Dio 2: Nedostatak DHHC21 ublažava disfunkciju bubrega tokom septičke ozljede

Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Diskusija

U ovom radu izvještavamo o DHHC21 kao novom regulatoru bubrežne perfuzije i funkcije tokom septičke ozljede. Naša nova otkrića pokazuju: (1) Zdhhc21devde? miševi pokazuju bolju bubrežnu funkciju i manje oštećenje bubrega nakon septičke ozljede u odnosu na WT miševe; (2) funkcionalni nedostatak DHHC21 čuva perfuziju bubrežnog tkiva, zasićenje kisikom i RBF kod septičke ozljede; (3) DHHC21-katalizirana alAR palmitoilacija je potrebno za aktivaciju alAR signalnog puta i alAR-induciranu konstrikciju bubrežnih arterija. Ova studija pruža novi mehanistički uvid u regulaciju bubrežne perfuzije i funkcije tokom septičke povrede. Predlažemo da funkcionalni nedostatak DHHC21 daje zaštitne efekte nafunkciju bubregakod septičkih ozljeda i da inhibicija DHHC21 može poslužiti kao terapijska strategija za borbububrežna disfunkcijatokom septičke povrede.

Kliknite ovdje da saznate prednosti ekstrakta cistanche tubulosa

Hipoperfuzija/hipoksija bubrežnog tkiva je jedan od vodećih uzroka bubrežne disfunkcije tokom septičke povrede3-5. Otkrili smo renalnu hipoperfuziju kod miševa nakon CLP-a o čemu svjedoči oslabljen intenzitet MSOT signala ukupnog hemoglobina, smanjena zasićenost kisikom u bubrežnom tkivu i smanjen RBF nakon septičke ozljede. U skladu s našim nalazima, smanjenje RBF je primijećeno kod pacijenata sa sepsom s ozljedom bubrega, kao i kod modela septičke ozljede na velikim životinjama7,10l1. Vrijedi napomenuti da nekoliko studija izvještava da se disfunkcija bubrega može razviti kod životinja sa sepsom s nepromijenjenim ili čak povećan RBF334. Ovi različiti nalazi mogu se pripisati različitim životinjskim modelima i metodama koje se koriste za mjerenje protoka krvi. Na primjer, dok se polimikrobna septička ozljeda izazvana CLP-om obično koristi, neke studije koriste intravensku injekciju Escherichia coli35.

Nedavno je prijavljena palmitoilacija proteina kao novi regulator funkcije proteina, uključen u patogenezu i napredovanje mnogih bolesti. Prvi put su ga identifikovali kao novi tip post-translacione modifikacije od strane Schmidt et al.3637. Otkriće porodice DHHC je od tada podstaklo brzo širenje ovog polja38,39. Uloga palmitoilacije i PAT-a je prijavljena u brojnim fiziološkim i patološkim stanjima, uključujući metabolizam lipida,rak, kardiovaskularne bolestii neurološki poremećaji23,0,4. Iako je uključenost palmitoilacije u policističnu bolest bubrega i rak bubrega ranije prijavljivana23, bilo je vrlo ograničenih studija koje ispituju funkcionalnu ulogu PAT-a ubolesti bubrega, posebno kod bubrežne disfunkcije tokom septičke povrede. Koliko nam je poznato, prvi smo koji je istraživao ulogu DHHC2l u bubrežnoj disfunkciji kod septičkih ozljeda. Naši nalazi pokazuju da inhibicija DHHC21 u velikoj mjeri spašava funkciju bubrega i čuva strukturu bubrega u septičkim ozljedama.

Naša studija koja koristi Zdhhc21dp/d4? miševi pokazuju da se korisni efekti funkcionalnog nedostatka DHHC21 na funkciju bubrega pripisuju njegovoj sposobnosti da poboljša perfuziju bubrežnog tkiva tokom septičke ozljede. U bazalnim uslovima, miševi Zdhhc21ewaeP ne pokazuju znakove neravnoteže soli/vode ili bubrežnih strukturnih/funkcionalnih oštećenja5. Ipak, gubitak funkcije DHHC21 potiskuje smanjenje RBF-a, bubrežnu perfuziju i zasićenost bubrega kisikom uzrokovano septičkim ozljedama. Povećan renalni vaskularni otpor uzrokovan prekomjernom renalnom vazokonstrikcijom smatra se glavnim razlogom za poremećenu perfuziju bubrežnog tkiva kod septičke ozljede6.9. Naši rezultati ukazuju na učešće alAR u posredovanju hipoperfuzije bubrežnog tkiva izazvane septičkim ozljedama, što je dokazano povećanjem alAR palmitoilacije i aktivacijom alAR signalnog puta kod septičke ozljede. Međutim, funkcionalni nedostatak DHHC21 inhibira alARpalmitoilaciju i dovodi do smanjene sposobnosti alAR-a da aktivira svoj nizvodni efektor i posreduje vazokonstrikciju izazvanu fenilefrinom u bubrežnim arterijama.

"Molekularni mehanizam koji leži u osnovi regulacije alAR funkcije od strane DHHC21 još uvijek ostaje u potpunosti razjašnjen. Defekt u alAR funkciji uzrokovan gubitkom funkcije DHHC21 može se pripisati konformacijskoj promjeni alAR-a. Mnogi GPCR se oslanjaju na palmitoilaciju za svoje odgovarajuće intracelularna konformacija, vezani palmitat na C-terminalnim repovima GPCR-a ubacuje se u plazma membranu kako bi stvorio četvrtu intracelularnu petlju, koja je neophodna za interakciju GPCR-a sa njihovim partnerskim proteinima i propagaciju GPCR signala17,4. je ukazalo da se palmitoilacija Albar-a također događa u njegovom C-terminalnom području44. Stoga, nedostatak DHHC21-posredovane lAR palmitoilacije može promijeniti unutarćelijsku konformaciju alAR-a, blokirajući tako propagaciju lAR signala. Ovo se može podržati prema našim rezultatima koji pokazuju da je aktivacija ERK, nizvodnog signalnog događaja alAR aktivacije, inhibirana kod miševa Zdhhc21devider podvrgnutih sept. ic povreda. Međutim, DHHC21-regulisana topologija alAR karboksilnog terminala treba dalje biti potvrđena pomoću rendgenske kristalografije.

Još jedan novi aspekt naše studije je korištenje MSOT-a za procjenu perfuzije i funkcije bubrega tokom septičke ozljede. MSOT je prijavljen kao metoda bez oznaka za mjerenje perfuzije različitih organa i pouzdana tehnika snimanja za određivanje funkcije bubrega2832,45. U poređenju sa Doplerovim protokomjerom koji ne dozvoljava vizualizaciju mikrovaskulature45, MSOT generiše slike visoke prostorne rezolucije na 150 um, istovremeno pružajući kvantitativnu procjenu statusa perfuzije u mikrovaskulaturi bubrega. IRDye800CW rastvorljiv u vodi je siguran tragač koji se koristi za merenje bubrežnog klirensa i ne izaziva toksičnost u dozi većoj od 20 mg/kg. Dvofazno kretanje IRDye800CW koje smo primijetili u skladu je s prethodno objavljenim studijama. Naši MSOT snimci ukazuju na veće kašnjenje Tmax u bubrezima za sepsu, što ukazuje na poremećeni bubrežni klirens. Studija nefropatije pokazuje da je oštećena bubrežna funkcija koju je otkrio MSOT značajno povezana s histološkim oštećenjem glomerula30. Naši podaci, u skladu s prethodnim publikacijama, sugeriraju da je MSOT minimalno invazivna i pouzdana tehnika za praćenje perfuzije i funkcije bubrega.

Trenutno ne postoje DHHC21-specifični inhibitori. Najčešće korišteni inhibitor PAT-a je 2-BP koji ima široki učinak na više DHHC-a i također ometa metabolizam masnih kiselina47. Stoga bi razvoj inhibitora malih molekula koji specifično ciljaju DHHC21 bio obećavajući smjer. Također je vrijedno istaći da alAR nije jedini supstrat DHHC21. Nedavno je identifikovano nekoliko drugih supstrata DHHC21, uključujući adhezionu molekulu endotelnih ćelija trombocita (PFCA M-1), estrogen receptor kaveolin-1, endotelnu sintazu azot-oksida (eNOS), Fyn, superoksid dismutazu (SOD{{ 8}}), i PLCB122,41,4s,49, Iako izvan obima ove studije, ne možemo isključiti mogućnost da ovi supstrati mogu uticati i na funkciju bubrega tokom septičke povrede.

U zaključku, ova studija po prvi put pokazuje da DHHC21 igra ključnu ulogu u regulaciji bubrežne perfuzije tokom septičke ozljede putem mehanizama koji uključuju alAR palmitoilaciju i alAR posredovanu vazokonstrikciju. Nadalje, inhibicija DHHC21 ima zaštitne efekte na bubrežnu funkciju tokom septičke ozljede.

materijali i metode

Reagensi. Svi reagensi su navedeni u Dodatnoj tabeli S1.

Životinje. Zdhhc21depher miševi i njihovi kontrolni miševi divljeg tipa (B6C3Fe) kupljeni su od Jackson Laboratory. Genotip Zdhhc21dephe? miševi su potvrđeni sekvenciranjem (Genewiz, Inc., NJ, USA). Prajmeri korišteni za sekvenciranje su: AGCTGACTGAAGGGCACC (naprijed) i AAAACCTGTAACGCATTTCCA (obrnuto)23. Životinje su držane u ciklusu od 12/{7}}h svjetlo/mrak sa slobodnim pristupom hrani i vodi. Za ovo istraživanje korišteni su miševi (16-20 sedmica) oba spola. Svi eksperimenti na životinjama odobreni su od strane Institucionalnog odbora za njegu i upotrebu životinja Univerziteta Južne Floride iu skladu su sa NIH Vodičem za njegu i korištenje laboratorija

Ligacija cekalnog crijeva i punkcija, miševi su anestezirani izofluranom (3 posto indukcije i 1 posto održavanja). Srednji rez je napravljen u obrijanoj abdominalnoj regiji, a cekum je eksteriorizovan, čvrsto vezan na 5 mm ispod ileocekalnog zalistka i dva puta perforiran sa 20-iglom distalno od tačke ligacije. Iz svake ubodne rupe istisnut je jedan mm fekalija. Potom je repozicioniran cekum, a stomak je zatvoren u dva sloja. 37 C Lactated Ringer rastvor je primenjen lokalno da bi se sprečilo isušivanje cekuma. Miševi su zatim dobili fiziološku otopinu od 37 stepeni 0.9 posto subkutano za reanimaciju tekućine. Za analgeziju je data preoperativna 0.5-1.5 mg/kg doza buprenorfina sa odloženim oslobađanjem. Lažni miševi podvrgnuti su istoj hirurškoj proceduri, ali bez vezivanja cekalnog crijeva i punkcije50,51.

Multispektralna optoakustička tomografija. Procjena bubrežnog izlučivanja IRDye800CW. Miševi su anestezirani izofluranom i depilirani oko regije torza. Miševi su snimljeni korišćenjem Altera Medical MSOT Imaging System (Minhen, Nemačka) na više talasnih dužina: 700,730,760,775,785, 800,850 nm pri brzini od 10 sličica/s. Miševi su stavljeni u ležeći položaj u držač i pomicani duž horizontalnog linearnog stupnja kako bi se bubrezi postavili na vrh fiksno postavljenog konkavnog sonde. Nakon početnog snimanja, 60 nmol RDve800CW rastvorenog u 100 ul 0,9% fiziološkog rastvora je ubrizgano intravenozno u periodu od 10 s. Slike su rekonstruisane pomoću formule povratne projekcije i obrađene multispektralnom analizom. Regije od interesa (ROI) su nacrtane oko bubrežnog korteksa i regije medule/zdjelice, a prikazane su i vremenske promjene MSOT signala u ROI.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Histopatologija bubrega. Bubrezi su fiksirani, isečeni duž sagitalne ravni i obrađeni za ugradnju parafina. Sekcije (5 μm) su deparafinizirane, rehidrirane i oksidirane periodičnom kiselinom 8 minuta na sobnoj temperaturi (RT), nakon čega je uslijedila inkubacija sa Schiffovom otopinom 25 minuta. Sekcije su zatim obojene hematoksilinom. Slike su snimljene pomoću Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, SAD). Oštećenje strukture bubrega procijenjeno je na osnovu sljedećih karakteristika: glomerularna abnormalnost, gubitak ruba četkice proksimalnog tubula, vakuolacija, proširenje epitela tubula, odvajanje/nekroza tubularne ćelije i infiltracija neutrofila. Svaka karakteristika je ocijenjena na skali od 0-5 na osnovu ozbiljnosti.

Mjerenje kreatinina i azota ureje u krvi. Krv miša je sakupljena punkcijom srca 24 h nakon septičke povrede. Plazma je stvorena centrifugiranjem krvi na 2500 g tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Mjerenje kreatinina: plazma je deproteinizirana pomoću 10-kDa Spin Column; nivoi kreatinina u filtratu su zatim izmjereni pomoću kompleta za analizu kreatinina. Nivo azota uree u krvi (BUN) određen je pomoću kompleta za kolorimetrijsku detekciju azota uree prema uputstvima proizvođača.

Mjerenje RBF i MAP. Miševi su anestezirani izofluranom. Transduktor krvnog pritiska je kanuliran u karotidnu arteriju. Srednji rez je napravljen u abdominalnom području, a zatim lijevi poprečni rez kako bi se otkrila bubrežna arterija. RBF je mjeren korištenjem ultrazvučnog mjerača protoka vremena prolaza (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA). Nakon postavljanja sonde protoka oko izložene bubrežne arterije, miševima je ostavljeno da se stabiliziraju najmanje 30 minuta. RBF i MAP snimljeni su istovremeno koristeći PowerLab (AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA). Podaci su analizirani pomoću softvera LabChart Pro verzija 74,55

Hvatanje uz pomoć smole. Bubrežne arterije su sakupljene i lizirane u puferu za lizu (100 mM HEPES.25 mM NaCl,1 mM EDTA,10 μM palmostatin B, inhibitori proteaze, pH 7,4）22, 56. Lizati tkiva su inkubirani sa puferom za blokiranje (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2,5 posto SDS, 6 ul/ml MMTS, pH 7,4) na 50 stepeni C tokom 30 minuta uz konstantno vrtložno miješanje. Nakon taloženja hladnim acetonom, proteini peletirano centrifugiranjem na 5000g 30 min i isprano pet puta sa 70% hladnim acetonom.Proteinske pelete su resuspendirane u puferu za vezivanje (100 mM HEPES, 1,0 posto SDS, 1 mM EDTA, pH 7,4). Koncentracija proteina je određena i normalizirana među grupama Svaki uzorak proteina je podijeljen na dva jednaka dijela, svaki je dobio istu količinu kuglica izopropil sefaroze 6B, hidroksvlamina (0,2 M, pH 7,4) i NaCl (0,2 M) dodanog u svaki dio, respektivno. Nakon 4 h inkubacije na sobnoj temperaturi uz konstantnu rotaciju, palmitoilirani proteini su eluirani sa 50 mM DTT u 1 x puferu za uzorke i sakupljeni za SDS-PAGE.

Western blotting. Mjerenje palmitoiliranog lAR-a. Uzorci sakupljeni iz RAC-a stavljeni su na 4-20 posto Tris-Glycine gel i prebačeni na nitroceluloznu membranu nakon elektroforeze. Nakon blokiranja od 1 h na sobnoj temperaturi, alAR je ispitan zečjim anti-lAR primarnim antitelom (1:500) preko noći na 4 stepena. Nakon tri puta ispiranja sa TBST, membrana je inkubirana sa IRDye800CW magarećeg anti-zečjeg sekundarnog antitijela (1:20,000) 45 minuta na sobnoj temperaturi.

Mjerenje ERK fosforilacije. Bubrežne arterije su lizirane u 1×RIPA koji sadrži inhibitore proteaze i fosfataze. Membrana je ispitana zečjim anti-ERK(1:1000) i mišjim anti-fosforilisanim ERK (1:1000) antitelima. IRDye800CW magareća anti-mišja i IRDye680RD magareća anti-zečja antitela korišćena su za sekundarnu inkubaciju (1:20,000). Membrane su snimljene i analizirane pomoću Li-COR Odyssey CLx.

Procjena vazoreaktivnosti žičanim miografom. Bubrežne arterije miša. Bubrežne arterije ({{0}} μm u promjeru) su izolovane iz WTand Zdhhc21dp/de miševa i potopljene u ledeno hladan oksigenizirani (95 posto O,/5 posto CO.) fiziološki fiziološki rastvor (PSS,13{ {47}} mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,18 mM KH, PO, 1,17 mM MgSO.7H,O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glukoze, 0,026 mM EDTA i 1,6 mM CaCl 74 segmenta (pHsel). dužine 2 mm) postavljene su na žičanu miografsku komoru (Living Systems Instrumentation, VT, SAD) između dvije volframove žice (30 um u prečniku). Izometrijska napetost je snimljena pomoću uređaja za kondicioniranje signala Living Systems (MYO-SC-1) u kombinaciji sa softverom LabScribe v4 iWorks. Nakon ekvilibracije od 30 minuta na 37 stepeni Cin PSS, izvršena je procedura normalizacije kako bi se odredio optimalni unutrašnji obim L,=0.9×L(Lo=unutrašnji obim koji odgovara transmuralnom pritisku od 100 mmHg) . Zatim je testirana održivost žila sa 60 mMKPSS (74,7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,18 mM KH, PO.1,17 mM MgSO.7H,O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glukoze, 0,026 mM CapH 6 mM. 7.4). Arterije koje nisu reagovale na KPSS su odbačene. Arterije su tretirane povećanom koncentracijom fenilefrina (10 nM-30 μM). Integritet endotela je zatim procenjen korišćenjem acetilholina (10 μM). Konstruirane su krive koncentracija-odgovor.

Male arterije iz ljudskih bubrega. Male arterije (~1000 um u prečniku) su secirane iz intaktnih vitalnih ljudskih bubrega koji su odbijeni za operaciju transplantacije. Segmenti posuda (~2 mm dužine) postavljeni su na I-šine (250 um u prečniku) žičane miografske komore. Slične procedure ekvilibracije i normalizacije provedene su na ljudskim arterijama. Zatim su arterije inkubirane sa kontrolom nosača (0,02 posto DMSO u PSS) 1 h. Sudovi su zatim testirani na održivost sa 60 mM KPSS i tretirani rastućim koncentracijama fenilefrina (10 nM-30 uM). Nakon ispiranja, posude su inkubirane sa 2-BP(100 uM) 1 h; vitalnost krvnih sudova je zatim ponovo testirana sa 60 mM KPSS sa 100 uM 2-BP. Male arterije bez ili smanjenog odgovora na KPSS su odbačene. Arterije su zatim izazvane istim koncentracijama fenilefrina, a zatim acetilkolinom (10 uM). Konstruisane su i upoređene krive koncentracija-odgovor arterija koje su kontrolisane vehikulom ili 2-obrađene sa krvnim pritiskom.

Imunofluorescencija. Ljudske bubrežne arterije su fiksirane u 10 posto formalina tokom 48 h, umotane u parafin i presečene. Stakalca su zatim deparafinizirana, rehidrirana i permeabilizirana PBS-om koji sadrži 0,05 posto Tritona X-1002. Nakon blokiranja, stakalca su označena zečjim anti-DHHC21 i kozjim anti-lAR antitelima (1:100) preko noći na 4 stepena C. Nakon pranja, sekundarna inkubacija antitela je obavljena sa magarećom anti-zečjom Alexa Fluor 488 i magarećom antikozijom Alexa. Fluor 568 (1:500). Nakon montiranja sa ProLong Diamond montažnim medijumom sa DAPI, dijapozitivi su snimljeni Leica SP8 spektralnim invertovanim laserskim skenirajućim konfokalnim mikroskopom.

Statistička analiza. Detaljne informacije (npr. naziv testa, post-hoc test, n vrijednost, alfa nivo, p-vrijednost) za svaki statistički test su navedene u dodatnoj tabeli S2. Svi podaci zadovoljavaju pretpostavku normalne distribucije. Test normalnosti je izveden korištenjem Shapiro-Wilk testa sa alfa nivoom postavljenim na 0.05. Poređenja između dvije grupe su analizirana korištenjem Studentovog t-testa (dvostrani), a tri grupe ili više su upoređene putem One-way ANOVA sa Tukey post-hoc analizom. Poređenje krivulja žičanog miografa izvedeno je pomoću dvosmjerne ANOVA.p<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">