Očev nikotin poboljšava pamćenje straha, smanjuje administraciju nikotina i mijenja genetsku i neuronsku funkciju hipokampusa kod potomstva

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|Ištvan Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1

1Odjel za biobihejvioralno zdravlje, Penn State University, University Park, Pennsylvania

2Odsjek za farmakologiju, Vanderbilt School of Medicine, Nashville, Tennessee

3 Farmaceutski koledž, Univerzitet Kentucky, Lexington, Kentucky

4Odsjek za neurobiologiju i ponašanje, Kalifornijski univerzitet Irvine, Irvine, Kalifornija

5Bioinformatika, biohemija i molekularna biologija, Penn State University, University Park, PA

6Odjel za psihologiju, Temple University, Philadelphia, Pennsylvania

Abstract

Upotreba nikotina i dalje je veoma rasprostranjena kod duhana i proizvoda e-cigareta koji se konzumiraju širom svijeta. Međutim, sve veći dokazi o transgeneracijskom epigenetskom nasljeđu sugeriraju da upotreba nikotina može promijeniti ponašanje i neurobiologiju u narednim generacijama. Testirali smo efekte kronične izloženosti očevu nikotinu kod C57BL6/J miševa na uslovljavanje straha kod F1 i F2 potomaka, kao i na uvjetovano izumiranje straha i spontani oporavak, samodavanje nikotina, holinergičko funkcioniranje hipokampusa, ekspresiju RNK i metilaciju DNK u F1. potomstvo. Izloženost očevu nikotinu je bila povezana sa pojačanim kontekstualnim i indikativnim uslovljavanjem straha i spontanim oporavkom ugašenih sjećanja na strah. Dalje, pojačanje nikotina je smanjeno kod miševa koji su potomci nikotina, kao što je procijenjeno u paradigmi samo-administriranja. Ovi fenotipovi ponašanja bili su povezani sa izmijenjenim odgovorom na nikotin, pojačanim vezivanjem hipokampalnog nikotinskog acetilkolinskog receptora, smanjenim izazvanim holinergičnim strujama hipokampusa i promijenjenom metilacijom i ekspresijom hipokampalnih gena povezanih s neuralnim razvojem i plastičnošću. Analiza ekspresije gena ukazuje na multigeneracijske efekte na šire mreže gena koje su potencijalno uključene u neuroplastičnost i mentalne poremećaje. Promjene u uslovljenosti strahom na sličan način sugeriraju fenotipove analogne anksioznim poremećajima sličnim posttraumatskom stresu.

KLJUČNE RIJEČI: kolinergik, hipokampus, učenje, višegeneracijski, nikotinski, transgeneracijski

efekti cistanchea

1. UVOD

Akumulirani dokazi sugeriraju da se utjecaj izlaganja drogama proteže izvan pojedinca i utiče na fiziološke i bihevioralne fenotipove kod neizloženog potomstva.{0}} Karakterizacija efekata nikotina kroz generacije je kritična s obzirom na prevalence upotrebe duhanskih proizvoda4 i dramatičan porast upotrebe e-cigareta.5 Svojim efektima na holinergičke sisteme mozga, izlaganje nikotinu proizvodi značajne promjene u funkciji mozga koje mogu biti u osnovi ovisnosti o nikotinu i doprinijeti povećanom riziku od psihijatrijskih poremećaja, uključujući depresiju6 i anksioznost.7 Epigenetske modifikacije nizvodno od holinergičke aktivacije mogu omogućavaju trajne efekte na ćelijsku funkciju i funkciju kola.8,9 Do nedavno se vjerovalo da su ove epigenetske modifikacije izbrisane nakon uspostavljanja zametne linije i tako izdvojene iz sljedećih generacija. Međutim, epigenetske modifikacije, uključujući metilaciju DNK, posttranslacijske modifikacije histona i nekodirajuće RNA, stečene u jednoj generaciji, mogu se naslijediti u sljedećoj generaciji.10,11 Ove epigenetske modifikacije mogu posredovati multigeneracijske i transgeneracijske efekte izlaganja roditelja nikotinu na ponašanje potomaka i neurobiologiju .

Studije o glodarima iz više, nezavisnih laboratorija počele su identificirati višegeneracijske i transgeneracijske posljedice izloženosti roditelja nikotinu. Ovaj rad je do sada identifikovao efekte izlaganja roditelja nikotinu na fenotipove depresije i anksioznosti,1 kognitivnu fleksibilnost,2 ponašanja nalik poremećaju pažnje i hiperaktivnosti (ADHD)3 i ekspresiju gena.1,2 Višegeneracijske i transgeneracijske posljedice Izloženost nikotinu može utjecati na endofenotipove uključene u ovisnost o nikotinu i mentalno zdravlje. Na primjer, pokazali smo da izlaganje nikotinu modulira kontekstualno uslovljavanje straha, model učenja o strahu ovisno o hipokampusu koji je povezan s osjetljivošću na poremećaje mentalnog zdravlja kao što su posttraumatski stresni poremećaj (PTSP) i ovisnost.12-14 Nikotinski efekte na učenje o kontekstualnom strahu modulira hipokampus.15,16 Otkrili smo da akutna izloženost nikotinu pojačava učenje o strahu ovisno o hipokampusu,15,17 smanjuje nestanak kontekstualnog straha,18,19 i povećava spontani oporavak kontekstualnog straha nakon izumiranje.18 Međutim, multigeneracijski i transgeneracijski efekti očeva izlaganja nikotinu na ove fenotipove nisu proučavani. Nadalje, nijedna prethodna studija nije okarakterisala višegeneracijske efekte nikotina na holinergičku funkciju. Multigeneracijsko nasljeđivanje se odnosi na fenotipove koji nastaju u generaciji neposredno nakon izloženih jedinki, dok se transgeneracijsko nasljeđivanje sastoji od nasljeđivanja epigenetskih informacija između generacija posredovanih zametnom linijom u odsustvu direktnih utjecaja okoline koji dovode do fenotipskih varijacija.11 Ovdje smo ispitali obje višegeneracijske varijacije. i transgeneracijski učinci očeva izloženosti nikotinu na kontekstualno i nagovještavano učenje straha u F1 i F2 generaciji, kao i na samodavanje nikotina, vezivanje hipokampalnog nikotinskog acetilkolinskog receptora (nAChR), holinergičko funkcioniranje hipokampusa, ekspresiju hipokampalnih gena i hipokampalni DNK metil F1 generacija. Pretpostavljamo da će očeva izloženost nikotinu uticati na uslovljavanje straha, ekspresiju gena hipokampusa i funkciju kod potomaka i unuka.

efekti ekstrakta cistanche

2 METODE I MATERIJALI

2.1 Subjekti

Subjekti su bili mužjaci i ženke miševa C57BL/6J (8-20 sedmica starosti, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Sa izuzetkom smještaja za haremski uzgoj, sve životinje su bile smještene u grupama sa 12-satnim ciklusom svjetlo/mrak i ad libitum pristupom hrani i vodi. Tokom samoprimjene, subjektima je hrana bila ograničena na 85 do 90 posto njihove tjelesne težine za slobodno hranjenje, a voda je davana ad libitum. Sva testiranja ponašanja obavljena su između 9:00 AM i 6:00 popodne. Sve procedure su provedene u skladu sa NIH Vodičem za njegu i korištenje laboratorijskih životinja i odobrene od strane odbora Penn State University, Temple University ili Irvine Univerziteta Kalifornije IACUC.

2.2 Očeva izloženost nikotinu

Muškarci (8 sedmica) primali su 0,9 posto sterilne fiziološke otopine ili soli nikotin hidrogen tartrata (12,6 mg/kg/dan, slobodna osnovna težina—Fisher Scientific, Waltham, MA ili MP Biomedical, Santa Ana, Kalifornija) otopljenu u 0.9 posto sterilna fiziološka otopina, dostavljena supkutano putem osmotskih mini pumpi (Alzet, Model 1004, Durect, Cupertino, CA) tokom 28 dana. Ova doza proizvodi nivoe nikotina i kotinina u plazmi koji su uporedivi sa onima koji se vide kod umerenih pušača.20,21

2.3 Generacija F1 i F2 miševa

Poluvrijeme nikotina kod miševa je otprilike 6 minuta.22 Ranije je pokazano da efekti povlačenja nikotina nestaju do 4 dana nakon uklanjanja nikotina.{3}} Stoga je potrebno 4-dnevno kašnjenje između tretmana nikotinom i oplemenjivanje je provedeno kako bi se osigurala sistemska eliminacija nikotina prije uzgoja. Mužjaci miševa su stavljeni u kaveze sa dvije naivne ženke C57BL/6 J (8-20 sedmica starosti) na 2 sedmice da bi se dobilo F1 potomstvo. F2 miševi su generirani parenjem naivnih mužjaka F1 miševa sa naivnim ženkama.

2.4 Uslovljavanje straha

Postupci uslovljavanja straha i izumiranja su detaljno opisani ranije.19 Ukratko, miševi su obučeni i testirani u komorama za prigušivanje buke (18,8 × 20 × 18,3 cm, 65 dB pozadinska buka; MED Associates, St. Albans, VT). F1 i F2 miševi su bili uslovljeni strahom sa dva uslovljena stimulusa (CS, 30 s, 85‐dB bijeli šum) – neuslovljeni stimulus (SAD, 2 s, 0,57‐mA šokovi stopala) uparivanja razdvojenih za 120 sekundi. Da bi se ispitali akutni efekti nikotina na uslovljavanje straha kod F1 i F2 miševa, potomci su primili akutni nikotin (0,09 mg/kg, NIC slobodna težina, ip; nikotin hidrogen tartratna sol, Fisher Scientific) ili fiziološki rastvor (SAL) 2 do 4 minute prije na sesije obuke i testiranja. Dvadeset četiri sata nakon treninga, miševi su vraćeni u kontekst treninga na 5 minuta kako bi se procijenilo kontekstualno zamrzavanje. Nakon kontekstualnog testiranja, miševi su smješteni u različite komore kako bi se procijenilo učenje o strahu. Eksperimentatori zaslijepljeni za uslove koji su procijenili smrzavanje, definirano kao odsustvo voljnog pokreta osim disanja, putem nepristrasne metode uzorkovanja vremena.19 Da bi se ispitali potencijalni efekti gornje granice tokom testiranja, odvojena grupa F1 miševa je prošla identičnu obuku sa samo jednim CS-US uparivanje, te kontekstualno izumiranje straha i spontani oporavak su također ispitani. Izumiranje straha se dogodilo tokom pet uzastopnih sesija počevši od dana nakon kontekstualnog testiranja straha. Nakon posljednje sesije izumiranja, miševi su ostavljeni neometani u svojim kućnim kavezima 7 dana, a zatim su ponovo testirani u kontekstu treninga za spontani oporavak. Da bi se utvrdilo da li su bilo kakve uočene razlike u uslovljenosti strahom uzrokovane razlikama u osjetljivosti na šok, anksioznosti ili širem nedostatku učenja, mužjaci i ženke NIC- i SAL-Sired životinje su dodatno testirane na otvorenom polju, osjetljivost na šok, povišeni plus labirint ( EPM) i nove paradigme za prepoznavanje objekata (pogledajte Informacije o podršci za potpune metode i rezultate).

2.5 Samoprimjena hrane i nikotina intravenozno

A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 peleta po sesiji u tri naredne sesije), subjekti su kateterizirani jugularnom venom pod anestezijom izofluranom (1 posto -3 posto)/kiseoničkim parama, kao što je prethodno opisano.26 Miševima je bilo dozvoljeno više od ili jednako 72 sata da se oporave od operacije prije pristupa da ponovo odgovorim za nagradu za hranu. Ponovno uspostavljanje odgovora na hranu osigurava da su se miševi dovoljno oporavili nakon intravenske operacije i da pokazuju normalan operantni odgovor nakon kašnjenja u pristupu operantnim komorama. Miševima je tada dozvoljeno da intravenozno (IV) sami daju nikotin tokom jednosatnih dnevnih sesija, 6 do 7 dana u sedmici (nikotin hidrogen tartratna sol rastvorena u 0.9 posto sterilne fiziološke otopine, {{1{ {12}}}}.03 mg/kg/infuzija, slobodna bazna težina; MP Biomedical, Santa Ana, CA). IV nikotin je isporučen Razel pumpom za špric (Med Associates). Svaka sesija je imala dvije poluge koje se mogu uvlačiti (jedna aktivna, jedna neaktivna). Ispunjavanje kriterija odgovora na aktivnoj poluzi rezultiralo je isporukom IV infuzije nikotina (0.{{20}}3 ml zapremine infuzije; raspored FR5TO20 s). Reakcije na neaktivnu polugu su zabilježene, ali nisu imale planirane posljedice. Nakon osam sesija akvizicije pri 0,03 mg/kg/infuziji, doza infuzije je prešla na 0,1 mg/kg/infuziji tokom šest sesija. Za svaku dozu, srednji unos u posljednje tri sesije je korišten za statističke analize. Kateteri su svakodnevno ispirani fiziološkom sterilnom fiziološkom otopinom (0,9 posto w/v) koja je sadržavala heparin (100 USP jedinica/ml). Prohodnost katetera je verifikovana sa Brevitalom (metoheksital natrijum, Eli Lilly, Indianapolis, IN) nakon faze samoprimjene nikotina. Da bi se procijenilo ponašanje povezano s relapsom, miševi su testirani na inkubaciju žudnje nakon sesije neposredno nakon posljednje doze od 0,1 mg/kg/infuzione intravenske samoprimjene nikotina; u ovoj proceduri, miševima je dozvoljeno da reaguju na aktivnu polugu, ali ne primaju infuzije nikotina. Na prvoj bazičnoj sesiji inkubacije (1. dan), miševi su smješteni u operantne komore prema rasporedu FR5TO20 s uz uslovnu aktivaciju svjetla. Nakon toga, miševi su smješteni u kućne kaveze 20 dana. 21. dana apstinencije, miševi su pregledani na inkubaciju žudnje, pri čemu je aktivna signalna lampica isporučena prema rasporedu FR5TO20 sec. Studije su sproveli eksperimentatori koji su bili zaslijepljeni grupnim uslovima, a odgovori ponašanja su automatski zabilježeni softverom MedAssociates.

2.6 Vezivanje na nikotinski acetilkolinski receptor

Test vezivanja radioliganda16 izveden je korištenjem hipokampusa od 8 sedmica starih NIC-Sired (5 M i 10F) i SAL-Sired (9 M i 6F) F1 miševa. Uzorci su homogenizovani korišćenjem pufera za lizu (5 mM Tris plus 5 mM EDTA plus 5 mM EGTA), centrifugirani na 100 000 g 30 minuta na 4 stepena, resuspendovani u puferu za lizu i ponovo centrifugirani. Pelete su resuspendirane u puferu Tris/10 posto saharoze i inkubirane sa [3 H] epibatidinom ([3 H]EB) (~2 nM na osnovu 27,28) (specifična aktivnost 54,1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) 1 sat na sobnoj temperaturi. [3 H]EB je izabran za vezivanje nAChR, jer su prethodni rezultati pokazali da hipokampalni heteromerni 4 2 nAChR posreduju u efektima nikotina na uslovljavanje straha.17 Nespecifično vezivanje je procenjeno u prisustvu 300 μM nikotina (nikotin hidrogen tartratna so rastvoren u Tris puferu, koncentracija slobodne baze). [3 H]EB-vezani nAChR su filtrirani (kombiner ćelija sa 24 bunara, Brandel Co, Gaithersburg, MD), a tečnim scintilacionim brojačem (Tri-Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) je izmerena radioaktivnost filtera. Specifično vezivanje izraženo kao fmol/mg tkiva izračunato je kao razlika između ukupnog i nespecifičnog vezivanja.16

2.7 In vivo amperometrijski holinergički snimci

Odvojena kohorta naivnih miševa od 10- do 20 sedmica starih NIC-Sired i SAL-Sired F1 miševa korištena je za procjenu promjena u hipokampalnom holinergičkom prijenosu pomoću amperometrije. Mikroelektrode na keramičkoj bazi (Center for Microelectrode Technology, Lexington, KY), sa 4 (15 × 333 μm) platinastih mjesta za snimanje raspoređenih u parove (gornji i donji), obložene su holin oksidazom (EC broj 1.1.3.17; Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO), kao što je ranije objavljeno.29 Elektrode su elektropolimerizirane sa meta-fenilendiaminom (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) kako bi se poboljšala selektivnost za detekciju holinskih struja. Mikroelektrode sa osetljivošću većom ili jednakom od 3pA/μM i granicom detekcije manjom ili jednakom 400 nM za holin su korišćene da bi se obezbedio osetljiv indeks oslobađanja acetilholina (ACh).30 Životinje su anestezirane uretanom (1,2-1,5). g/kg, ip), a mikroelektrode obložene enzimima stereotaksički su spuštene u dorzalne (A/P ‐1,7 mm, M/L ± 1,5 mm, D/V ‐2,3 mm) ili ventralne (A/P –3,1 mm, M /L ± 3,0 mm, D/V -4,3 mm) hipokampus. Ventralni i dorzalni hipokampus su evaluirani odvojeno, jer različito doprinose kontekstualnom uslovljavanju straha: ventralni hipokampus (vHPC) ima istaknutiju ulogu u povezivanju i izražavanju straha, dok je dorzalni hipokampus (DHCP) kritičan za kontekstualnu memoriju.31 Ag/ AgCl referentne elektrode su implantirane u kontralateralni rostralni korteks.

Amperometrijska snimanja su sprovedena na 2 Hz primjenom fiksnog potencijala od plus 0.7 V, a podaci su digitalizirani (potenciostat FAST-16, Quainton, Nicholasville, KY). Pozadinske struje su stabilizovane 60 minuta, a zatim su lekovi aplicirani u hipokampus pomoću staklene kapilare (prečnik vrha: 15 μm) pričvršćene na elektrodu. Oslobađanje ACh izazvano depolarizacijom mjereno je primjenom kratkih impulsa kalijuma (KCl 70 mM; 100 NL) ili NIC (1 mM slobodne baze, nikotin tartarat; 100 NL) pri 2 do 10 psi svake 2 minute. Snimci su uravnoteženi za hipokampalni region (dorzalni ili ventralni) i lek (kalijum ili NIC). Amplitude signala holina mjerene su promjenom struje na kanalu obloženom enzimom u odnosu na osnovnu struju i pretvorene u μM ekvivalente holina na osnovu in vitro kalibracije. Samoreferenciranje je usvojeno da bi se eliminisali artefakti oduzimanjem struja iz sentinel kanala.29 Postavljanje mikroelektroda je verifikovano Nisslovim bojenjem koronalnih hipokampalnih sekcija (Slika S1). Za statističku analizu korišteni su prosjek od dva odgovora po manipulaciji lijekom po životinji.

2.8 Statistička analiza

Statistička poređenja su obavljena pomoću SPSS (IBM, Armonk, NY) ili GraphPad Prism (La Jolla, Kalifornija, SAD). Outliers su određeni vrijednostima 2 standardne devijacije iznad srednje vrijednosti. Ako je otkrivena odstupanja, informacije se uključuju u odjeljak s rezultatima. Kriterijum za značajnost je postavljen na=.05. Prvobitno je izvršena statistička analiza uključujući spol kao faktor za sve eksperimente testiranja i muškog i ženskog potomstva. Analize su srušene u odnosu na spol kada nisu otkrivene trosmjerne ili dvosmjerne interakcije sa polom (P > 0,05). Podaci su analizirani t-testom, 1-way ili 2-way ANOVA, prema potrebi. Značajne glavne efekte ili efekte interakcije pratila su LSD post hoc poređenja. Ponovljene mjerenja ANOVA su praćene Bonferronijevim post hoc poređenjem sa korekcijom za višestruka poređenja. Ako su otkrivene nejednake varijanse, korišten je Welchov t-test za nejednake varijanse i stupnjevi slobode su zaokruženi naniže.

2.9 Izolacija RNA/DNK

Odrasli F1 miševi (stari 8 sedmica; n=3 M i 3 F po grupi) su eutanazirani putem cervikalne dislokacije. Hipokampi su brzo raščlanjeni na ventralne i dorzalne dijelove (u omjeru 1:1), skupljeni s lijeve i desne strane i brzo zamrznuti na suhom ledu. DNK i RNK su zajedno izolovane i pročišćene pomoću AllPrep DNA/RNA Mini Kita (Qiagen, Valencia, CA). Koncentracija i kvaliteta RNK i DNK procijenjeni su korištenjem NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) i Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Za ekstrakcije RNK, minimalni broj integriteta RNK (RIN) bio je 8,5.

2.10 Analiza transkriptoma preko

Biblioteke sekvencioniranja RNA pripremili su Instituti Huck iz Genomske jezgre životne sredine (Penn State University) za jednostrano čitanje od 150 bp koristeći Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) i sekvenciran na Illumina HiSeq 2500 u brzom načinu rada (tri uzastopna rada sa približno 10 milion čitanja po uzorku). FASTQ datoteke su provjerene kvalitete putem FASTQC-a i imale su srednju vrijednost po čitanju Phred kvaliteta veće od 30 (tj. manje od 0,1 posto greške sekvenciranja). FASTQ fajlovi su usklađeni sa referentnim genomom miša (mm10; UCSC Genome Browser) koristeći TopHat (v2.1.0)32 na Galaxy Project33. Cufflinks i Cuffmerge (v2.2.1.0)34 su korišteni za sastavljanje transkripata iz mapiranih čitanja i spajanje datoteka transkripta za konačno sklapanje transkriptoma. P vrijednosti prilagođene stopi lažnog otkrića (FDR) izračunate su za diferencijalnu ekspresiju gena iz NIC-Sired i SAL-Sired uzoraka koristeći Cuffdiff (v2.2.1.3),34 sa standardnim FDR graničnim vrijednostima od 0,05,35. Deponovani su skupovi podataka transkriptoma na Gene Expression Omnibus.

2.11 Analiza obogaćivanja

Diferencijalno eksprimirani geni analizirani su analizom puteva genijalnosti (IPA, pokrenut u decembru 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, Kalifornija, SAD)36 kako bi se otkrilo potencijalno obogaćivanje asocijativnih bioloških mreža. Parametri pokretanja specificirali su maksimalno 35 molekula po genskoj mreži i ograničili analizu na CNS tkivo ili ćelijske linije sisara. Statistička značajnost za obogaćivanje određena je korištenjem desnorepog Fisherovog egzaktnog testa ispravljenog za višestruko testiranje.

2.12 Ciljano sekvenciranje bisulfita

Za analizu metilacije DNK korišćena je DNK ko-izolovana sa RNK (videti odeljak 2.9). RNA-seq je identifikovao 952 i 162 različito eksprimiranih gena u vHPC i DHCP, respektivno. 1010 jedinstveni geni sa ovih kombinovanih lista odabrani su za obogaćivanje bisulfit-seq koristeći prilagođeni SeqCap Epi Enrichment System (Roche, Pleasanton, CA, SAD; Tabela S1).38 Ciljani bisulfit sekvencioniranje je obavljeno na Penn State Huck institutima u jezgru Life Sciences Genomics Core Facility. Biblioteke su konstruisane korišćenjem KAPA Hyper Prep kita (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). Biblioteke konvertovane natrijum bisulfitom su PCR amplificirane i obogaćene za odabrane genomske regije korištenjem prilagođenog skupa sonde za hvatanje (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, Kalifornija, SAD). Uhvaćena DNK je sekvencionirana na Illumina HiSeq 2500 koristeći 100 nt čitanja uparenih krajeva. FASTQ fajlovi su provjereni kvalitetom putem FASTQC. Sekvence Illumina adaptera su uklonjene, a baze niske kvalitete su izrezane pomoću Trimmomatic-a.39 Niskokvalitetno obrezivanje baze je izvedeno pristupom kliznog prozora, obrezivanje kada je prosječan kvalitet unutar prozora od četiri osnovna para pao ispod praga od 20, sa minimalna dužina čitanja od 35. Nakon skraćivanja, FASTQ datoteke su imale srednje ocjene kvaliteta Phred po čitanju veće od 30 (tj. manje od 0,1 posto greške sekvenciranja). Obrezana očitanja su mapirana na referentni genom miša (mm10) korištenjem Bowtie240 implementiranog u Bismarku.41 Ekstrakt metil_ unutar Bismarka korišten je za ekstrakciju informacija o CpG metilaciji i za kreiranje izvještaja o metilaciji. MethylKit42 je korišten za analizu diferencijalno metiliranih regija (DMR). Status metilacije je sažet u nepreklapajućim prozorima od 500 parova baza i izvršena je diferencijalna analiza metilacije, sa standardnim FDR od 0.05.35. Skupovi podataka su deponovani u Gene Expression Omnibus.

Prednosti ekstrakta cistanche

3 REZULTATA

3.1 Očev nikotin pojačava kontekstualno uslovljavanje straha i preokreće akutno nikotinsko pojačavanje kontekstualnog straha kod miševa F1 i F2 generacije

NIC-Sired i SAL-Sired F1 mužjaci i ženke miševa su bili uslovljeni strahom nakon akutne primjene SAL ili NIC (0.09 mg/kg ip, Slika 1A). Kompletna analiza osnovnog stanja, pre-CS i CS zamrzavanja je uključena u prateće informacije. 3-smjerna ANOVA kontekstualnog zamrzavanja s tretmanom potomaka, akutnim liječenjem lijekovima i seksom kao faktorima otkrila je značajnu interakciju otac × akutni tretman lijekom (F(1,36)=32.75, P < .{{27="" }}01).="" budući="" da="" nije="" bilo="" značajne="" interakcije="" između="" spola="" i="" oca="" ili="" akutnog="" liječenja="" lijekovima,="" obavljena="" je="" dvosmjerna="" anova="" srušena="" po="" spolu="" i="" otkrila="" je="" značajnu="" interakciju="" oca="" ×="" interakciju="" akutnog="" liječenja="" lijekovima="" (f(1,40)="20.96" ,="" p="">< .001).="" post="" hoc="" poređenja="" su="" pokazala="" da="" su="" nic-sired="" f1="" miševi="" tretirani="" fiziološkom="" otopinom="" pokazali="" pojačano="" kontekstualno="" stanje="" straha="" u="" poređenju="" sa="" sal-sired="" f1="" miševima="" tretiranim="" fiziološkom="" otopinom="" (t20="2.73," p="">< .05).="" u="" skladu="" s="" prethodnim="" nalazima,43="" akutni="" nic="" u="" dozi="" od="" 0,09="" mg/kg="" doveo="" je="" do="" pojačanog="" kontekstualnog="" uslovljavanja="" straha="" kod="" sal-sired="" miševa="" (t22="2.99," p="">< .01).="" međutim,="" akutni="" nic="" pri="" dozi="" od="" 0,09="" mg/kg="" poremetio="" je="" kontekstualno="" uslovljavanje="" straha="" kod="" miševa="" koji="" su="" rođeni="" od="" nic="" (t18="3.36," p="">< .01).="" sve="" u="" svemu,="" nivoi="" zamrzavanja="" konteksta="" kod="" nic-sired="" nic="" miševa="" bili="" su="" uporedivi="" sa="" onima="" uočenim="" kod="" sal-sired="" sal="" miševa="" pri="" oba="" 0,09="" mg/kg="" (p=""> 0,05).

Dodatno, mužjaci i ženke NIC- i SAL-Sired životinja testirani su na osjetljivost na udar (Slika S2), povišeni plus labirint (EPM, Slika S3), otvoreno polje i nove paradigme prepoznavanja objekata (Slika S4, pogledajte Prateće informacije za potpune metode i rezultati). S izuzetkom NIC-Sired ženki u EPM-u (koje su pokazale povećano ponašanje nalik anksioznosti) i NIC-Sired životinja s osjetljivošću na šok (koje su pokazale smanjenu glasovnu reaktivnost na šok, što ne bi zbunilo povećani fenotip učenja straha od više generacija), nema razlika otkriveni su između NIC- i SAL-Sired miševa.

SLIKA 1 Očev nikotin pojačava kontekstualno uslovljavanje straha i ublažava akutno nikotinsko pojačanje uslovljavanja strahom. Kontekstualno zamrzavanje je bilo značajno veće u NIC-Sired plus SAL u poređenju sa SAL-Sired plus SAL kontrolama. Akutni nikotin na 0.09 mg/kg poboljšao je kontekstualno uslovljavanje straha kod SAL-Sired, ali značajno smanjilo kontekstualno uslovljavanje straha kod NIC-Sired životinja (n=10-12 po grupi). B, Kontekstualno zamrzavanje je bilo značajno veće kod NIC-grandsire plus SAL u poređenju sa kontrolama SAL-grandsire plus SAL (n=9-11 po grupi). Trake greške označavaju standardnu ​​grešku srednje vrijednosti (SEM), *P <>

Da bi se utvrdilo da li se poremećeno kontekstualno uslovljavanje straha nastavilo u sljedećoj generaciji (F2), NIC-grandsire i SAL-grandsire mužjaci i ženke F2 miševa uzgojeni su od naivnih F1 mužjaka miševa. Kompletna analiza osnovnog stanja, pre-CS i CS zamrzavanja je uključena u prateće informacije. Urađena je 3-smjerna ANOVA kontekstualnog zamrzavanja sa liječenjem od djeda, akutnim liječenjem lijekovima i seksom kao nezavisnim faktorima (Slika 1B). Budući da nije bilo značajne interakcije između spola i oca ili akutnog liječenja lijekovima, obavljena je dvosmjerna ANOVA srušena po spolu. Pronađen je značajan glavni efekat oca (F(1,37)=9.88, P < .01),="" a="" post="" hoc="" poređenja="" su="" pokazala="" da="" su="" nic-grandsire="" miševi="" pokazivali="" povećanu="" kontekstualnu="" uslovljenost="" strahom="" u="" poređenju="" sa="" sal-grandsire="" miševima="" (t39="3.04," p="">< 0.01).="" pored="" toga,="" sal-grandsire="" miševi="" kojima="" je="" primijenjen="" akutni="" nic="" imali="" su="" poboljšano="" kontekstualno="" uvjetovanje="" straha="" (t19="2.41," p="0.026)," ali="" akutni="" nic="" nije="" poboljšao="" kontekstualno="" uvjetovanje="" straha="" kod="" miševa="">

SLIKA 2 Očev nikotin poboljšava uslovljavanje straha i spontani oporavak sjećanja na strah. Da bi se ispitali potencijalni efekti gornje granice tokom testiranja, odvojena kohorta F1 miševa je prošla identičnu obuku sa samo jednim CS-US parom. I kontekstualno i indikativno uslovljavanje straha pojačano je kod NIC-Sired miševa u poređenju sa SAL-Sired miševima koji su trenirani sa 1 CS-US uparivanje (n=8-10 po grupi). B, Očeva izloženost nikotinu nije uticala na izumiranje kontekstualnog straha, ali je poboljšala spontani oporavak sjećanja na strah 7 dana nakon posljednje sesije izumiranja (n=8-10 po grupi). Trake greške označavaju standardnu ​​grešku srednje vrijednosti (SEM), *P <>

3.2 Očev nikotin poboljšava uslovljavanje straha kod miševa F1 generacije

Da bi se ispitalo da li je efekat gornje granice onemogućio otkrivanje grupnih razlika za uslovljavanje straha (pogledajte Popratne informacije), posebna grupa F1 miševa je obučena sa jednim CS-US parom. U ovoj kohorti, poboljšanje kontekstualnog uslovljavanja straha (t7=3.21, P < .05)="" kao="" i="" uslovljenog="" straha="" je="" pronađeno="" kod="" nic-sired="" miševa="" (t6="2.41," p="">< .="" 05;="" slika="">

3.3 Očev nikotin pojačava spontani oporavak memorije kontekstualnog straha kod miševa F1 generacije

Kohorta F1 miševa koja je primila jedno CS-US uparivanje je naknadno testirana na izumiranje i spontani oporavak memorije kontekstualnog straha. F1 NIC-Sired miševi su pokazali normalno izumiranje straha, ali su pokazali poboljšani spontani oporavak kontekstualne memorije straha u odnosu na SAL-Sired miševe (t7=3.38, P < 0.05;="" slika="">

3.4 Očev nikotin smanjuje samoprimenu nikotina

Prije obuke za samodavanje nikotina, ispitanici su analizirani na njihovu sposobnost da nauče operativni zadatak za dobivanje nagrade za hranu, a nisu uočene razlike (Pomoćne informacije, slika S5). Da bi se testirali potencijalni efekti izlaganja oca nikotinu na pojačanje nikotina kod F1 potomaka, procijenjeno je uzimanje IV samodavanja nikotina (0.03 mg/kg/infuzija) u dvosmjernoj ANOVA mješovitog dizajna, koja je identificirala glavni efekat sesije (F(7,119)=13.60, P < .001)="" i="" interakcija="" tretmana="" sesije="" ×="" oca="" (f(7,119)="5.00," p="">< .001).="" međutim,="" post="" hoc="" testovi="" nisu="" otkrili="" nikakve="" statistički="" značajne="" razlike="" između="" grupa="" na="" svakoj="" od="" osam="" sesija="" akvizicije="" (slika="" 3a).="" zatim="" je="" analiziran="" broj="" aktivnih="" i="" neaktivnih="" pritiskanja="" poluge="" kako="" bi="" se="" utvrdilo="" da="" li="" su="" grupe="" zadržale="" preferenciju="" za="" aktivnu="" polugu="" tokom="" cijele="" sesije="" tokom="" akvizicije="" (slika="" 3b),="" što="" je="" identificiralo="" glavni="" efekat="" sesije="" (f(7,238)="" {{20}="" }.18,="" p="">< .001)="" i="" interakcija="" tretmana="" sesije="" ×="" oca="" (f(21,238)="11.40," p="">< .001).="" post="" hoc="" analiza="" je="" otkrila="" da="" su="" se="" grupe="" razlikovale="" prvog="" dana="" samoprimjene="" nikotina.="" nic-sired="" grupa="" je="" pokazala="" veći="" aktivni="" pritisak="" poluge="" u="" poređenju="" sa="" sal-sired="" grupom.="" ovaj="" efekat="" može="" predstavljati="" ili="" veći="" nivo="" ponašanja="" u="" potrazi="" za="" drogom="" prvog="" dana="" izlaganja,="" istrajnost="" da="" se="" reaguje="" na="" nagradu="" za="" hranu="" i/ili="" smanjenu="" kognitivnu="" fleksibilnost="" u="" prelasku="" reakcije="" sa="" hrane="" na="" lek.="" međutim,="" ova="" razlika="" se="" nije="" zadržala="" u="" narednim="" sesijama.="" sal-sired="" miševi="" su="" pokazali="" dosljednu="" statistički="" značajnu="" preferenciju="" za="" aktivnu="" polugu="" u="" odnosu="" na="" njihovu="" neaktivnu="" polugu="" (post="" hoc="" p="">< .01),="" ali="" nic-sired="" miševi="" nisu="" pokazali="" ovu="" zadržanu="" preferenciju="" za="" sesije="" od="" 3="" do="">

SLIKA 3 Očev nikotin smanjuje samoprimenu nikotina. NIC- i SAL-Sired mužjaci (n=9-10 po grupi) nisu se razlikovali u ukupnom broju infuzija zarađenih za svaku sesiju tokom perioda akvizicije na 0 .03 mg/kg/infuzijska doza. B, Tokom akvizicije, broj aktivnih i neaktivnih pritiskanja poluge značajno se razlikovao na prvoj sesiji, pri čemu je nikotin kod miševa NIC-Sired pokazao veći broj aktivnih pritiskanja poluge u poređenju sa SAL-Sired miševima. Međutim, tokom narednih sesija, NIC-Sired miševi su smanjili odgovor, što nije rezultiralo značajnim razlikama između njihovog aktivnog i neaktivnog broja pritisaka poluge u seansama od 3 do 8. Nasuprot tome, SAL-Sired životinje su pokazale dosljednu statistički značajnu preferenciju za aktivnu polugu preko njihove neaktivne poluge. C, Srednji broj infuzija nikotina u tri posljednje sesije akvizicije nije se značajno razlikovao između NIC- i SAL-Sired miševa. D, Pri umjerenoj dozi od 0,1 mg/kg/infuziji, NIC-Sired miševi su sami dali značajno manji broj infuzija nikotina. E, Procjena inkubacije žudnje otkrila je značajno povećanje odgovora na prethodno aktivnu polugu nakon 21 dana apstinencije - samo za SAL-Sired miševe. Trake greške označavaju standardnu ​​grešku srednje vrijednosti (SEM), *P <>

Da bi se dalje ispitale potencijalne grupne razlike uz kontrolu varijabilnosti tokom početne faze akvizicije, ispitan je srednji broj infuzija nikotina za posljednje tri sesije, vrijeme u kojem su subjekti pokazali konzistentnije odgovore na nikotin (slika 3C). Grupe se nisu značajno razlikovale u srednjem broju infuzija nikotina (P > .05). Nakon toga, miševi su prešli na dozu nikotina od 0,1 mg/kg/infuziju, za koju se ranije pokazalo da je preferirana kod odraslih miševa C57BL6/J.44 Pri ovoj dozi, NIC-Sired miševi su sami davali manji broj infuzija (t{ {7}}.20, P < .05;="" slika="" 3d).="" za="" inkubaciju="" ponašanja="" žudnje,="" koje="" se="" smatra="" mjerom="" povećanog="" traženja="" droge="" tokom="" apstinencije,="" dvosmjerna="" anova="" mješovitog="" dizajna="" sa="" tretmanom="" sesije="" i="" oca="" identifikovala="" je="" glavni="" efekat="" sesije="" (f(1,17)="" {{16}="" }.90,="" p="">< .001).="" dok="" su="" sal-sired="" životinje="" pokazale="" efekat="" inkubacije="" sa="" većim="" odgovorima="" 21.="" dana="" apstinencije="" u="" poređenju="" sa="" 1.="" danom,="" nic-sired="" miševi="" nisu="" pokazali="" povećanje="" ponašanja="" u="" potrazi="" za="" nikotinom="" (p=""><>

3.5 Očeva izloženost nikotinu mijenja holinergičko vezivanje i funkciju hipokampusa

Hipokampalno heteromerno nAChR vezivanje visokog afiniteta je povećano kod NIC-Sired F1 miševa (t28=2.14, P < .05;="" sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" }.043,="" nic-sired="1.34" ±="" 0.044).="" jedan="" subjekt="" (nic-sired)="" je="" uklonjen="" jer="" su="" vrednosti="" vezivanja="" bile="" dve="" standardne="" devijacije="" iznad="" srednje="">

Amperometrijski zapisi ACh izazvanih kalijumom i nikotinom struja procijenjeni su u F1 dHPC i vHPC. Zbog neujednačene veličine uzorka po spolu, spol nije uključen kao preliminarni faktor u ove analize. Holinergički signali izazvani depolarizacijom KCl nisu se razlikovali između SAL- i NIC-Sired miševa u dHPC (P > .05; Slika 4A); međutim, lokalna primjena nikotina rezultirala je značajnim smanjenjem amplituda holinergičkih signala kod NIC-Sired miševa (t8=2.33, P < .05;="" slika="" 4c).="" u="" vhpc,="" oslobađanje="" ach="" je="" smanjeno="" kod="" nic-sired="" miševa="" nakon="" primjene="" kcl="" (t8="2.60," p="">< .05;="" slika="" 4b)="" ili="" nikotina="" (t8="2.98," p="">< .05="" ;="" slika="">

SLIKA 4 Očev nikotin smanjuje holinergičku signalizaciju u hipokampusu. DHPC populacijski holin signalizira izazvane terminalnom depolarizacijom izazvanom KCl. Nisu otkrivene značajne razlike između NIC- i SAL-Sired životinja (n=5 po grupi). B, vHPC populacijski holin signali izazvani terminalnom depolarizacijom izazvanom KCl smanjeni su kod NIC-Sired miševa. C, Nikotinom izazvana populacija dHPC holin signali su smanjeni kod NIC-Sired miševa. D, Nikotinom izazvana populacija vHPC holin signali su smanjeni kod NIC-Sired miševa. Nisu uočeni efekti seksa na holinergičku signalizaciju. Trake greške označavaju standardnu ​​grešku srednje vrijednosti (SEM), *P <>

3.6 Očeva izloženost nikotinu različito mijenja ekspresiju gena dorzalnog i ventralnog hipokampusa

Analiza hipokampalnog transkriptoma F1 putem RNA-sekvenciranja otkrila je 952 različito eksprimirana gena u vHPC (FDR=0.05; Tabela S2). Od ovih gena, 612 je bilo sniženo, a 340 je bilo povišeno kod NIC-Sired miševa. U dHPC, samo 162 gena su različito eksprimirana kod NIC-Sired miševa u poređenju sa SAL-Sired miševima (FDR=0.05). Od ova 162 gena, 86 je bilo smanjeno, a 76 povišeno. Sto tri gena sa izmijenjenom ekspresijom gena preklapaju se između vHPC i dHPC.

3.7 Očeva izloženost nikotinu mijenja transkripcijske puteve uključene u razvoj nervnog sistema

U vHPC, IPA analiza identifikovala je top mrežu "Neurološke bolesti, organske povrede i abnormalnosti, smrt i preživljavanje ćelija" (score=41, Tabela S3) i drugu top mrežu "Razvoj i funkcija nervnog sistema, morfologija tkiva, neurološka Bolest" (score=23). Prvih pet kategorija molekularnih i ćelijskih funkcija bile su: "Morfologija ćelije" (88 molekula), "Ćelijski sklop i organizacija" (79 molekula), "Ćelijski razvoj" (96 molekula), "Ćelijska funkcija i održavanje" (79 molekula), i "Ćelijski rast i proliferacija" (87 molekula). Najbolji razvoj i funkcija fiziološkog sistema bili su "Razvoj i funkcija nervnog sistema" (175 molekula), a neke od vodećih funkcija bolesti i poremećaja uključuju "Neurološke bolesti" (druga, 191 molekula) i "Psihološki poremećaji" (četvrti, 90 molekula ) (Tabela S4).

Komplementarno rezultatima IPA-e, analiza obogaćivanja pomoću Enrichr-a pružila je dodatne dokaze o promjenama u ćelijskom rastu i razvoju u vHPC, s vrhunskim GO biološkim terminima uključujući "RNA spajanje", "odgovor na nesavijeni protein" i "regulaciju rasta stanica" i " stabilizacija proteina" (Tabela S5). U skladu s tim, "spliceosomalni kompleks" je identificiran kao vrhunski GO ćelijski termin. Analiza KEGG puta putem Enrichr-a dodatno je ukazala na funkcionisanje spliceosoma i MAPK signalizaciju kao potencijalno zahvaćene puteve.

Uprkos znatno kraćoj listi različito eksprimiranih gena u dHPC u poređenju sa vHPC, identifikovani su slični putevi i termini obogaćeni dHPC (tablice S3 i S4). IPA analiza identifikovala je top mrežu "Ponašanje, neurološke bolesti, ozljede i abnormalnosti organizma" (score=24) i drugu top mrežu "Neurološke bolesti, organske povrede i abnormalnosti i psihološki poremećaji (score=20) .

Prvih pet kategorija molekularnih i ćelijskih funkcija u dHPC-u bile su "ćelijski razvoj" (29 molekula), "ćelijski rast i proliferacija" (29 molekula), "Morfologija ćelije" (27 molekula), "ćelijska montaža i organizacija" (23 molekula) i "Ćelijska funkcija i održavanje" (25 molekula). „Razvoj i funkcija nervnog sistema“ je ponovo identifikovan kao vrhunski obogaćen termin u klasifikaciji razvoja i funkcija fiziološkog sistema (drugo, 44 ​​molekula). Najviše obogaćeni pojmovi u okviru klasifikacije funkcije bolesti i poremećaja uključivali su "Neurološka bolest" (1., 51 molekul) i "Psihološki poremećaji" (peti, 31 molekul). Analiza obogaćivanja pomoću Enrichr-a identificirala je više različitih GO bioloških termina za dHPC u usporedbi s vHPC, uključujući "regulaciju smrti neurona" i "razvoj mozga" (Tabela S5), koji je komplementaran IPA molekularnoj i ćelijskoj funkciji "Smrt i preživljavanje ćelije" IPA.

Da bi se dalje istražila funkcionalna uloga različito eksprimiranih transkripata koji se preklapaju između dHPC i vHPC, procijenjeni su različito eksprimirani geni zajednički za oba regiona (ukupno 103). Preklapajući se različito eksprimirani transkripti između ova dva regiona su svi smanjeni ili povećani u istom smjeru, što sugerira uobičajene promjene u transkripcijskim putevima u regijama mozga kod miševa koji su rođeni od NIC. Prvih pet kategorija molekularnih i ćelijskih funkcija koje je identifikovala IPA su „Smrt i preživljavanje ćelije“ (17 molekula), „Ćelijsko kretanje“ (10 molekula), „Signalizacija i interakcija od ćelije do ćelije“ (17 molekula), „Ćelijski rast i proliferacija" (18 molekula) i "Morfologija ćelije" (17 molekula) (Tabela S4)

Diferencijalno eksprimirani geni jedinstveni za dHPC i vHPC su naknadno analizirani odvojeno u IPA kako bi se testirale divergentne neurobiološke adaptacije između dva regiona (Tabela S6). Nijedan obogaćeni kanonski putevi nisu se preklapali između jedinstvenih vHPC jedinstvenih dHPC analiza. Vrhunski obogaćeni kanonski putevi jedinstveni za vHPC (ukupno 44) uključivali su "signalizaciju kalcijuma" i "signalizaciju glukokortikoidnih receptora", dok su vrhunski kanonski putevi dHPC (ukupno osam) uključivali "metabolizam hormona štitnjače" i "signalizaciju apoptoze posredovane retinoinskom kiselinom". Obogaćene bolesti i funkcije jedinstvene za vHPC (ukupno 295) uključivale su "Formiranje [Hipokampusa] Amonovog roga" i "Količina ćelijskih izbočina", dok su jedinstveni termini obogaćeni dHPC-om za bolesti i funkcije (ukupno 111) uključivali "Upalu bijele tvari" i "Demijelinizaciju ."

3.8 Očeva izloženost nikotinu mijenja metilaciju hipokampalne DNK

Izvršena je ciljana analiza metilacije DNK kako bi se utvrdilo da li je izmijenjena metilacija DNK u odgovarajućim regulatornim regijama bila odgovorna za diferencijalnu ekspresiju gena u NIC-Sired F1 potomcima. Ciljevi su uključivali 1114 različito eksprimiranih gena identificiranih u dHPC ili vHPC. U vHPC, otkriveno je 11 različito metiliranih regija (DMR), od kojih osam pokazuje povećanu metilaciju, a tri smanjenu metilaciju (Tabela 1). Od 11 DMR-a, 10 je bilo locirano u regionima povezanim sa genom koji je pokazao izmenjenu ekspresiju u vHPC. U dHPC-u je otkriveno 30 DMR-ova, od kojih 15 pokazuje povećanu metilaciju, a 15 pokazuje smanjenu metilaciju. Od 30 DMR-a, 29 je bilo locirano u regionima povezanim sa genom koji je pokazao izmenjenu ekspresiju u dHPC.

Benučinak cistanche echinacoside

4 DISKUSIJA

Povećano razumijevanje epigenetskih procesa u sprezi sa nedavnim podacima, uključujući sadašnje nalaze, izazvalo je tradicionalno razumijevanje nasljeđivanja. Faktori izvan genotipa sami po sebi mogu odrediti fenotipove u narednim generacijama, a izloženosti unutar generacije možda neće biti izdvojene iz potomstva. Ova studija sugerira da štetni zdravstveni učinci izlaganja nikotinu mogu nadmašiti individualnu izloženost i utjecati na sljedeće generacije. Identifikovali smo multigeneracijske i transgeneracijske efekte izlaganja očevom nikotinu prije začeća kod C57BL/6J miševa na pavlovsko stanje straha, što je rezultiralo snažnijim sjećanjem na strah kod F1 i F2 potomstva. Izloženost oca nikotinu je također rezultirala smanjenom samoprimjenom nikotina i oslabljenim ponašanjem vezanim za recidiv, što ukazuje na veću averzivnu reakciju na nikotin. U prilog ovim razlikama u ponašanju uočene su multigeneracijske promjene u holinergičkoj funkciji hipokampusa i epigenetskim procesima. Zajedno, ovi rezultati ukazuju na promjene u funkciji nervnog sistema kod potomaka miševa izloženih nikotinu, što rezultira promijenjenim fenotipovima ponašanja.

F1 i F2 potomci mužjaka miševa izloženih nikotinu pokazali su pojačanu kontekstualnu i naglašenu uslovljenost strahom. Uprkos tome što nema razlika u kontekstualnom izumiranju straha između miševa NIC- i SAL-Sired F1, NIC-Sired miševi su pokazali poboljšani spontani oporavak kontekstualnih sjećanja na strah. Važno je da nisu pronađene razlike u osjetljivosti na šok između NIC- i SAL-Sired miševa koje bi mogle objasniti povećano uslovljavanje straha. Pojačano uslovljavanje straha može sugerirati generalno poboljšanje procesa učenja za razliku od modulacije procesa specifičnijih za strah od učenja. Međutim, kod NIC-Sired miševa nisu primijećene promjene u prepoznavanju novih objekata, operantnoj obuci hrane ili lokomociji na otvorenom terenu, iako je identificiran spolno-specifičan učinak povećanog vremena otvorenih ruku EPM-a kod NIC-Sired ženki miševa. Iako ovo ne isključuje potencijalne modifikacije drugih sistema učenja ili kognitivnih procesa, ovi nalazi zajedno upućuju na to da učenje iz straha može biti osjetljivije na višegeneracijske i transgeneracijske efekte očeva izloženosti nikotinu. Štaviše, ovi nalazi ukazuju na izmijenjenu holinergičku funkciju kod NIC-Sired životinja. Nikotin modulira kontekstualno uslovljavanje straha. Dok akutni nikotin pojačava kontekstualno uslovljavanje straha,15,45 odvikavanje od hroničnog nikotina remeti uslovljavanje kontekstualnog straha.16,21 U ovoj studiji, akutni nikotin je pojačao kontekstualno uslovljavanje straha kod F1 i F2 miševa od miševa tretiranih slanom otopinom. Nasuprot tome, akutni nikotin poremećen kontekstualni strah kod NIC-Sired miševa i nije imao efekta kod NIC-grandsire miševa, što može ukazivati ​​na izmijenjeno holinergičko funkcioniranje u hipokampusu.

Efekti očeva izlaganja nikotinu na naknadnu samoprimenu nikotina u F1 generaciji također ukazuju na poremećenu holinergičku funkciju. Tokom sticanja intravenske samoprimjene nikotina u nižoj dozi, grupe se nisu razlikovale u broju infuzija nikotina, iako je u NIC-Sired grupi utvrđen porast broja aktivnih pritisaka poluge. Ovo sugerira da su NIC-Sired miševi možda pokazali istrajnost u reagiranju na nagradu za hranu i/ili smanjenu kognitivnu fleksibilnost u prelasku s hrane na lijek. Međutim, također je vrijedno napomenuti da se grupe nisu razlikovale prvog dana inkubacije žudnje, što predstavlja sesiju gašenja (npr. nema infuzije nikotina tokom sesije), pa se čini da je ovaj efekat bio prisutan kada se pojačavaju zamenjen, ali ne u odsustvu pojačanja tokom sesije izumiranja. NIC-Sired miševi su također pokazali smanjenu samoprimenu nikotina pri umjerenim dozama, što je u skladu s nedavnim radom identificirajući smanjenje unosa alkohola, kokaina i opioida povezano s izlaganjem roditelja alkoholu, kokainu i morfiju (npr. Vassoler et al,46 kao recenzirano u Goldberg i Gould47). Uočeno smanjenje samoprimjene nikotina može se pripisati ili smanjenoj osjetljivosti na efekte nikotina i/ili povećanoj osjetljivosti na averzivne efekte nikotina. Zaista, grupe su se razlikovale po umjerenoj dozi nikotina, ali ne i prema nižoj dozi nikotina, što podržava ideju povećanog averzivnog odgovora s višom dozom. Zanimljivo je da smo također otkrili nedostatak inkubacije žudnje 21. dana kod NIC-Sired miševa nakon samoprimjene umjerene doze, što sugerira da bi smanjeno ponašanje u potrazi za nikotinom moglo biti povezano s pamćenjem za nikotin povezanom s averzijom. Iako različiti nervni supstrati mogu biti u osnovi ovih efekata na unos nikotina i reagovanje u vezi sa relapsom, nedavna studija je pokazala da smanjena DNK metiltransferaza u hipokampalnoj CA1 regiji smanjuje samoprimenu morfina.48 Ovaj nalaz, zajedno sa poznatom funkcijom holinergičke funkcije hipokampusa u procese učenja i pamćenja, dodatno podržava ideju poremećene nikotinom posredovane obrade u hipokampusu NIC-Sired miševa.

Duž ovih linija, NIC-Sired miševi su pokazali povećano hipokampalno vezivanje nAChR visokog afiniteta. Također smo otkrili smanjenje oslobađanja ACh izazvanog kalijem u vHPC, kao i u oslobađanju ACh izazvanog nikotinom u dHPC i vHPC NIC-sired životinja. Promjene u oslobađanju ACh izazvanom depolarizacijom odražavaju izmijenjenu holinergičku funkciju nizvodno od vezivanja receptora, dok promjene u oslobađanju ACh izazvanog nikotinom odražavaju izmijenjenu funkciju nAChR. Ovi podaci su u skladu s prethodnim nalazima povećane regulacije vezanja nAChR visokog afiniteta nakon smanjene funkcije nAChR.49 Budući da je oslobađanje ACh izazvano kalijem i nikotinom promijenjeno u vHPC miševa NIC-Sired, vHPC može biti osjetljiviji na višegeneracijski efekti očeva izlaganja nikotinu. Poznato je da DHPC modulira kontekstualno uslovljavanje straha.31,50 Inhibicija vHPC narušava uslovljenost i uslovljenog i kontekstualnog straha 51,52 a vHPC holinergičke lezije narušavaju uslovljavanje straha.53

Herb cistanche

Takođe smo pokazali da direktna infuzija nikotina u dHPC poboljšava kontekstualno uslovljavanje straha, dok infuzija u vHPC remeti kontekstualno uslovljavanje straha.15 vHPC takođe može modulirati spontani oporavak kontekstualnih sećanja straha, jer inaktivacija vHPC-prelimbičkog kola smanjuje spontani oporavak kontekstualnih sećanja straha. 54 Dok drugi regioni mozga uključeni u uslovljavanje straha, kao što je amigdala,55 takođe mogu biti pod uticajem očeva izlaganja nikotinu, ovi nalazi zajedno sa sadašnjim podacima sugerišu da promene u funkciji vHPC mogu biti odgovorne za izmenjeno uslovljavanje straha kod NIC-Sired miševa. . Pretpostavili smo da višegeneracijski efekti očeva izlaganja nikotinu mogu biti povezani s promjenama u transkripcijskim efektorima koji djeluju uzvodno od ovih nervnih sistema. Transkripcijsko sekvenciranje u cijelom genomu u vHPC i dHPC miševa F1 generacije identificiralo je 1114 različito eksprimiranih gena između NIC- i SAL-Sired miševa. Ova razlika je bila veća u vHPC (952) naspram dHPC (162), u skladu sa većom promjenom u vHPC u odnosu na dHPC holinergičku funkciju i promjenama i kontekstualnog i uslovljenog straha. Naknadna analiza puteva je sugerirala široke promjene transkripcijskih puteva povezanih s glukokortikoidnom signalizacijom i neuralnim razvojem/plastičnosti u oba hipokampalna područja.

Kako bi se identificirale potencijalne adaptacije specifične za vHPC, analiza puta je izvršena koristeći samo transkripte specifične za bilo koju podregiju hipokampusa. Nijedan obogaćeni IPA kanonski putevi nisu se preklapali između vHPC i dHPC, koji su funkcionalno različite podregije hipokampusa.31 Kada su uklonjeni geni koji su se preklapali između dHPC i vHPC, vrhunski obogaćeni kanonski putevi jedinstveni za vHPC uključivali su "signalizaciju glukokortikoidnih receptora", što sugerira jedinstveno , dodatna promjena u funkcionisanju glukokortikoida u ovoj regiji u poređenju sa dHPC. S ciljem identifikacije uzvodnih epigenetskih regulatora koji mogu djelovati na ekspresiju gena, izvršili smo ciljano sekvenciranje metilacije DNK koristeći sastavljenu listu dHPC i vHPC različito eksprimiranih gena identificiranih iz RNA-sekvenciranja. Iznenađujuće, pronašli smo samo 11 DMR u vHPC i 30 DMR u dHPC između NIC- i SAL-Sired životinja. Iako je ovo neočekivano s obzirom na mnogo veći broj različito eksprimiranih transkripata u vHPC, metilacija DNK je samo jedan od nekoliko regulatornih faktora koji mogu utjecati na ekspresiju gena, a metilacija DNK se ne prevodi dosljedno u promijenjenu ekspresiju gena.56 Od 11 vHPC DMR-ova, sedam pokazali su obrasce metilacije u skladu sa smjerom diferencijalne transkripcije (smanjena transkripcija sa povećanom metilacijom DNK i povećana transkripcija sa smanjenom metilacijom). Diferencijalno metilirani geni u vHPC uključuju Fkbp5, Ksr1 i Pnpla2. Zanimljivo je da je transkripcija Fkbp5 i Ksr1 poremećena u jednom ponašajnom mišjem modelu PTSP-a,57 gdje su miševi bili izloženi električnom udaru stopala, a zatim su predstavljeni situacijski podsjetnici. Fkbp5 kodira šaperon glukokortikoidnog receptora čije je funkcioniranje povezano s neprilagođenim produženim odgovorom na stres kod osoba s PTSP-om i drugim anksioznim poremećajima.58

Konkretno, studije na ljudima pokazuju da metilacija i transkripcija Fkbp5 koreliraju s ozbiljnošću simptoma PTSP-a, tako da povećana metilacija i smanjena transkripcija predviđaju ozbiljnije simptome PTSP-a.59,60 Ekspresija Fkbp5 modulira funkcionisanje HPA-ose, za koju se smatra da posreduje u njenom uključivanju u PTSP.59,61 Naš nalaz o poboljšanom spontanom oporavku pamćenja straha u kombinaciji s disregulacijom transkripcijskih puteva povezanih sa glukokortikoidnom signalizacijom kod NIC-sired životinja može ukazivati ​​na povećanu ranjivost na fenotipove slične PTSP-u. U dHPC, DMR obrasci su bili u velikoj mjeri neusklađeni sa smjerom ekspresije diferencijalnog transkripta pronađenog RNA-sekvenciranjem, što sugerira da su promjene u vHPC DNK metilaciji uzrokovane izlaganjem očevu nikotinu značajnije u smislu utjecaja na ekspresiju gena od onih u dHPC. Ovo je u skladu s našom identifikacijom većeg broja različito izraženih transkripata i preuveličanijih promjena u holinergičkom prijenosu u NIC-Sired vHPC u poređenju sa dHPC. Naš pristup ciljanom sekvenciranju možda je ograničio sposobnost otkrivanja potencijalne regulacije transkripcije distalno metiliranim sekvencama. Buduća istraživanja uključujući analizu metilacije DNK u cijelom genomu, modifikacije histona i male ekspresije RNK pružit će potpuniju interpretaciju ovih nalaza.

Potencijalno ograničenje našeg dizajna o izlaganju nikotinu je fokus na očevom izlaganju nikotinu kako bi se istražio višegeneracijski i transgeneracijski utjecaj izloženosti nikotinu. Iako su druge studije koje su pronašle višestruke/transgeneracijske fenotipove nakon izlaganja očeva drogama, uključujući kokain46 i morfij,62 nisu pronašle razlike u njezi majke, moguće je da očeva izloženost nikotinu može utjecati na njegu majke. Buduće studije koje istražuju uticaj na brigu o majci su opravdane. Budući da je naš trenutni fokus bio na izloženosti očeva, budući rad bi također trebao uporediti uticaje izloženosti oca i majke. Sve u svemu, sadašnja otkrića pružaju novo razumijevanje višegeneracijskih i transgeneracijskih efekata izlaganja nikotinu, što je podržano sve većom literaturom koja karakteriše multigeneracijske i transgeneracijske efekte izloženosti drogama (kao što su pregledani u Goldberg i Gould47). Ova studija je bila prva koja je testirala kontekstualno uslovljavanje straha kod F1 i F2 potomaka muškaraca izloženih nikotinu i identificirala pojačano formiranje sjećanja na strah i spontani oporavak sjećanja na strah. Ova studija je također bila prva koja je identificirala promijenjenu samoprimenu nikotina i inkubaciju žudnje kod potomaka izloženih F1 nikotinu.

Diferencijalna metilacija u genima povezana s PTSP-om i disregulacijom HPA osovine, kao i istovremeni poremećaji u transkripcijskim putevima povezanim sa stresom, pronađeni su kod NIC-Sired miševa. Očev nikotin je također bio povezan sa smanjenom holinergičkom funkcijom hipokampusa i povećanim vezivanjem hipokampalnog nAChR. Zanimljivo je da pacijenti sa PTSP-om koji nisu pušili pokazuju značajno veće meziotemporalno kortikalno vezivanje nAChR visokog afiniteta63, a PTSP je povezan sa većim uslovljavanjem straha i spontanim oporavkom ugašenih sjećanja na strah.64 Zajedno, naši nalazi sugeriraju da izloženost nikotinu može imati višegeneracijski utjecaj povećanje osjetljivosti potomstva na simptome slične PTSP-u. Ovaj nalaz zajedno s drugim nedavnim nalazima koji pokazuju višegeneracijske efekte izlaganja nikotinu na kognitivnu fleksibilnost2 sugeriraju da negativni zdravstveni ishodi izloženosti nikotinu stvaraju širu mrežu nego što se ranije mislilo.

Ekstrakt Cistanche

REFERENCE

1 Dai J, Wang Z, Xu W, et al. Izloženost očevu nikotinu definira drugačije ponašanje u narednoj generaciji preko hipermetilacije mmu-miR-15b. Sci Rep. 2017;7(1):7286.

2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE, et al. Izloženost nikotinu kod mužjaka miševa dovodi do poremećaja ponašanja kod više generacija potomaka. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.

3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Transgeneracijski prijenos hiperaktivnosti na mišjem modelu ADHD-a. J Neurosci. 2014;34(8):2768-2773.

4. Cummings KM, Proctor RN. Promjena javne slike pušenja u Sjedinjenim Državama: 1964-2014. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2014;23(1):32-36.

5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Upotreba elektronskih cigareta među srednjoškolcima i njena povezanost s upotrebom cigareta i prestankom pušenja, Istraživanje mladih o duhanu u Sjevernoj Karolini, 2011. i 2013. Prev Chronic Dis. 2016;13:E103.

6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG, et al. Dugoročni učinci kroničnog nikotina na emocionalno i kognitivno ponašanje i morfologiju ćelija hipokampusa kod miševa: poređenja izloženosti nikotinu odraslih i adolescenata. Eur J Neurosci. 2016;44:2818‐2828.

7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Povezanost pušenja cigareta i anksioznih poremećaja tokom adolescencije i ranog odraslog doba. JAMA. 2000;284:2348-2351.

8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM, et al. Epigenetski mehanizam posreduje razvojne efekte nikotina na neuronsku strukturu i ponašanje. Nat Neurosci. 2016;19(7):905-914.

9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, et al. Holin ublažava deficite učenja odraslih i preokreće epigenetsku modifikaciju faktora remodeliranja hromatina u vezi sa izloženošću adolescenata nikotinu. Neurobiol Learn Mem. 2018;155:239‐248.

10. Bird A. Percepcije epigenetike. Priroda. 2007;447:396-398.

11. Skinner MK. Epigenetsko transgeneracijsko nasljeđe i somatska epigenetska mitotička stabilnost. Epigenetika. 2011;6:838‐842.

12. Davis JA, Gould TJ. Asocijativno učenje, hipokampus i ovisnost o nikotinu. Curr Drug Abuse Rev. 2008;1:9-19.

13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Ovisnost o nikotinu i psihijatrijski poremećaji. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171‐208.

14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. Disfunkcija nAChR-a kao uobičajeni supstrat za šizofreniju i komorbidnu ovisnost o nikotinu: trenutni trendovi i perspektive. Schizophr Res. 2016;171:1‐15.

15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Nikotinski receptori u dorzalnom i ventralnom hipokampusu različito moduliraju kontekstualno uslovljavanje straha. Hipokampus. 2012;22:1681-1690.

16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Genetska pozadina utječe na efekte odvikavanja od kroničnog nikotina na učenje i vezanje nikotinskih acetilkolinskih receptora visokog afiniteta u dorzalnom i ventralnom hipokampusu. Psihofarmakologija (Berl). 2013;225(1): 201-208.

17. Davis JA, Gould TJ. Učinci DHBE i MLA na nikotinom izazvano pojačavanje kontekstualnog straha kod C57BL/6 miševa. Psihofarmakologija (Berl). 2006;184:345-352.

18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Predadolescentni i adolescentni miševi su manje osjetljivi na efekte akutnog nikotina na izumiranje i spontani oporavak. Brain Res Bull. 2018;138:50‐55.

19. Kutlu MG, Gould TJ. Akutni nikotin odgađa izumiranje kontekstualnog straha kod miševa. Behav Brain Res. 2014;263:133‐137.

20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3. Hemija nikotina, metabolizam, kinetika i biomarkeri. U: Nikotinska psihofarmakologija. Berlin, Hajdelberg: Springer; 2009:29-60.

21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Prestanak kronične primjene nikotina narušava uvjetovanje kontekstualnog straha kod C57BL/6 miševa. J Neurosci. 2005;25:8708‐8713.

22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Komparativna studija dispozicije nikotina i njegovih metabolita u tri inbred soja miševa. Drug Metab Dispos. 1984;12:725-731.

23. Gould TJ, Portugal GS, Andre JM, et al. Trajanje deficita povezanih s ustezanjem od nikotina u kontekstualnom uslovljavanju straha paralelno je s promjenama u povećanju regulacije nikotinskih acetilkolinskih receptora visokog afiniteta hipokampusa. Neuropharmacology. 2012;62:2118‐2125.

24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu-Chen LY, Gould TJ. Poremećaj izumiranja kontekstualnog straha kroničnim nikotinom i odvikavanje od kroničnog nikotina povezano je s povećanjem nAChR hipokampusa. Neuropharmacology. 2016;109:341‐348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Karakterizacija spontanog i precipitiranog povlačenja nikotina kod miša. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:526-534.

26. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Signalizacija podjedinice habenularnog alfa5 nikotinskog receptora kontroliše unos nikotina. Priroda. 2011;471:597‐601.

27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Kvantitativna analiza heteromernih neuronskih nikotinskih receptora u hipokampusu pacova. J Neurochem. 2010;115:625‐634.

28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Paralelni anksiolitički efekti i pojačana regulacija neuronskih nikotinskih acetilkolinskih receptora nakon kroničnog nikotina i vareniklina. Nicotine Tob Res. 2011;13:41-46.

29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Prefrontalni receptori beta2 podjedinice i alfa7 nikotinski acetilkolinski receptori različito kontroliraju glutamatergičku i holinergičku signalizaciju. J Neurosci. 2010;30:3518‐3530.

30. Parikh V, Starter M. Holinergički sistemi i kognicija prednjeg mozga: novi uvidi zasnovani na brzom otkrivanju skokova kolina pomoću biosenzora zasnovanih na enzimima. U: Microelectrode Biosensors. Totowa, NJ: Humana Press; 2013:257‐277.

31. Fanselow MS, Dong HW. Jesu li dorzalni i ventralni hipokampus funkcionalno različite strukture? Neuron. 2010;65(1):7-19.

32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: precizno poravnavanje transkriptoma u prisustvu umetanja, brisanja i fuzije gena. Genome Biol. 2013;14(4): R36.

33. Afgan E, Baker D, van den Beek M, et al. Galaxy platforma za pristupačne, ponovljive i kolaborativne biomedicinske analize: ažuriranje za 2016. Nukleinske kiseline Res. 2016;44:W3-w10.

34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, et al. Sklapanje transkripta i kvantifikacija pomoću RNA-Seq otkriva nenaglašene transkripte i prebacivanje izoforme tokom ćelijske diferencijacije. Nat Biotechnol. 2010; 28(5): 511-515.

35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Kontrola stope lažnih otkrića u istraživanju genetike ponašanja. Behav Brain Res. 2001; 125(1-2):279-284.

36. Kramer A, Green J, Pollard J Jr, Tugendreich S. Pristupi kauzalnoj analizi u analizi puta domišljatosti. Bioinformatika. 2014;30(4): 523-530.

37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, et al. Enrichr: sveobuhvatno ažuriranje web servera za analizu obogaćivanja skupa gena 2016. Nukleinske kiseline Res. 2016;44(W1): W90-W97.

38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Ciljano sekvenciranje bisulfita korištenjem SeqCap epi sistema za obogaćivanje. Metode Mol Biol. 2018;1708:383‐405.

39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: fleksibilni trimer za Illumina sekvence podataka. Bioinformatika. 2014;30(15):2114-2120.

40. Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read poravnanje sa Bowtie 2. Nat Methods. 2012;9(4):357-359.

41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: fleksibilni uređaj za poravnavanje i metilaciju za aplikacije Bisulfite-Seq. Bioinformatika. 2011;27(11):1571-1572.

42. Akalin A, Kormaksson M, Li S, et al. methylKit: sveobuhvatni R paket za analizu profila metilacije DNK u cijelom genomu. Genome Biol. 2012;13(10): R87.

43. Gould TJ, Lommock JA. Nikotin pojačava uslovljavanje kontekstualnog straha i ublažava deficite izazvane etanolom u kontekstualnom uslovljavanju straha. Behav Neurosci. 2003;117(6):1276-1282.

44. Fowler CD, Kenny PJ. Intravenska samoprimjena nikotina i ponovno uspostavljanje kod miševa izazvano znakom: efekti doze nikotina, brzina infuzije lijeka i prethodna instrumentalna obuka. Neuropharmacology. 2011;61(4):687-698.

45. Gould TJ, Wehner JM. Nikotinsko pojačavanje kontekstualnog straha. Behav Brain Res. 1999;102(1-2):31-39.

46. ​​Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri‐Vakili G, Pierce RC. Epigenetsko naslijeđe fenotipa rezistencije na kokain. Nat Neurosci. 2013;16(1):42-47.

47. Goldberg LR, Gould TJ. Multigeneracijski i transgeneracijski efekti izlaganja oca zloupotrebama droga na bihevioralne i neuralne funkcije. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453-2466.

48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, et al. DNMT3a u hipokampalnom CA1 je ključan u sticanju samoprimjene morfija kod pacova. Addict Biol. 2019;▪:▪‐▪.

49. Schwartz RD, Kellar KJ. Vezna mjesta za nikotinske holinergičke receptore u mozgu: regulacija in vivo. Nauka. 1983;220(4593):214-216.

50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Hipokampalne lezije uzrokuju nedostatke učenja kod inbred miševa u Morrisovom vodenom lavirintu i zadatak uvjetovanog straha. Behav Neurosci. 1997;111(1):104-113.

51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Ventralni hipokampus i uslovljavanje straha kod pacova: različite anterogradne amnezije straha nakon infuzije N-metil-D-aspartata ili njegovog nekompetitivnog antagonista MK-801 u ventralni hipokampus. Behav Brain Res. 2001;126(1‐2):159‐174.

52. Maren S, Holt WG. Hipokampus i pavlovsko uslovljavanje straha kod pacova: infuzije muscimola u ventralni, ali ne i dorzalni hipokampus ometaju postizanje uslovnog zamrzavanja slušnog uslovnog stimulusa. Behav Neurosci. 2004;118(1):97-110.

53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Poremećaj medijalnog septuma i dijagonalnih traka Brokinih kolinergičkih projekcija na ventralni hipokampus remete slušnu memoriju straha. Neurobiol Learn Mem. 2018;152:71‐79.

54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Aktivacija ventralnih hipokampalnih ćelija koje se projektuju na prelimbički korteks, specifična za put, smanjuje obnavljanje straha. Neurobiol Learn Mem. 2019;161:63‐71.

55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Lateralno amigdaloidno jezgro: senzorni interfejs amigdale u uslovljavanju straha. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.

56. Jones PA. Funkcije metilacije DNK: ostrva, početna mesta, tela gena i dalje. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484-492.

57. Tanaka M, Li H, Zhang X, et al. Regulacija gena zavisna od regije i vremena u amigdali i prednjem cingularnom korteksu mišjeg modela nalik PTSP-u. Mol Brain. 2019;12(1):25.

58. Binder EB. Uloga FKBP5, ko-šaperona glukokortikoidnog receptora u patogenezi i terapiji afektivnih i anksioznih poremećaja. Psihoneuroendokrinologija. 2009;34(Suppl 1): S186-S195.

59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, et al. Genetski markeri za rizik od PTSP-a i otpornost među preživjelima od napada Svjetskog trgovinskog centra. Dis Markers. 2011;30(2‐3):101‐110.

60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, et al. Epigenetski biomarkeri kao prediktori i korelati poboljšanja simptoma nakon psihoterapije kod borbenih veterana sa PTSP-om. Front Psych. 2013;4:118.

61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA, et al. Obrasci ekspresije gena povezani s posttraumatskim stresnim poremećajem nakon izloženosti napadima Svjetskog trgovinskog centra. Biol Psychiatry. 2009;66:708‐711.

62. Li CQ, Luo YW, Bi FF, et al. Razvoj ponašanja nalik anksioznosti putem signalizacije hipokampalnog IGF-2 kod potomaka izloženosti roditelja morfiju: efekat obogaćene sredine. Neuropsychopharmacology. 2014;39(12):2777-2787.

63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, et al. beta2 Dostupnost nikotinskog acetilkolinskog receptora u posttraumatskom stresnom poremećaju. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419-424.

64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, et al. Neurobiološka osnova neuspjeha prisjećanja na izumiranje kod posttraumatskog stresnog poremećaja. Biol Psychiatry. 2009;66(12):1075-1082.