Part1: Anti-Malignant Ascites Effect Of Total Diterpenoids From Euphorbiae Ebracteolatae Radix Is Attributable To Alterations Of Aquaporins Via Inhibiting PKC Activity in The Kidney
May 18, 2022
Za više informacija. Kontakttina.xiang@wecistanche.com
Apstraktno: Ova studija je ocijenila anti-ascites efekat ukupnog diterpenoida ekstrahovanog iz Euphorbiae ebracteolate Radix(TDEE)na maligne ascitske miševe i elucidirala njegov mehanizam. TDEE je ekstrahiran diklorometanom i podvrgnut koloni hromatografiji. Utvrđeno je da čistoća šest diterpenoida izoliranih iz TDEE-a bude 77,18% od strane HPLC-a. TDEE (3 i 0,6 g sirovog bilja/kg, p.o.) smanjila je ascites i povećan izlaz urina. U međuvremenu, analiza održivosti tumorske ćelije, ciklusa i apoptoze ukazuje da TDEE nemaantitumorAktivnosti. Osim toga, nivoi ekspresije akvaporina (AQP) i membranske translokacije nivoa protein kinaze C (PKC) α i PKCβ ububrezii ćelije su izmjerene. TDEE je smanjio nivo AQP1-4 i inhibirao PKCβ ekspresiju u membrani. Četiri glavna diterpenoida, osim spoja 2, smanjila su nivo AQP1 u ljudskim ćelijama bubrega-2. Spoj 4 i 5 je inhibirao AQP2-4 izraz u unutrašnjem murinu medullary sakupljanje ćelija za prigušivanje. Inhibicija izraza AQP1-4 izazvana diterpenoidima je blokirana phorbol-12-myristate-13-acetatom (PMA; agonistom PKC). Diterpenoidi iz TDEE su glavne anti-ascites komponente. Anti-ascites efekt diterpenoida može biti povezan s izmjenama u AOPs u bubrega za promociju diureze. Inhibicija AOP1-4 ekspresije od strane TDEE je vezana za inhibiciju aktivacije PKCβ.
Ključne riječi: Euphorbia ebracteolate Hayata; diureza; bioaktivne komponente; terpenoidi; ćelije bubrega; PKC inhibitor
Kliknite da biste naučili cistanche koristi od bilja
1. Uvod
Euphorbia ebracteolate Hayata (EEH) je član roda Euphorbia u porodici Euphorbiaceae i široko se koristi u liječenju abdominalne distenzije i edema, parazitske infekcije, tuberkuloze, i drugih bolesti u tradicionalnoj kineskoj medicini(TCM)[1]. Korijen EEH (EER) sadrži razne terpenoide, koji se smatraju efektivnim komponentama. Nedavne studije o terpenoidima su sprovedene kako bi se utvrdilo njihovoanti-upalni,antivirusni,anti-tuberkuloza, i drugi efekti in vitro [2-5]. Međutim, osnovne istraživačke istrage o tradicionalnim učincima EER-a u liječenju distenzije abdomena i edema su ograničene. Prema teoriji TCM-a, EER može brzo eliminirati distenziju trbuha i edem promovirajući mokrenje i proljev [6]. Naše prethodne studije su pokazale da totalni diterpenoidi iz EER-a (TDEE) mogu izazvati proljev regulišući izraz akvaporina (AQP)-1 i AQP3 [7]. Međutim, do danas, efektivne supstance anti-ascita u EER-u ostaju nejasne.
Distenzija trbuha i edem su opisani kao ascites u modernoj medicini. Ascites su patološka akumulacija peritonealne tekućine [8]. Postoji mnogo uzroka formiranja ascitesa, kao što su ciroza, tumor, zatajenje srca, i nefrotski sindrom [9]. Pojava ascitesa je vezana za portalnu hipertenziju, što dovodi do splanchnic arterijske vazodilatacije, smanjenja efektivnog cirkulirajućeg volumena, aktivacije endogenih vazokonstriktorskih sistema, i avidnog zadržanja vode u bubrega [10]. AQP su brzi membranski transporteri vode za prelazak epitelnih i endotelnih barijera i tako igraju fundamentalnu ulogu u održavanju ravnoteže vode [11]. Brojne studije su pokazale da AQP imaju ključnu ulogu u formiranju i poremećaju ascitesa [12-15]. Postoje mnoge vrste AQP u bubrega, kao što su AQP1, AQP2, AQP3, i AQP4[16]. Pošto TDEE može regulirati izraz AQP-ova u crvu [7], predlažemo da se TDEE može iskorišteni u liječenju ascita regulisanjem AQP-ova u bubregu.
AQP-i igraju kritičnu ulogu u formiranju urina, međutim, mehanizmi regulacije AQP ekspresije u bubregu nisu pojašnjeni. Trenutno, samo ograničen broj izvještaja ukazuje da se AQP regulišu putem protein kinaze C(PKC) i protein kinaze A(PKA)puteva [17-20]. Neki terpenoidi izolirani iz Euforbija (npr. uphold i ingenol 3-angelate) imaju regulatorne efekte na PKC. TDEE može regulirati AQP izraz u bubrege putem PKC puta.
U ovoj studiji smo izvađili TDEE i ocijenili njegov anti-ascites efekt kao i ana-lyzirani AQPs izraz, PKC, i PKA aktivnosti u bubrege ascitnih miševa. Zatim smo izolirali i pročistili glavne diterpenoide iz TDEE-a kako bismo istražili njegove efekte na nivoe ekspresije proteina AQPs i mRNA u dvije vrstebubregske celije(ljudske ćelije bubrega-2 (HK-2) i murine unutrašnje medullary sakupljanje ćelija lijekova(mIMCD3)). Konačno, biramo diterpenoidni spoj (euphebracteolatin A), koristeći phorbol-12-myristate-13-acetat (PMA; agonist PKC) za aktiviranje PKC puta, kako bi se identificiralo da li je izraz AQP u bubrega reguliran putem PKC. Ova studija je za cilj odredila anti-ascites efekt TDEE u EER-u i pružila osnovu za kliničku primjenu EER-a i identifikaciju lijekova kandidata za diurezu i antiascitske efekte.
2. Rezultati
2.1.Efekti TDEE na težinu ascitske tekućine, težinu urina i sadržaj fekalne vode
Liječenje ascitičke miševe sa totalnim ekstraktom EER (TEER) i TDEE (3 i 0,6 g sirovog bilja/kg, p.o.) i furosemida (pozitivan lijek) značajno je smanjilo povećanje ascitske težine tekućine u odnosu na modelsku grupu (figura 1A). Nacisti 1C pokazali su da utezi urina znatno (p<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">
2.2. Effects of TDEE on Serum Albumin Levels in Ascitic Mice
Albumin u serumu je najobilniji protein u plazmi kralješka i može održavati osmotski pritisak krvi i regulirati transport vode. Slika 1B je pokazala da je proizvodnja ascita u model miševa uzrokovalo značajno smanjenje serumske albumina u odnosu na normalnu grupu. Nakon liječenja furosemidom, TEER-om i TDEE(3 i 0,6 g sirovog bilja/kg, p.o.), nivoi seruma albumina su efektivno oporavljani u odnosu na grupu modela. U NTDEE grupama nije primjećivano poboljšanje u ovom indeksu.
2.3.Effects of TDEE on Tumor Cell Viability, Cycle, and Apoptosis in Ascitic Mice
U malignim ascitesima, tumorske ćelije plutaju u asciticnoj tekućini. Procijenili smo da li je smanjenje ascitesa povezano sa antitumoratnom aktivnošću TEER-a i TDEE-a. Rezultati su pokazali da ovi lijekovi ne inhibiraju održivost tumorske ćelije (slike 2A)i da nisu dovele do hapšenja ćelije (slike 2B) i apoptoze (slike 2C, D).
2.4.Efekti TDEE na AQP izraz u bubrege ascitički miševi
Bubreg je važan organ za reabsorpciju vode i koncentraciju mokraće. AQP vodeni kanali posredovanje brzog transporta vode u bubrege. Tako smo ispitali izraz AQP u bubrege. Na sliku 3 se pokazalo da poboljšanje ascitesa nije imalo malo uticaja na AQPsexpression u bubrege u poređenju sa normalnom grupom. Kada se tretira sa TEER i TDEE, izraz AQP1, AQP2, AQP3 i AQP4 proteina je bio označeno niži nego u grupi modela u većini doza. TEER je rezultirao značajnim smanjenjem AQP2, AQP3 i AQP4 izraza u dozama od 3,0 i 0,6g sirovog bilja/kg, dok je AQP1 izraz smanjen samo pri niskoj dozi(0,6g sirovog bilja/kg). Primjetno, TDEE je imao iste inhibicione efekte na AQP3 i AQP4 izraz kao TEER u dvije doze. Razlika između TDEE i TEER je u tome što je TDEE inhibirao izraz AQP1 i AQP2 samo pri visokoj dozi (3g sirovog bilja/kg). NTDEE je imao slabe efekte na AQPslevels u bubrege, i regulirao je samo ekspresiju AQP4 proteina u dozi od 3g sirovog bilja/kg.
2.5.Efekti TDEE na PKC i PKA Aktivacija u bubrege ascitički miševi
Prethodne studije su pokazale da bi AQP ekspresija mogla biti regulisana aktivacijom PKC i PKA. Ispitali smo efekte TDEE na PKC-a, PKC-β, i PKA aktivaciju. Aktivacija PKC-a je mjerena njegovom translokacijom iz cistosola u ćelijske membrane. Kao što je prikazano na figurama 4A, i B, nivo ekspresije proteina PKC-β u membranskom razlomku je značajno opao u TDEE grupama, dok nije bilo značajnog uticaja na nivo ekspresije PKC-α membranskih proteina. Fosforipaza C(PLC) je važna uzvodno signalna molekula koja posreduje aktivaciju PKC-a. TDEE tretman nije imao nikakvog uticaja na nivoe fosforiliziranog i ukupnog PLC-a (na 4D. PKA je heterotetramer koji se sastoji od dvije katalitičke podsjednice vezane za dvije regulatorne podjenice. Oslobađanje katalitičke podjenice je obilježje PKA aktivacije. Na figure 4C, TDEE nije uticao na izražavanje PKA katalitičke podsjednice.
2.6.Određivanje sadržaja šest diterpenoida u TDEE-u tečnom kromatografijom visokih performansi (HPLC)
Rezultati pokusa na životinjama pokazali su da je TDEE bio glavni efektivni dio EER-a. Izolirali smo šest diterpenoida (strukture spojeva od 1 do 6 su prikazane na 5.; spektralni podaci su dodani u Dopunski materijal) iz TDEE i koristili su te spoje kao standarde za određivanje sadržaja diterpenoida u TDEE. HPLC hromatogrami za TDEE i šest diterpenoidnih standarda predstavljeni su na 6. Sadržaj spoja od 1 do 6 je bio 1,07%,12,00%,12,69%,9,15%, 39,26% odnosno 3,02%, što je 77,18% TDEE.
2.7.Effects of Diterpenoids from TDEE on AQPs Expression in Kidney Cells
TDEE je bio aktivni dio EER-a koji je inhibirao ascites smanjenjem AQP1, AQP2, AQP3 i AQP4 izraza u bubregu. U isto vrijeme, TDEE je također značajno smanjio proteinsku i mRNA ekspresiju AQP1, AQP2, AQP3 i AQP4 u ljudskim ćelijama bubrega-2(HK-2)i unutrašnjim medularnim ćelijama za skupljanje murina (mIMCD3)(7. Glavne komponente TDEE su diterpenoidi. Uporedili smo efekte između TDEE i mješavine diterpenoida (šest izoliranih diterpenoida je bilo pomiješano prema njihovom sadržaju u TDEE). Rezultati su pokazali da su inhibitori efekti mješavine diterpenoida i TDEE na AQP1, AQP2, AQP3 i AQP4 izraz bili slični (na 7. Aktivnosti četiri glavna diterpenoida iz TDEE su ocijenjene in vitro. Brojke 8 i 9 pokazale su da su nivoi ekspresije proteina i mRNA AQP1 u ćelijama HK-2 značajno smanjeni spojem 3,4 i 5. Liječenje spojem 2 nije prouzrocilo primjetno snižavanje AOP1 na nivou proteina i mRNA. Za ove spoje, spoj 3(ent-abietane tip diterpenoid)je bio aktivniji od ostalih spoja. U mlMCD3 ćelijama, četiri diterpenoidna spoja su inducirao različite stepene inhibicije AQP2, AQP3 i AQP4 izraza. Rezultati ekspresije proteina i gena su predstavljeni na figurama 8 i 9. Spojevi 4 i 5 su posjedovali moćan AQP2, AQP3 i AQP4 inhibitori efekte u odnosu na kontrolnu grupu na genu i proteinskom nivou. Spoja 2 i 3 su pokazala samo različite efekte na Aqp2, Aqp3 i Aqp4 mRNA izraz.
2.8.Effects of Activator of PKC on Diterpenoid-Induced Inhibition of AQP
Rezultati eksperimenta na životinjama ukazuju da je TDEE istovremeno inhibirao aktivnost PKCβ i AQP ekspresiju u bubrezima miša koji nose ćelije tumora H22. Da bi se dodatno razjasnilo da li je PKC regulirao izraz AQP u ćelijama bubrega, PKC agonist (PMA) je bio pretretivan u HK-2 i mIMCD3 ćelijama na 1,5 h prije diterpenoidne (Euphebracteolatin A)stimulacije. Otkrivena je promjena membrane PKCβ, AOP1, AOP2, AOP3 i AOP4 izraza. Rezultati zapadnog bolta pokazali su da euphebracteolatin A može smanjiti proteinski izraz membrane PKCβ, AOP1, AOP2, AOP3 i AOP4, a efekti bi mogli biti umanjeni PMA-om pretreatmentom (10.
