Dio 1: Učinci izorhamnetina na dijabetes i njegove povezane komplikacije: Pregled in vitro i in vivo studija i post hoc analiza transkriptoma uključenih molekularnih puteva

Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Dijabetesmelitus, posebno tip 2 (T2DM), je globalno veliki javnozdravstveni problem. DM karakteriziraju visoki nivoi glikemije i inzulinemije zbog poremećenog lučenja inzulina i inzulinske osjetljivosti stanica, poznatog kao inzulinska rezistencija. T2DM uzrokuje višestruke i teške komplikacije kao što su nefropatija, neuropatija i retinopatija koje uzrokuju oksidativno oštećenje ćelija u različitim unutrašnjim tkivima, posebno u gušterači, srcu, masnom tkivu, jetri i bubrezima. Ekstrakti biljaka i njihove bioaktivne fitokemikalije sve su više interesantne kao nove terapeutske i preventivne alternative za T2DM i njegove povezane komplikacije. U tom smislu, izorhamnetin, biljkaflavonoida, dugo je proučavan zbog svojih potencijalnih antidijabetičkih efekata. Ovaj pregled opisuje njegov utjecaj na smanjenje poremećaja povezanih s dijabetesom smanjenjem razine glukoze, poboljšanjem oksidativnog statusa, ublažavanjem upale i modulacijom metabolizma lipida i diferencijacije adipocita regulacijom uključenih signalnih puteva prijavljenih u in vitro i in vivo studijama. Dodatno, uključujemo post hoc analizu transkriptoma cijelog genoma o biološkim aktivnostima izorhamnetina koristeći alat baziran na matičnim stanicama.

Ključne riječi: izorhamnetin; kvercetin; biološke aktivnosti; dijabetes; molekularni putevi; microarray

Kliknite ovdje da saznate više kontakata

1. Uvod

Biljke se od davnina koriste kao tradicionalni lijekovi na gotovo svim kontinentima svijeta. Naučno istraživanje o razlozima njihove medicinske upotrebe dovelo je do istraživanja bioaktivnih molekula. Ekstremofilne biljke koje rastu u ekstremnim ekološkim uvjetima smatraju se dobrim potencijalnim izvorom bioaktivnih molekula od interesa. U stvari, ova ograničenja okoline su izvor disfunkcionalnog metabolizma kiseonika, koji dovodi do oksidativnog stresa povećanjem reaktivnih vrsta kiseonika (ROS)[1,2]. Neke biljke, kao što su halofiti, imaju moćantioksidanssistem za uklanjanje ovih štetnih jedinjenja. Među bioaktivnim molekulima od interesa su fenolna jedinjenja. Nekoliko studija je vrednovalo biljke bogate polifenolima sa ili bez restriktivnih uslova u laboratoriji [3-10]. Ekstraktima bogatim polifenolima pripisuje se nekoliko bioloških efekata, poput protuupalnih i antikancerogenih aktivnosti [11-13]. Druge studije su pokazale antioksidativne, antimikrobne [8,14-16], kao i anti-gojazne, antidijabetičke i antihepatične steatotičke [17-19] efekte izorhamnetina. Među ovim polifenolima,flavonoidise razlikuju. Ova grupa uključuje nekoliko podgrupa, kao što su flavonoli. Izorhamnetin je jedno od glavnih jedinjenja flavonola. Izorhamnetin je monometoksi flavon ili O-metilirani flavonol iz klase flavonoida. TO JEkvercetinu kojoj metoksi grupa zamjenjuje hidroksi grupu na poziciji 3'. Neki derivati ​​izorhamnetina su prisutni u prirodi, kao što su izorhamnetin 3-O- -d-glukopiranozid, izorhamnetin 3-O-neohesperidozid i izorhamnetin 3-O-rutinozid iz Calendula officinalis L [20]. Izorhamnetin ima značajna biološka svojstva kao što su antioksidativno [21], antikancerogeno [22], antimikrobno [23], antivirusno [24], protuupalno i antidijabetičko djelovanje [21,25-33].

U ovom pregledu, prvi fokus je na porijeklu, hemijskoj strukturi, metodama izolacije i ekstrakcije, kao i na fitokemijski aspekt izorhamnetina. Zatim, u drugom dijelu, fokusiramo se na opisivanje potencijalnih antidijabetičkih učinaka ovog flavonola kroz smanjenje poremećaja povezanih s dijabetesom smanjenjem razine glukoze, poboljšanjem oksidativnog statusa, ublažavanjem upale i modulacijom metabolizma lipida i diferencijacije adipocita. Konačno, izvršili smo sekundarnu analizu naših prethodno objavljenih podataka mikromreža cijelog genoma kako bismo istražili bioaktivnost izorhamnetina u vezi sa dijabetesom u alatu baziranom na matičnim stanicama. Takođe želimo da istaknemo efekat ovog molekula na regulaciju uključenih signalnih puteva izveštavanjem o in vitro i in vivo studijama koje se koriste u ovoj oblasti istraživanja. U ovom pregledu izložili smo karakteristike antidijabetičke aktivnosti izorhamnetina u poređenju sakvercetinkoji se smatra metabolitom izorhamnetina i važnom referencom u prirodnom liječenju dijabetesa.

2. Opšti pregled bioaktivnih molekula u pojedinim polifenolima i flavonoidima

2.1. Oksidativni stres kao porijeklo bioaktivnih molekula u biljkama

Nekoliko biljaka može biti podvrgnuto različitim uslovima okoline (slanost, suša, UV zraci, teški metali, ekstremne temperature, nedostatak hranljivih materija, zagađenje vazduha i napadi patogena). Ova ograničenja su izvor disfunkcija metabolizma kiseonika, koji stvaraju oksidativni stres povećanjem reaktivnih vrsta kiseonika (ROS). Molekul kiseonika (O2) igra važnu ulogu u fotosintetskim organizmima. Prvobitno, u višim biljkama i algama, razmjena plinova koja uključuje elektrone događa se u hloroplastima hvatanjem ugljičnog dioksida tijekom dana i proizvodnjom kisika. Ova izmjena gasa uključuje elektrone. Zaista, u slučaju ozbiljnih ograničenja okoline, veliki dio kisika se ne reducira i stoga može generirati ROS u nekim organelama iz biljnih stanica [1,2] zbog neravnoteže u pravilnom funkcioniranju hloroplasta i prijenosu elektrona [ 1]. Štaviše, pod gore navedenim ograničenjima okoline, proizvode se mnogi ROS, kao što su hidroksilni radikal (OH), superoksidni anjonski radikal (O,-), alkoksilni i peroksilni radikali (RO: i RO2, respektivno), vodikov peroksid (H2O2, ), hipokloritni radikal (-OCl), singletni kisik (O2), radikal dušikovog oksida (NO) i drugi lipidni peroksidi (kao što su malondialdehid i 4-hidroksinonenal)[2,34,35]. Ponekad ROS može imati ulogu u ćelijskom signaliziranju u fiziološkom ponašanju biljaka, na primjer u procesu rasta i razvoja sjemena, razvoju tkiva i prijelazu iz ćelijske proliferacije u elongaciju stanice tijekom ranijih faza diferencijacije [36] . Na visokom nivou, ovi molekuli uzrokuju molekularna oštećenja kao što je lipidna peroksidacija membrana, izmjena proteina i DNK, te ćelijska smrt [1,35,37]. Neke biljke, kao što su halofiti, imaju sposobnost da se dobro prilagode ovim uslovima kroz snažan antioksidativni sistem. Poznato je da su halofiti izvor sekundarnih metabolita kao što su polifenoli [3-10]. Ovi autori pokazuju da se u teškim uvjetima sintetiziraju polifenoli koji igraju važnu ulogu u zaštiti od oksidativnog oštećenja izazvanog stresom. Biosinteza, sadržaj i aktivnosti ovih fenolnih spojeva funkcija su nekoliko ekstrinzičnih (svjetlo, temperatura, salinitet i suhoća) i intrinzičnih (genotip, organ i faza razvoja) parametara koji utječu na njihov sadržaj i distribuciju u biljkama [ 8,38,39]. Na primjer, kod Pyracantha coccinea, neki flavonoidi kao što su flavanoni, flavoni i flavonoli prisutni su u izbojcima tokom vegetativne faze, au korijenu isključivo u reproduktivnoj 40]. S druge strane, nekoliko autora je pokazalo da ova fenolna jedinjenja imaju i druga biološka svojstva kao što su protuupalno i antikancerogeno djelovanje [11-13]. Druge studije su pokazale antioksidativne, antimikrobne [8,14-16], kao i antidijabetičke [18,41,42] efekte fenolnih ekstrakata.

2.2. Klasifikacija prirodnih antioksidansa

Antioksidativni sistem se prema prirodi ovih komponenti može klasifikovati na enzimska i neenzimska jedinjenja. Prvi uključuju superoksid dismutazu (SOD), katalazu (CAT), askorbat peroksidazu i glutation reduktazu [1,3542-44]. Geni koji se odnose na ove enzime otkrili su njihovu važnost tokom fiziološkog propadanja korijena skladištenja nakon žetve i kao odgovor na osmotski stres i apscizinsku kiselinu, kao i infekciju Xanthomonas axonopodis [44]. Druga grupa uglavnom sadrži fenolna jedinjenja, karotenoide, vitamine i osmolite [1]. Fenolna jedinjenja karakteriše prisustvo jednog ili više benzenskih prstenova i razlikuju se po složenosti baznog molekula, broju i lokaciji hidroksila i stepenu polimerizacije. Ova jedinjenja su sekundarni metaboliti koji spadaju u tri široke grupe: fenolne kiseline (derivati ​​benzojeve i cimetne kiseline), flavonoidi (flavonoli, flavonoli, flavanoni, flavoni, antocijanini) i tanini (tanini koji se hidroliziraju i proantocijanini). Pored ovih molekula razlikuju se i stilbeni, lignani i kumarini [45].

2.3. Poreklo i biohemijska struktura flavonoida, posebno Isorhamnetin

Fenolna jedinjenja su sekundarni metaboliti rasprostranjeni u biljkama. Ova jedinjenja imaju aromatični prsten sa jednom ili više hidroksilnih grupa (OH) i sadrže molekule u rasponu od jednostavnih fenolnih kiselina do polimerizovanih jedinjenja kao što su tanini. Sinteza fenolnih jedinjenja je složen proces koji prolazi kroz nekoliko faza. Fenolna jedinjenja su bioaktivni molekuli sa dva puta porijekla: s jedne strane šikimična kiselina i s druge strane molekuli fenilpropanoida. Biosinteza flavonoida kao što je izorhamnetin zasniva se na ovim putevima. Zapravo, s jedne strane, šikimat daje osnovni kostur polifenola koji imaju jedan ili više benzenskih prstenova (C6) koji nose jednu ili više hidroksilnih funkcija. S druge strane, postoji sinteza C6-C3 baze koja nastaje kondenzacijom fenilalanina u cimetnu kiselinu (Slika 1)[46].

Tačnije, šikiminska kiselina je u osnovi nekoliko reakcija i predstavlja kostur aromatičnih aminokiselina, koje su inicijatori fenolnih jedinjenja. Prvi korak se sastoji od kombinacije dva molekula: fosfoenolpiruvata i eritroze 4-fosfata, koji nakon četiri reakcije dovode do formiranja prvog skeleta fenola: šikimata ili šikiminske kiseline (CHoOs). Ovo kasnije predstavlja prvi prsten, koji karakteriše fenole sa dve hidroksilne grupe. Šikimat prolazi kroz šest reakcija koje završavaju u prvoj aminokiselini: fenilalaninu. Zahvaljujući dva ključna enzima, fenilalanin amonija-liazi (PAL) i cinamat-4-hidroksilazi (C4H), fenilalanin sukcesivno formira cinamat i p-kumarat. U ovom koraku nivo aktivnosti PAL-a mogao bi kvantitativno regulisati akumulaciju fenolna jedinjenja. Molekul p-kumarata je izvor derivata kumarina. Put sinteze fenilpropanoidnih molekula karakterizira prisustvo ključnog enzima nazvanog 4-kumarat CoA ligaza (4CL), koji katalizira u prisustvu tiolne funkcije koenzima A(CoA) p-kumaričnu kiseline u 4-kumaroil CoA(C30Ha2N-O18P, S). Aromatični A-prsten flavonoida nastaje kondenzacijom tri molekula malonil-CoA (-C6).

Nakon toga, 4-kumaroil CoA proizveo je naringenin halkon, objašnjavajući vezu između aromatičnog B-prstena i 3C prstena halkona (C6-C3-). Halkon je ključni element u ovoj temi jer je prekursor svih flavonoida zasnovanih na skeletu od petnaest ugljenika koji se sastoji od dva benzenova prstena. Nakon toga, halkon se pretvara u naringenin (koji se naziva i flavanon ili trihidroksi flavon) djelovanjem halkon izomeraze (CHI). S jedne strane, flavoni kao što su apigenin, acacetin, krizin ili luteolin se sintetiziraju iz naringenina u prisustvu flavona sintaza (FNS). S druge strane, različiti flavonoli i jedinjenja jantarne kiseline se proizvode iz naringenina u prisustvu dva enzima; flavanon 3-dioksigenaza (F3D) i flavonol sintaza (FS). Osim derivata flavonola, proizvode se i druga jedinjenja, kao što su kempferol, miricetin i kvercetin. Transferom metil grupe iz S-adenozil-L-metionina, izorhamnetin se proizvodi u prisustvu flavon 3'-O-metiltransferaze (FMT)[47,48]. Zatim, izorhamnetin je monometoksi flavon ili O-metilirani flavonol iz klase flavonoida. To je kvercetin (prekursor) u kojem je hidroksi grupa na poziciji 3' zamijenjena metoksi grupom. Neki derivati ​​izorhamnetina su prisutni u prirodi, kao što je izoramnetin 3-O- -d-glukopiranozid, izorhamnetin 3-O-neohesperidozid i izorhamnetin 3-O-rutinozid iz Calendula officinalis L .[20].

Zapravo, flavonoidi se smatraju jednom od najvažnijih grupa u porodici polifenola. Imaju strukturu zasnovanu na tipu difenil propana sa dva benzenska prstena (prsten A i B, vidi sliku 2) povezana lancem od tri ugljika koji formira zatvoreni piranski prsten (C prsten). Stoga se njihova struktura naziva C6-C3-C6. Položaji O-glikozilacije su C7 u flavonima, izoflavonima, flavanonima i flavonolima i C3 u flavonolima i antocijanidinima. Položaji C-glikozilacije su C6 i C8 u flavonima [49]. Osim toga, značaj antioksidativne uloge fenolnih jedinjenja povezan je sa stepenom hidroksilacije molekula. Flavonoidi uključuju izoflavone, flavone, flavanone i njihove glikozide i flavonole kao izorhamnetin, koji se također naziva 3'-metoksi kvercetin i 3-metil kvercetin [50]. U biljkama, enzim, glikoziltransferaze zavisne od UDP, odgovoran je za glikozidni oblik izorhamnetina (izorhamnetin 3-O-glukozid). Ovaj enzim koristi nukleotid difosfatne šećere, obično uridin difosfatne (UDP) šećere, da prenese metilnu grupu u ciklus i poveže funkciju glikozida sa izorhamnetinom [51].

2.4.Izolacija i analize ilsorhamnetina porijeklom iz ljekovitog bilja

Rasprostranjenost izorhamnetina u ljekovitom bilju je vrlo široka, a metode ekstrakcije i analize su raznolike. Posebno su traženi derivati ​​izorhamnetina. Hidroksilne i metilne grupe pomažu u njihovoj karakterizaciji. Neke metode se koriste za ekstrakciju izorhamnetina, među njima i bazirane na frakcionisanju, koristeći kemometrijske pristupe, enzimsku i superkritičnu tečnu ekstrakciju (SFE-CO2). Prvo, frakcioniranje se može koristiti za pojednostavljenje ekstrakcije uklanjanjem svih ulja i lipofilnih pigmenata iz uzoraka koji sadrže lipide. Odmašćeni uzorak je također sonikiran prije maceracije u mješavini metanola i vode. Kromatografija se tada može koristiti za analizu fenolnih spojeva, posebno flavonoida [49]. Za ove posljednje spojeve koristi se LC-MS i često se primjenjuju i elektrosprej jonizacija (ESI) i hemijska ionizacija pod atmosferskim pritiskom, a najbolja osjetljivost na flavonoide se općenito postiže u načinu rada negativnih jona [49]. Na primjer, procijenjena je fitohemija biljnih frakcija Calligonum Azel Maire, sakupljenih iz pustinje u Tunisu, a tečna hromatografija ultra visokih performansi spojena sa masenom spektrometrijom četvorostrukog vremena leta UHPLC-ESI-QTOF korištena je za identifikaciju fenola među njima flavona. i flavanole, koji su bili najzastupljeniji identificirani fenolni spojevi [52]. Konkretnije, prisustvo izorhamnetin glukozida i izorhamnetin glukozil-ramnozida potvrđeno je kao glavni spojevi u listovima jestivog halofita Mesembryanthemum edule korištenjem LC/ESI-MS/MS tehnologije [3]. Ovaj rad su pratili drugi koji su koristili LC-ESI-TOF-MS za karakterizaciju mnogih polifenola; među njima su flavonoidi identificirani iz nadzemnih dijelova faze punog cvjetanja halofita kao što su Arthrocnemum indicum [5], Tamarix gallica [16], Glaucium flavum[13] i Salsola kali[8]. Slično prošlim radovima, LC-ESI-TOF-MS i GC-MS profiliranje Artemisia herbal je urađeno da bi se identifikovali fenoli, kao što su flavoni, flavonoli i flavonoidni alkaloidi[7]. Drugi rad je obavljen na Pancratium maritimum i analiza pomoću HPLC-DAD-ESI/MS otkrila je prisustvo flavonoida uključujući flavonol kao izorhamnetin sa njihovim pentoksidnim i heksozidnim konjugatima kao što je izorhamnetin di-heksozid [53].

Kao nemasno jedinjenje, flavonoli se mogu izolovati heksanom. Zatim se može koristiti polarni rastvarač kao što je etanol. Studija na Limoniastrum guyonianum korištenjem HPLC-a pokazala je prisustvo mnogih fenola, među njima izorhamnetin-3-O-rutinozid [54].

Daleko od fenolnih ekstrakata, fenolna jedinjenja se takođe nalaze u uljima kao što je maslinovo ulje [55]. Ovi spojevi imaju sposobnost zaštite ulja od oksidacije i poboljšanja nutritivne vrijednosti ulja. Izorhamnetin, kao fenolno jedinjenje, takođe je otkriven u uljnom ekstraktu iz sjemena tuniskog crnog kima (Nigella sativa L.) dobijenom sa zelenim otapalom kao što je 2-metil tetrahidrofuran (MeTHF) kao alternativa petroleju ili heksanu rastvarač na bazi fenolnih jedinjenja za ekstrakciju uljem obogaćenih [10]. Prisustvo izorhamnetina je odobreno HPLC analizom. Analize pomoću tečne hromatografije sa detektorom diodnog niza (LC-DAD) otkrile su visoku količinu izorhamnetina u rasponu između 6,3 i 6,6 (ug/g ulja) nakon ekstrakcije ulja iz crnog kima pomoću MeTHF-a i heksana, respektivno. Osim toga, korištenjem H nuklearne magnetne rezonancije (HNMR) i C nuklearne magnetne rezonancije (CNMR), neki flavonolni glikozidi kao što su kempferol-3-O-rutinozid (nikotiflorin) i izorhamnetin-3-O-rutinozid (narcizam) karakterizirani su iz nadzemnih dijelova Peucedanum aucheri Boiss prikupljenih u gradu Marivan, provincija Kurdistan, Iran [56]. NMR metoda otkriva svojstvo da određena atomska jezgra spoja stupaju u interakciju s magnetskim poljem. Ovo svojstvo, a to je stvaranje magnetske rezonancije na određenoj frekvenciji, daje informacije o strukturi molekula. Drugo, odabrani su matematički modeli za procjenu efikasnosti ekstrakcije flavonola, posebno da bi se razumjelo najbolji način za dobijanje izorhamnetin-3-O-rutinozida [20]. Urađena je multivarijantna faktorska analiza pomoću cvjetova Calendula officinalis. Analizirani su linearni, kvadratni, punokubni i specijalni kubni modeli. Konačna puna kubika je bila najprikladnija, omogućavajući veću efikasnost u ekstrakciji izorhamnetin{18}O-rutinozida za 60 posto. Za ovu studiju korišćeni su enzimi Rapides Maxi Fruit i Viscozyme pod nekim važnim faktorima koji utiču na aktivnost enzima u uslovima superkritičnog CO2 kao što su pritisak, temperatura, pH, vreme i vodeni rastvor etanola. Konačno, ekstrakritična metoda ekstrakcije tekućinom korištena je za ekstrakciju fenolnih spojeva kao što su flavonoli. Prije mnogo godina, na kori Eucalyptus globulus prvi put je korištena ekstrakritična tečna ekstrakcija, koristeći čisti i modificirani CO2 s vodom, etil acetatom i etanolom [57]. Autori su pokazali da superkritični CO2 u kombinaciji sa etanolom može ekstrahovati značajne količine fenolnih jedinjenja, uključujući izorhamnetin. HPLC-MS kvantifikacija odredila je neke flavonole, kao što su izorhamnetin-heksozid (0,26 gg-I ekstrakta) i jednostavni izorhamnetin (14,29 mg:gl ekstrakta). Etanol je korišten kao ko-rastvarač. Kvantifikacija je izvršena tečnom hromatografijom visokog pritiska opremljenom detektorom fotodiodnog niza. izoramnetin 3-O-glukozil-ramnozil-ramnozid, izoramnetin 3-O-glukozil-ramnozil-pentoksid, izoramnetin 3-O-glukozil-ramnozid i izoramnetin 3-O-glukozil -pentoksid su bili najzastupljeniji flavonoli ekstrahovani iz superkritičnih ekstrakata O. ficus-indica. Kao što je ranije pomenuto, tečna hromatografija visokog pritiska ili HPLC je uobičajena metoda za analizu fenolnih jedinjenja. U soku od jabuke i kruške otkriven je izorhamnetin 3-O-glukozid. Zapravo, odvajanje flavonol glikozida u ekstraktu jabuke "Brettacher" pomoću HPLC i masene spektrometrije otkrilo je prisustvo dva oblika glikozida kao što su izoramnetin 3-O-glukoza i izorhamnetin 3-O-galaktozid [ 58].