulacije flavonoida Silene littorea (Caryophyllaceae) u Španjolskoj, gdje je utvrđen veći sadržaj flavonoida u južnim populacijama, budući da je geografska širina negativno korelirala s UV-B zračenjem i temperaturom, a pozitivna s padavinama. Globalno zračenje pokazuje jasan gradijent širine sa većom incidencijom na jugu i istoku Iberijskog poluostrva, a postoji i značajan orografski efekat jer postojanost oblaka modulira incidenciju ovog zračenja na većim visinama. Mapa UV zračenja Španije [45] navedena visoka korelacija (r > 0.9) između UV-B i globalnih podataka o zračenju. Prema ovoj referenci, populacije medvjedića koje su pokazale veći prosjekarbutinsadržaji u našoj studiji uglavnom se nalaze u područjima pod nivoima UV-B zračenja od 2403–2451 J/m2.

Naši rezultati za varijaciju katehina u medvjeđim bobicama pokazali su geografski obrazac (Slika 5) i slažu se sa studijama provedenim na drugim biljnim vrstama iz sjevernih zemalja Evrope. Veći sadržaji specijalizovanih metabolita, kao što su flavonoidi i antocijanini, zabilježeni su u biljkama koje rastu na višim geografskim širinama, vjerovatno zbog dužih dnevnih perioda i nižih noćnih temperatura [46]. Zbog toga se sadržaj rastvorljivih fenola u iglicama Juniperus communis povećavao sa zemljopisnom širinom i visinom u populacijama Finske [47], a također je pronađen 10-19 posto veći sadržaj fenola na višoj geografskoj širini u plodovima tri Ribes spp. sorte analizirane na dvije finske lokacije [48]. Ovi autori povezuju niži sadržaj fenola sa višim nivoima zračenja i temperature. Sadržaj flavonoida u plodovima dvije vrste Vaccinium (također iz porodice Ericaceae) pokazao je geografski gradijent, sa većim količinama offlavonoida u sjevernim geografskim širinama [49,50].

U odnosu na visinske varijacije, viši nivoi flavonoida utvrđeni su u populacijama drugih vrsta Ericaceae, Calluna vulgaris, koje rastu na većim nadmorskim visinama [51]. Visinski gradijenti su također utjecali na specijalizirani metabolizam španjolskih populacija Arnica montana [52] i Quercus robur [53]. Potonji rad je ukazao na značajnu pozitivnu povezanost između koncentracije ukupnih fenola u lišću i nadmorske visine, budući da gradijent zavisi samo od flavonoida, sugerirajući da ovi jedinjenja su izazvala odnos za ukupne fenole. Ovi rezultati se slažu s našim procjenama za uzorak sadržaja katehina. Konačno, gradijent padavina bio je povezan sa značajnim razlikama u sastavu polifenola u afričkom ljekovitom grmu (Myrothamnus flabellifolia) za koje su metabolomske razlike bile u skladu s genetskom strukturom populacija [54].

CISTANCHE MOŽE PROTIV STARENJA

2.2. Analiza podataka o veličini i sekvenci genoma

Vrijednosti veličine genoma 2C biljaka medvjeđe bobice kretale su se od 2,50 do 3,15 pg (Tabela 1). Male razlike u količini nuklearne DNK pronađene su među populacijama (Kruskal-Wallis χ2=87.639, df=36,p=3.39 × 10−6). Dunnov test sa Bonferronijevom korekcijom otkrio je statistički značajne razlike između: AL i SI populacije (Z=−3.972, p=0.024), LE i SI (Z=−4.196, p {{ 21}}.009), i SE i SI (Z=−4.236, p=0.008). Populacija Pontilsa (PO) je tipski lokalitet A. uva-ursi var.crassifolius, koji je naknadno spojen kao A. uva-ursi subsp. crassifolius, i trenutno se ne razmatra taksonomski (vidi uvod), ima srednju vrijednost (2,88 pg), unutar raspona vrijednosti dobijenih u drugim populacijama vrste. Ovo je prva opsežna populacijska studija količine nuklearne DNK u vrsti i cijelom rodu budući da jedine dostupne informacije do danas potiču od jedne balkanske populacije istog taksona [55]. Tamo prijavljena 2C vrijednost, 2,49 pg, nalazi se na donjoj granici raspona varijacije ovdje istraživanog skupa podataka. Nije pronađena korelacija između vrijednosti veličine genoma i nadmorske visine populacije. Količina DNK pojedinaca pokazala je slabu pozitivnu značajnu korelaciju saarbutinsadržaja kada su upoređeni podaci za 158 biljaka medvjeđe bobice (rho=0.187, p=0.018), dok nije pronađena druga značajna korelacija između veličine genomeze i drugih varijabli. Ovaj rezultat je u skladu s prijavljenim povećanjem proizvodnje specijaliziranih metabolita koji se općenito opažaju u ljekovitim i aromatičnim biljkama nakon poliploidizacije [29].

Novoproizvedene sekvence za rpl{{0}}trnL i psbE-petN intergenske razmaknice su poređane u dvije matrice (odnosno koje sadrže 566 i 874 bp) koje su spojene u jednu matricu od 1440 bp. Umjereno otkriveni su nivoi varijacije u ovim plastidnim regionima (šest nukleotidnih supstitucija i četiri indela). Pronađeno je deset različitih haplotipova sa ukupnom haplotipskom raznovrsnošću (Hd) od 0.468 (Tabela 1). Većina populacija (21) sadržavala je samo jedan haplotip, dok je pet njih ispoljilo određenu raznolikost među pojedincima. Najzastupljeniji haplotip 1 pokazao je najveću učestalost (71,4 posto), zatim haplotip 2 (15,2 posto), dok su ostali pokazali mnogo niže frekvencije (0,04-0,01 posto). Geografska distribucija haplotipova prikazana je na slici 6. Haplotip 1 je pronađen u 32 populacije — fiksiran je u njih 18 — raspoređen u svim uzorkovanim regijama osim u najjužnijim lokalitetima. Haplotip 2 je pronađen u deset populacija i bio je isključivi haplotip u dvije najjužnije populacije (HU i LV) kao i u PR. Haplotip 4 bio je privatan od tri populacije s Pirineja, dok se haplotip 8 pojavio u dvije populacije s istočnog Iberijskog poluotoka. Što se tiče evolucijskih odnosa prikazanih u mreži škrtosti (Slika 6), većina haplotipova je povezana jednim ili dva koraka mutacije. Haplotip 1 zauzima centralnu poziciju, sa sedam haplotipova povezanih s njim.

Mantel test između pDNA genetičke i hemijske matrice parnih udaljenosti pokazao je slabu, ali značajnu korelaciju (r=0.301; p=0.048) između genetske diferencijacije i koncentracije pet hemijskih komponenti izmjerenih za Skup podataka za 2016. Mantel test nije otkrio nikakvu značajnu korelaciju između genetske i geografske udaljenosti između 25 populacija uzorkovanih 2016. (r=0.103, p=0.207) ili između hemijske i geografske udaljenosti između ovih 25 populacija (r=0.191, p=0.050). Fitokemijska varijabilnost koja je ovdje prijavljena za divlje populacije medvjeđe bobice širom Španije je stoga dopunjena umjerenim nivoima varijacije haplotipa pDNA, što je genetska diferencijacija sjever-jug pronađena u populacijama medvjeđeg bobica uporediva sa filogeografskim obrascima pronađenim u drugim biljkama (npr. [56-58). Sva ova homogenost se očekuje kod biljaka sa niskim reproduktivnim kapacitetom [59], kao što je A. uva-ursi, koja pokazuje slabu klijavost i visoku stopu mortaliteta mladih sadnica [4]. Ipak, skromna genetska diferencijacija koju pokazuje pDNA korelira sa biohemijskom udaljenosti u paru procijenjene iz profila pet fenolnih Slika 6. Geografska distribucija pDNA haplotipova na iberijske populacije Arctostaphylos uva-ursi. Populacioni kodovi odgovaraju onima u Tabeli S1, a kružni grafikoni predstavljaju postotak pojedinaca koji pokazuju svaki haplotip u svakoj populaciji. pravougaonik, statistička štedljiva mreža koja pokazuje evolucijske odnose te Zastupljeni su n plastidni haplotipovi pronađeni u populaciji A. uva-ursi. Svaka pruga duž linija koje povezuju haplotipove ukazuje na jedan mutacijski korak u pDNK regijama sekvenciranim u ovoj studiji. Mantelov test između pDNK genetičke i hemijske matrice udaljenosti u paru pokazao je slabu, ali značajnu korelaciju (r=0.301; p {{28 }}.048) između genetske diferencijacije i koncentracije pet hemijskih komponenti izmjerenih za skup podataka iz 2016. godine. Mantelov test nije otkrio nikakvu značajnu korelaciju između genetske i geografske udaljenosti između 25 populacija uzorkovanih 2016. (r=0.103, p=0.207) ili između hemijske i geografske udaljenosti između ovih 25 populacija ( r=0.191, p=0.050). Fitokemijska varijabilnost koja je ovdje prijavljena za populacije divljih medvjeđih bobica širom Španije je stoga dopunjena umjerenim nivoima varijacije haplotipa pDNK, što je genetska diferencijacija sjever-jug pronađena u populacijama medvjeđeg bobica uporediva sa filogeografskim obrascima pronađenim u drugim biljkama (npr. [56–58]. Sva ova homogenost očekuje se zasad sa niskim reproduktivnim kapacitetom [59], kao što je A. uva-ursi, koja pokazuje slabu klijavost i visoku stopu mortaliteta mladih sadnica [4] Ipak, skromna genetska diferencijacija koju pokazuje pDNK korelira s biohemijskim razmacima parova procijenjenim iz profila Ovaj obrazac genetske i fitokemijske varijacije (koji, kao što je spomenuto, nije bio povezan sa geografskim udaljenostima), kao i slaba, ali značajna korelacija između veličine genomeze i sadržaja arbutina, može ukazivati ​​da prirodna genomska varijabilnost utiče na prinos fenolnih jedinjenja u A. uva-ursi Međutim, hipervarijabilni molekularni m arkeri u opsežnijem uzorkovanju populacije su neophodni da bi se potvrdili ovi filogeografski obrasci i povezanost između genetske i biohemijske varijabilnosti.

CISTANCHE IMA ANTI-OKSIDACIONI EFEKAT

3. Materijali i metode

3.1. Biljni materijal

Za fitokemijsku analizu uzorkovano je ukupno 249 biljaka medvjeđeg bobica koje rastu u 42 populacije u jesen 2014., 2015. i 2016. godine, što je reprezentativno za prirodnu rasprostranjenost ove biljne vrste na Iberijskom poluotoku (Slika 1 i Tabela S1). Prvo, u jesen 2014. sakupili smo terminalne izdanke sa 80 biljaka u deset španjolskih populacija (AG, AN, BA, LI, LO, PE, PÁ, SR, SC i SE) koje se nalaze na relativno malom području (približno 80 × 50 km) u sjevernoj Španiji, ali u širokom rasponu nadmorske visine (424–1410 mnv). Drugo, u jesen 2015. sakupili smo 48 biljaka iz šest od ovih populacija (AG, LI, LO, PA, SE i SR) i 46 biljaka medvjetke iz šest populacija koje se nalaze na nižim geografskim širinama (AL, CH, ET, HU, LV i PI). Za svaku populaciju uzorkovano je osam biljaka udaljenih najmanje 5 m, osim u HU, gdje smo pronašli samo šest jedinki. Treće, u jesen 2016. uzorkovano je ukupno 140 biljaka na 29 različitih lokacija (1-6 jedinki sa svake) uključujući 26 novih španskih lokaliteta (IZ, CE, BT, MO, AA, GU, SI, AF, SA, PT, AB, CG, OD, PS, LB, CO, LE, MA, CP, PO, MZ, AV, LC, AY, LN i ZU). Naše uzorkovanje obuhvata raspon nadmorske visine od 534 do 1750 m. Sveukupno, 42 populacije predstavljaju širok raspon klimatskih uslova (Tabela S1): maksimalna srednja temperatura je pokazala 2-struku varijaciju (13–26 ◦C) i godišnja količina padavina oscilirala je od 399 (ZU) do 1589 mm (PT). Globalno zračenje se kretalo od 4,2 do 5,1 kWh/m2d. Za svaku biljku sakupljeno je šest do deset završnih izdanaka (dužine 15-20 cm) kako bi se dobilo 6-15 g zdravih listova, koji su potom izrezani i osušeni na 60 ◦C do konstantne težine (3-4 dana). Nakon određivanja suhe težine, listovi su ručno homogenizirani u malteru i čuvani na 4 ◦C do analize. Ovaj biljni materijal korišten je za određivanje ukupnih fenola i HPLC.

Materijal lista za protočnu citometriju dobijen je od svježih listova 178 jedinki koje pripadaju ukupno 37 populacija (Tabela 1). Uzorci su dobijeni iz 33 gore pomenute populacije i iz četiri nove populacije (BE, JO, i PR u Španiji i EN u Andori) gde je lišće sakupljeno u proleće 2017. godine, te stoga nije uključeno u fitohemijsku analizu (Slika 1 i Tabela S1). Izmjereno je od jedne do šest jedinki po populaciji induplikovano. Materijali listova za ekstrakciju DNK su osušeni u silika gelu i pohranjeni na sobnoj temperaturi. Analiza DNK diverziteta obavljena je na ukupno 105 biljaka sa 35 lokacija (Tabela 1).

Biljni vaučeri 46 proučavanih populacija medvjedića deponovani su u herbarijumu BC, Instituta Botànic de Barcelona, ​​u herbarijumu BCN, Centra de Documentació de Biodiversitat Vegetal, Universitat de Barcelona ili u herbarijumu JACA, Instituto Pirenaico de Eco ( CSIC).

3.2. Priprema ekstrakta listova i određivanje ukupnih fenola

Pripremljena su tri replika ekstrakta listova medvjeđe bobice korištenjem 50 mg osušenog uzorka i 10 mL 80 posto metanola. Epruvete su inkubirane 30 min u ultrazvučnom kupatilu, a zatim su ekstrakti filtrirani (0,45 mm) i čuvani na 4 ◦C do analize. Ukupni sadržaj fenola određen je u ekstraktima pripremljenim od uzoraka prikupljenih 2014. i 2015. godine. Pratili smo Folin-Ciocalteumethod [60,61] sa malim modifikacijama: na 0,1 mL ekstrakta, 0,4 mL metanola (80 posto), 0,5 mL Folin-a Dodan je Ciocalteu reagens i 8 mL ultra čiste vode. Nakon 5 minuta u ultrazvučnoj kupki, dodat je 1 mL Na2CO3 20 posto (w/v). Uzorci su ostavljeni u mraku 30 minuta prije mjerenja apsorbancije na 760 nm pomoću UV-vidljivog spektrofotometra (CARY 50 BIO, Varian, AgilentTechnologies). Rezultati su izraženi u ekvivalentima galne kiseline (GAE); odnosno mg galne kiseline/g dr wt, koristeći standardnu ​​krivu galne kiseline (40-340 µg/g).

3.3. Određivanje arbutina i drugih fenolnih metabolita

Fenolni sadržaj metanolnih ekstrakata listova medvjeđe bobice kvantificiran je pomoću RP-HPLC pomoću HPLC-UV/Vis sistema (LaChrom Merck Hitachi L-7400) sa Kinetex 5 µm-EVO C18 (250 mm × 4,6 mm) ) kolona i apsorbanca određena na 280 nm. Ekstrakti uzoraka prikupljenih 2014. i 2015. razrijeđeni su 1:10 (v/v) i ubrizgani su mobilnom fazom metanola i acetonitrila. Program gradijenta sastojao se od 0-5 min, 25 posto metanola; 5–6 min, 100 posto; 6-10 minuta, 100 posto; i 10-20 minuta, opet 25 posto metanola. Brzina protoka je bila 1 mL/min, a volumen injekcije je bio 20 µL. U ovim uslovima, vreme zadržavanja odarbutinbio 2,6 min, što nam je omogućilo da odredimo koncentraciju ovog jedinjenja korišćenjem kalibracione krive utvrđene sa 6 razblaženja standarda, od 40 do 340 µg/g, sa koeficijentom korelacije r=0. 9997. Ekstrakti iz uzoraka prikupljenih 2016. godine analizirani su pomoću mobilne faze metanola i vode sa sljedećim gradijentskim programom: 0–5 min, 10 posto metanola; 5–6 min, 20 posto; 6–10 min, 20 posto; 10–11 min, 30 posto; 11–15 min, 30 posto; 15–16 min, 40 posto; 16–20 min, 40 posto; 20–21 min, 50 posto; 21–25 min, 50 posto; 25–26 min, 60 posto; 26–30 min, 60 posto; 30–31 min, 10 posto; i 31-36 min, opet 10 posto metanola. U ovim uslovima smo se opredeliliarbutin iostala 4 fenolna jedinjenja: kafeinska kiselina, katehin, miricetin i kvercetin-3-O-glukopiranozid pomoću odgovarajućih kalibracionih krivulja utvrđenih sa 5 razblaženja standarda (25–500 µg/mL) ,koji je pokazao koeficijente korelacije od {{10}}.9992 za katehin (vrijeme zadržavanja 12.0 min), 0,9924 za kafeinsku kiselinu (vrijeme zadržavanja 13,4 min), 0,9981 za kvercetin{16} }O-glukozid (vrijeme retencije 23,4 min), i 0,9997 za miricetin (vrijeme zadržavanja 25,1 min).

Metanol i acetonitril su bili HPLC kvaliteta i kupljeni su od Panreaca (Barselona, ​​Španija). Standardi (čistoća veća ili jednaka 98 procenata)arbutin, kafeinska kiselina i galna kiselina, kao i Folin-Ciocalteu reagens kupljeni su od Sigma-Aldrich (Barselona, ​​Španija). Katehin i kvercetin{1}}O-glukopiranozidni standardi su nabavljeni od Extrasynthese (Genay Cedex, Francuska), dok je miricetin kupljen od Alfa Aesar (Karlsruhe, Njemačka).

Rezultati hemijskih determinacija analizirani su pomoću softvera SPSS v. 25 i R 3.5.2. Nakon testiranja podataka na normalnost i homoskedastičnost, izvršili smo analizu varijanse različitih skupova podataka i testova razdvajanja sredstava (Tukey i Tamhane) ili neparametarskih testova kao Kruskal–Wallis i Dunn test višestrukog poređenja sa Bonferronijevom korekcijom. Također smo procijenili koeficijente korelacije (Pearson ili Spearman u zavisnosti od toga da li podaci prate normalnu distribuciju) između varijabli, uključujući veličinu genoma.

CISTANCHE IMA ANTI-OKSIDACIONI EFEKAT

3.4. Procjene veličine genoma i sekvenciranje DNK

Veličina genoma biljaka medvjeđeg bobica procijenjena je protočnom citometrijom u Centre Científicsi Tecnològics, Universitat de Barcelona (CCiTUB) slijedeći procedure objašnjene u Pellicer et al. [62].Petunia hybrida Vilm. 'PxPc6' (2C=2.85 pg) je korišten kao interni standard. Seme standarda obezbedila je Plateforme de cytométrie d'Imagerie-Gif, CNRS—I2BC (Gif-sur-Yvette, Francuska). Sadržaj nuklearne DNK (2C) izračunat je množenjem poznatog sadržaja DNK u standardu sa količnikom između pozicije pikova (mod) ciljne vrste i standarda u histogramu intenziteta fluorescencije, uz pretpostavku linearne korelacije između fluorescentnih signala iz obojenih jezgara nepoznatog uzorka, poznatog internog standarda i količine DNK [63].

Približno 20 mg silicijum-osušenog tkiva lista korišteno je za ekstrakciju DNK korištenjem CTAB protokola [64] sa manjim modifikacijama. Kvalitet ukupne DNK provjeren je spektrofotometrom NanoDrop 1000 (ThermoScientific, Wilmington, DE, USA). Intergenski regioni plastida rpl32-trnLand psbE-petN, kao i nuklearni ribosomalni DNK region ITS, amplificirani su i sekvencionirani za tri jedinke po populaciji. Sekvence ITS-a nisu predstavljale varijabilnost unutar 105 analiziranih pojedinaca, osim nekoliko pozicija koje pokazuju intragenomske nukleotidne polimorfizme. Stoga je ovaj nuklearni ribosomalni DNK region isključen iz dalje analize. Drugi regioni plastidne DNK (tj. ndhF; ndhF-rpl32; psbA-trnH; psbD-trnT; rps16; i trnL-trnF) su također testirani, ali su odbačeni zbog male varijabilnosti ili problema s sekvenciranjem. Postupak amplifikacije je izveden kako je opisano u Vitales et al. [65]. Direktno sekvencioniranje amplificiranih DNK segmenata izvedeno je pomoću Big Dye Terminator Cycle Sequencing v 3.1 (PE Biosystems, Foster City, Kalifornija, SAD) u Unitatde Genòmica, CCiTUB, na ABI PRISM 3700 DNK analizatoru (PE Biosystems). rpl32-trnL ipsbE-petN sekvence su sastavljene sa BioEdit verzijom 7.1.3.0 [66], usklađene sa ClustalW MultipleAlignment v1.4 [67] i ručno podešene. Pristupni brojevi GenBank-a dati su u tabeli S2.

3.5. Veličina genoma i genetička analiza

Izvršen je neparametarski Kruskal-Wallisov test kako bi se provjerile statistički značajne razlike u vrijednostima 2C među populacijama. Dunn testovi višestrukog poređenja su također izvedeni kako bi se utvrdilo koje su populacije pokazale značajne razlike među njima. Bonferronijeva korekcija je primijenjena kako bi se minimizirala greška tipa I (lažno pozitivna).

Parametri genetičke raznolikosti (polimorfna mjesta, informativna mjesta o štedljivosti, broj haplotipova i ukupna raznolikost haplotipova) procijenjeni su pomoću DnaSP v6 [68]. Plastidni haplotipovi su određeni u kombinovanom skupu podataka koji je uključivao i rpl32-trnL i psbE-petN regione. Indeli su kodifikovani sa FastGap v.1.2 [69] i tretirani kao događaji sa jednom mutacijom. Evolucijski odnosi među haplotipovima zaključeni su na osnovu štedljive mreže konstruirane pomoću TCS-a [70] kako je implementirano u PopArt-u [71]. Maksimalni broj razlika koje su rezultat pojedinačnih zamjena među haplotipovima izračunat je sa 95 posto granica pouzdanosti.

Za analizu odnosa između genetskih i hemijskih podataka urađen je Mantel test. Prvo smo procijenili fenotipsku udaljenost između 25 populacija koristeći podatke iz biljaka medvjeđeg bobica prikupljene 2016. godine, a koji su izmjereni za pet fenolnih komponenti (tj.arbutin, katehin, kafeinska kiselina, kvercetin i miricetin). Koristili smo R Commander za standardizaciju ovih podataka [72], a zatim i za izračunavanje hemijske udaljenosti izvedene iz standardizovane matrice sa funkcijom "Dist" na R na osnovu euklidskih udaljenosti. Drugo, genetička matrica parnih udaljenosti Nei populacije izračunata je između 25 populacija koristeći DnaSP v6. Konačno, izračunali smo geografske udaljenosti u paru među ovim populacijama koristeći paket "geodist" u R. Parne korelacije između matrica udaljenosti izračunate su korištenjem Mantelovog testa sa 10,000 permutacija sa funkcijom mantel koja je dostupna u R paketu "vegan" [ 73].

4. Zaključak

Pokazale su se sve analizirane biljke medvjetkearbutinsadržaj veći od 7 posto; stoga je ovaj biljni materijal prikladan za biljne preparate. Naša analiza je otkrila veći sadržaj arbutina od onih (do 9 posto) koje navode Parejo et al. [40], koji je analizirao četiri populacije smještene u sjeveroistočnim Pirinejima na 1580–2030 m i otkrio niske razlike u sadržaju arbutina među populacijama. Nadalje, većina ovdje utvrđenih vrijednosti je u rasponu biljnog materijala odabranog za uzgoj u Poljskoj [74] iu skladu sa visokimarbutinsadržaj uzoraka listova španske medvjeđe bobice koji su prijavili Sonnenschein i Tegtmeier [42] prilikom odabira biljaka za uzgoj u Njemačkoj. Elitni genotipovi A. uva-ursi mogli su se vegetativno razmnožavati, ali većina dobijenih klonova nije uspjela tokom uspostavljanja na terenu, što je ograničavalo eksploataciju ovih resursa. Također smo opisali postojeće varijacije u sadržaju tri flavonoida (katehin, miricetin i kvercetinglukozid), kao i kafeinske kiseline među populacijama španjolskih medvjeđih bobica, te kako klimatske faktore (uglavnom globalno zračenje i padavine) koji su u korelaciji sa geografskom širinom i visinom gradijenti, utiču na tu varijaciju. Istovremeno, uprkos niskim nivoima varijabilnosti haplotipa i veličine genoma utvrđenih kod iberijske A. uva-ursi, genetska i citogenetska diferencijacija populacija bila je slabo, ali značajno povezana sa fitokemijskom raznovrsnošću. Sve u svemu, ovi rezultati naglašavaju da se mora uzeti u obzir učinak i genetskih i abiotskih faktora kako bi se objasnila intraspecifična fitokemijska varijabilnost koja se nalazi u biljkama iz divljih populacija.

CISTANCHE EFEKTI

Reference

1. Moore, BD; Andrew, RL; Külheim, C.; Foley, WJ Objašnjavanje intraspecifične raznolikosti u sekundarnim metabolitima biljaka u ekološkom kontekstu. New Phytol. 2014, 201, 733–750. [CrossRef] [PubMed]

2. Cheynier, V.; Comte, G.; Davies, KM; Lattanzio, V. Biljni fenoli: nedavni napredak u njihovoj biosintezi, genetici i ekofiziologiji. Plant Physiol. Biochem. 2013, 72, 1–20. [CrossRef]

3. Bernal, M.; Llorens, L.; Julkunen-Tiitto, R.; Badosa, J.; Verdaguer, D. Visinske i sezonske promjene fenolnih spojeva u listovima i kutikulama Buxus sempervirens. Plant Physiol. Biochem. 2013, 70, 471–482.[CrossRef] [PubMed]

4. Upton, R. (Ed.) Uva-ursi Leaf. Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. Standard analize, kontrole kvaliteta i terapije; American Herbal Pharmacopoeia: Scotts Valley, CA, SAD, 2008; 30p.

5. Evropska agencija za lijekove. Izvještaj o procjeni Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng. Folija. EMA/HMPC/750266/2016; Evropska agencija za lijekove: Amsterdam, Holandija, 6. 2018. Kanlayavattanakul, M.; Lourith, N. Biljke i prirodni proizvodi za liječenje hiperpigmentacije kože—pregled. Planta Med. 2018, 84, 988–1006. [CrossRef]

7. Migas, P.; Krauze-Baranowska, M. Značaj arbutina i njegovih derivata u terapiji i kozmetici. Phytochem. Lett. 2015, 13, 35–40. [CrossRef]

8. Seo, DH; Jung, JH; Lee, JE; Jeon, EJ; Kim, W.; Park, CS Biotehnološka proizvodnja arbutina (- i -arbutina), sredstava za posvjetljivanje kože i njihovih derivata. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012, 95, 1417–1425.[CrossRef]

9. Zhu, X.; Tian, ​​Y.; Zhang, W.; Zhang, T.; Guang, C.; Mu, W. Nedavni napredak u biološkoj proizvodnji -arbutina. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 8145–8152. [CrossRef] [PubMed]

10. Davey, M. Sekundarni metabolizam u kulturama biljnih ćelija. U Encyclopedia of Applied Plant Sciences, 2nd ed.; Thomas, B., Murphy, DJ, Murray, BG, Eds.; Elsevier: London, UK, 2017; Tom 2, str. 462–467. [CrossRef]

11. Kurkin, VA; Ryazanova, TK; Daeva, ED; Kadentsev, VI Sastojci listova Arctostaphylos uva-ursi. Chem. Nat. Compd. 2018, 54, 278–280. [CrossRef]

12. Panda, A.; Petrucci, R.; Marrosu, G.; Multari, G.; Romana-Gallo, F. HPLC-PDAESI-TOF/MS metaboličko profilisanje Arctostaphylos pungens i Arctostaphylos uva-ursi: Komparativna studija fenolnih jedinjenja iz metaboličkog ekstrakta lista. Phytochemistry 2015, 115, 79–88. [CrossRef]

13. Olennikov, DN; Chekhirova, GV 60-Galloylpicein i druga fenolna jedinjenja iz Arctostaphylos uva-ursi.Chem. Nat. Compd. 2013, 49, 1–7. [CrossRef]

14. Brewer, MS Prirodni antioksidansi: izvori, spojevi, mehanizmi djelovanja i potencijalne primjene.Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2011, 10, 221–247. [CrossRef]

15. Amarowicz, R.; Pegg, RB; Rahimi-Moghaddam, P.; Bare, B.; Weil, JA Kapacitet uklanjanja slobodnih radikala i antioksidativna aktivnost odabranih biljnih vrsta iz kanadskih prerija. Food Chem. 2004, 84, 551–562.[CrossRef]

16. Carpenter, R.; O'Grady, MN; O'Callaghan, YC; O'Brien, NM; Kerry, JP Procjena antioksidativnog potencijala ekstrakta sjemenki grožđa i medvjeđeg bobica u sirovoj i kuhanoj svinjetini. Meat Sci. 2007, 76, 604–610. [CrossRef][PubMed]

17. Mekinić, IG; Skroza, D.; Ljubenkov, I.; Katalinić, V.; Šimat, V. Antioksidativni i antimikrobni potencijal fenolnih metabolita iz tradicionalno korištenih mediteranskih biljaka i začina. Hrana 2019, 8, 579. [CrossRef]

18. Mohd Azman, NA; Gallego, MG; Segovia, F.; Abdullah, S.; Shaarani, SM; Almajano, MP Proučavanje svojstava ekstrakta listova medvjetke kao prirodnog antioksidansa u modelnoj hrani. Antioksidansi 2016, 5, 11.[CrossRef] [PubMed]

19. Pegg, RB; Amarowicz, R.; Naczk, M. Antioksidativna aktivnost polifenola iz ekstrakta lista medvjetke (Arctostaphylos uva-ursi L. Sprengel) u mesnim sistemima. U fenolnim spojevima u hrani i prirodnim zdravstvenim proizvodima; Shahidi, F., Ho, CT, Eds.; Američko hemijsko društvo: Washington, DC, SAD, 2005; str. 67–82.[CrossRef]

20. Wrona, M.; Blasco, S.; Becerril, R.; Nerín, C.; Sales, E.; Asensio, E. Antioksidativni i antimikrobni markeri byUPLC®–ESI-Q-TOF-MSE novog višeslojnog aktivnog pakovanja na bazi Arctostaphylos uva-ursi. Talanta2019, 196, 498–509. [CrossRef]

21. Maier, M.; Olbermann, AL; Renner, M.; Weidner, E. Pregled evropskih ljekovitih biljaka na njihov sadržaj tanina—Nova potencijalna sredstva za štavljenje za industriju kože. Ind. Crop. Prod. 2017, 99, 19–26. [CrossRef]

23. Boros, B.; Jakabová, S.; Madarász, T.; Molnár, R.; Galambos, B.; Kilár, F.; Fellinger, A.; Farkas, A. Validirana HPLC metoda za istovremeno kvantificiranje bergenina, arbutina i galne kiseline u listovima različitih vrsta Bergenia. Chromatographia 2014, 77, 1129–1135. [CrossRef]

23. Miaw-Ling, C.; Chur-Min, C. Simultano HPLC određivanje hidrofilnog sredstva za izbjeljivanje u kozmetičkom proizvodu. J. Pharm. Biomed. Anal. 2003, 33, 617–626. [CrossRef]

24. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. Jedan korak ekstrakcije u kvantitativnoj analizi listova arbutinina medvjeđeg bobica (Arctostaphylos uva-ursi) tečnom hromatografijom visokih performansi. Phytochem. Anal.2001, 12, 336–339. [CrossRef]

25. POWER. Biljke svijeta Online. Dostupno na mreži: http://www.plantsoftheworldonline.org/ (pristupljeno 29. aprila 2020.).

26. Saleem, A.; Harris, CS; Asim, M.; Cuerrier, A.; Martineau, L.; Haddad, PS; Arnason, JTRP-HPLC-DAD-APCI/MSD metoda za karakterizaciju medicinskih Ericaceae koju su koristile prve nacije Eeyou IstcheeCree. Phytochem. Anal. 2010, 21, 328–339. [CrossRef] [PubMed]

27. Stefanescu, BE; Szabo, K.; Mocan, A.; Crisan, G. Fenolna jedinjenja iz listova pet vrsta Ericaceae i njihova srodna bioraspoloživost i zdravstvene prednosti. Molecules 2019, 24, 2046. [CrossRef] [PubMed]

28. Onda, Y.; Mochida, K. Istraživanje genetske raznolikosti u biljkama korištenjem tehnika sekvencioniranja visoke propusnosti. Curr. Genom. 2016, 17, 358–367. [CrossRef] [PubMed]

29. Iannicelli, J.; Guariniello, J.; Tossib, VE; Regalado, JJ; Di Ciaccioa, L.; van Barene, CM; Pitta Álvarez, SI; Escandón, AS "Poliploidni efekat" u uzgoju aromatičnih i ljekovitih vrsta. Sci. Hortic. 2020,260, 108854. [CrossRef]

30. Leitch, IJ; Leitch, AR Raznolikost veličine genoma i evolucija u kopnenim biljkama. Raznolikost biljnog genoma, tom 2, Fizička struktura, ponašanje i evolucija biljnih genoma; Leitch, IJ, Greilhuber, J., Doležel, J., Wendel, JF, ur.; Springer: Beč, Austrija, 2013; str. 307–322. [CrossRef]

31. Bennett, MD; Leitch, IJ Količine nuklearne DNK u kritosjemenjačama — napredak, problemi i izgledi. Ann. Bot. 2005, 95, 45–90. [CrossRef]

32. Gregory, TR (Ed.) Evolucija genoma; Elsevier: San Dijego, Kalifornija, SAD, 2005.

33. Hoang, PN; Schubert, V.; Meister, A.; Fuchs, J.; Shubert, I. Varijacije u veličini genoma, volumenu ćelije i jezgra, broju hromozoma i lokusima rDNK među patkicama. Sci. Rep. 2019, 9, 3234. [CrossRef]

34. Knight, CA; Molinari, N.; Petrov, DA Hipoteza ograničenja velikog genoma: evolucija, ekologija i fenotip. Ann. Bot. 2005, 95, 177–190. [CrossRef]

35. Pellicer, J.; Hidalgo, O.; Dodsworth, S.; Leitch, IJ Raznolikost veličine genoma i njegov utjecaj na evoluciju kopnenih biljaka. Genes 2018, 9, 88. [CrossRef]

36. Carev, I.; Rušći´c, M.; Skoˇcibuši´c, M.; Maravi´c, A.; Siljak-Jakovlev, S.; Politico, O. Fitokemijska i citogenetska karakterizacija Centaurea solstitialis (Asteraceae) iz Hrvatske. Chem. Biodivers. 2017, 14, e1600213.[CrossRef]

37. Cole, IB; Cao, J.; Alan, RA; Saxena, PK; Murch, SJ Poređenje Scutellaria baicalensis, Scutellarialateriflora i Scutellaria racemosa: veličina genoma, antioksidativni potencijal i fitohemija. Planta Med. 2008, 74, 474–481. [CrossRef]

38. Carvalho, YGS; Vitorino, LC; de Souza, UJB; Bessa, LA Najnoviji trendovi u istraživanju genetske raznolikosti biljaka: Implikacije za očuvanje. Diversity 2019, 11, 62. [CrossRef]

39. Wei, S.; Yang, W.; Wang, X.; Hou, Y. Visoka genetska raznolikost u ugroženoj ljekovitoj biljci, Saussureainvolucrata (Saussurea, Asteraceae), u zapadnim planinama Tianshan, Kina. Conserv. Genet. 2017, 18,1435–1447. [CrossRef]

40. Chang, YJ; Cao, YF; Zhang, JM; Tian, ​​LM; Dong, XG; Zhang, Y.; Qi, D.; Zhang, XS Studija o raznolikosti hloroplastne DNK kultiviranih i divljih krušaka (Pyrus L.) u sjevernoj Kini. Tree Genet. Genomi 2017, 13, 44.[CrossRef]

42. Parejo, I.; Viladomat, F.; Bastida, J.; Codina, C. Varijacije sadržaja arbutina u različitim divljim populacijama Arctostaphylos uva-ursi u Kataloniji, Španija. J. Herbs Začini Med. Plants 2002, 9, 329–333. [CrossRef]

42. Sonnenschein, M.; Tegtmeier, M. Eksperimenti pripitomljavanja medvjetke (Arctostaphylos uva-ursi (L.)Spreng.). J. Med. Začinske biljke 2012, 17, 124–128.

43. Chen, HY; Lin, YC; Hsieh, CL Evaluacija antioksidativne aktivnosti vodenog ekstrakta nekih odabranih nutriceutskih biljaka. Food Chem. 2008, 104, 1418–1424. [CrossRef]

44. Del Valle, JC; Buide, ML; Casimiro-Soriguer, I.; Whittall, JB; Narbona, E. O akumulaciji flavonoida u različitim dijelovima biljke: Obrasci varijacija među pojedincima i populacijama u obalnom kampionu (Silene littorea). Front. Plant Sci. 2015, 6, 939. [CrossRef]

45. Martínez-Cadenas, C.; López, S.; Ribas, G.; Flores, C.; García, O.; Sevilla, A.; Smith-Zubiaga, I.; Ibarrola-Villaba, M.; Pino-Yanes, MM; Gardeazabal, J.; et al. Simultana selekcija pročišćavanja na alelu MC1R predaka i pozitivna selekcija na alelu rizika od melanoma v60l u južnoevropskih stanovnika. Mol. Biol. Evol. 2013, 30, 2654–2665. [CrossRef]

46. ​​Jakaaola, L.; Hohtola, A. Utjecaj geografske širine na biosintezu flavonoida u biljkama. Okruženje biljnih ćelija. 2010, 33,1239–1247. [CrossRef]47. Martz, F.; Peltola, R.; Fontana, S.; Duval, RE; Julkunen-Tiitto, R.; Stark, S. Utjecaj geografske širine i nadmorske visine na terpenoidni i rastvorljivi fenolni sastav iglica kleke (Juniperus communis) i procjena njihove antibakterijske aktivnosti u borealnoj zoni. J. Agric. Food Chem. 2009, 57, 9575–9584. [CrossRef]

48. Yang, B.; Zheng, J.; Laaksonen, O.; Tahvonen, R.; Kallio, H. Efekti geografske širine i vremenskih uslova na fenolna jedinjenja u sortama ribizle (Ribes spp.). J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 3517–3532. [CrossRef][PubMed]

50. Lätti, AK; Jaakola, L.; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Varijacije antocijana i flavonola u bobbilnim bobicama (Vaccinium uliginosum L.) u Finskoj. J. Agric. Food Chem. 2010, 58, 427–433. [CrossRef] [PubMed]

50. Lätti, AK; Riihinen, KR; Kainulainen, PS Analiza varijacije antocijana u divljim populacijama borovnice (Vaccinium myrtillus L.) u Finskoj. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 190–196. [CrossRef]

51. Monschein, M.; Iglesias, J.; Kunert, O.; Bucar, F. Fitohemija vrijeska (Calluna vulgaris (L.) Hull) i njegova visinska promjena. Phytochem. Rev. 2010, 9, 205–215. [CrossRef]

52. Perry, NB; Burgess, EJ; Rodríguez Guitián, MA; Romero Franco, R.; López Mosquera, E.; Smallfield, BM; Joyce, NI; Littlejohn, RP Seskviterpenski laktoni u Arnica montana: Helenalin i dihidrohelenalinhemotipovi u Španiji. Planta Med. 2009, 75, 660–666. [CrossRef] [PubMed]

53. Abdala-Roberts, L.; Assmann, S.; Berny-Mier, Y.; Terán, JC; Covelo, F.; Glauser, G.; Moreira, X. Biotički andabiotički faktori povezani s visinskim varijacijama u biljnim osobinama i biljojedi kod dominantne vrste hrasta.Am. J. Bot. 2016, 103, 2070–2078. [CrossRef] [PubMed]

54. Bentley, J.; Moore, JP; Farrant, JM Metabolomics kao dopuna filogenetici za procjenu intraspecifičnih granica u ljekovitom grmu koji je tolerantan na isušivanje Myrothamnus flabellifolia (Myrothamnaceae). Phytochemistry 2019, 159, 127–136. [CrossRef] [PubMed]

55. Siljak-Yakovlev, S.; Pustahija, F.; Šolić, EM; Bogunić, F.; Muratović, E.; Bašić, N.; Catrice, O.; Brown, C. Ka bazi podataka veličine genoma i broja hromozoma balkanske flore: C-vrednosti u 343 taksona sa novim vrednostima za 252. Adv. Sci. Lett. 2010, 3, 190–213. [CrossRef]

56. Garrido, JL; Alcantara, JM; Rey, PJ; Medrano, M.; Guitián, J.; Castellanos, MC; Bastida, JM; Jaime, R.; Herrera, CM Geografska genetička struktura iberijskih kolumbina (gen. Aquilegia). Plant Syst. Evol. 2017, 303, 1145–1160. [Unakrsna referenca

57. Listl, D.; Poschlod, P.; Reisch, C. Phylogeography of a hard rock survivor in European suhsslands.PLoS ONE 2017, 12, e0179961. [CrossRef]

58. Olalde, M.; Herrán, A.; Espinel, S.; Goicoechea, P. Filogeografija bijelog hrasta na Iberijskom poluotoku.Ecol. Manag. 2002, 156, 89–102. [CrossRef]

59. Barrett, SCH Utjecaji klonalnosti na seksualnu reprodukciju biljaka. Proc. Natl. Akad. Sci. SAD 2015, 112,8859–8866. [CrossRef] [PubMed]

60. Skowyra, M.; Falguera, V.; Gallego, G.; Peiro, S.; Almajano, MP Učinak ekstrakata Perilla frutescens na oksidativnu stabilnost modelnih emulzija hrane. Antioksidansi 2014, 3, 38–54. [CrossRef] [PubMed]

61. Pascoal, A.; Quirantes-Piné, R.; Fernando, AL; Alexopoulou, E.; Segura-Carretero, A. Fenolni sastav i antioksidativna aktivnost listova kenafa. Ind. Crop. Prod. 2015, 78, 116–123. [CrossRef]

62. Pellicer, J.; Garnatje, T.; Molero, J.; Pustahija, F.; Siljak-Jakovlev, S.; Vallès, J. Porijeklo i evolucija južnoameričkih vrsta Artemisia (Asteraceae); dokazi iz molekularne filogenije, ribosomalne DNK i podataka o veličini genomeze. Aust. J. Bot. 2010, 58, 605–616. [CrossRef]

63. Doležel, J. Protočna citometrijska analiza sadržaja nuklearne DNK u višim biljkama. Phytochem. Anal. 1991, 2,143–154. [CrossRef]

64. Doyle, JJ; Doyle, JL Brza procedura izolacije DNK za male količine svježeg tkiva lista. Phytochem. Bull.Bot. Soc. Am. 1987, 19, 11–15.

65. Vitales, D.; Feliner, GN; Vallès, J.; Garnatje, T.; Firat, M.; Álvarez, I. Nova cirkumkripcija mediteranskog roda Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae) na osnovu plastidnih i nuklearnih DNK markera. Phytotaxa 2018, 349, 1–17. [CrossRef]

66. Hall, TA BioEdit: Uređivač i program za analizu bioloških sekvenci prilagođen korisniku za Windows95/98/NT. Nukleinske kiseline Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

67. Thompson, JD; Higgins, DG; Gibson, TJ CLUSTAL W: Poboljšanje osjetljivosti progresivnog poravnanja višestrukih sekvenci kroz ponderiranje sekvence, kazne za razmake specifične za poziciju i izbor matrice težine. Nukleinske kiseline Res. 1994, 22, 4673–4680. [CrossRef]

68. Rozas, J.; Ferrer-Mata, A.; Sánchez-DelBarrio, JC; Guirao-Rico, S.; Librado, P.; Ramos-Onsins, SE; Sánchez-Gracia, A. DnaSP 6: Analiza polimorfizma DNK sekvence velikih skupova podataka. Mol. Biol. Evol.2017, 34, 3299–3302. [CrossRef] [PubMed]

69. Borchsenius, F. FastGap, verzija 1.2; Odsjek za bionauke, Univerzitet Aarhus: Aarhus, Danska, 2009; Dostupno na internetu: http://www.aubot.dk/FastGap_home.htm (pristupljeno 1. jula 2019.).

70. Clement, M.; Posada, DCKA; Crandall, KA TCS: Kompjuterski program za procjenu genealogija gena. Mol. Ecol. 2000, 9, 1657–1659. [CrossRef] [PubMed]

71. Leigh, JW; Bryant, D. Popart: Softver sa svim funkcijama za izgradnju mreže haplotipova. Metode Ecol. Evol.2015, 6, 1110–1116. [CrossRef]

72. Fox, J. Početak rada s R commanderom: grafički korisnički interfejs osnovne statistike za RJ Stat. Softw.2005, 14, 1–42. [CrossRef]

73. Oksanen, J.; Blanchet, FG; Kindt, R.; Legendre, P.; O'Hara, RB; Simpson, GL; Solymos, P.; Stevens, M.; Wagner, H. Vegan: Paket ekologije zajednice. R paket verzija 1.17-4. 2010. Dostupno na internetu: http://CRAN.R-project.org/package=vegan (pristupljeno 19. septembra 2010.).74. Malinowska, H. Selekcije medvjeđe bobice (Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng.) iz prirodnih populacija u Poljskoj. Acta Soc. Bot. Pol. 1995, 64, 91–96. [CrossRef]