Dio 1: Novi pristup za poboljšanje regenerativnog potencijala cirkulirajućih endotelnih progenitornih ćelija kod pacijenata sa završnom stadijumom bolesti bubrega

Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstract: Cirkulirajuće endotelne progenitorne ćelije (EPC) izvedene iz koštane srži olakšavaju vaskularnu popravku u nekoliko organa uključujući bubrege, ali se progresivno smanjuju u završnoj fazibolest bubrega(ESKD) pacijenata, što je u korelaciji sa kardiovaskularnim ishodima i povezanim mortalitetom. Tako smo utvrdili da li pojačavanje tkiva reparativnih efekata mezenhimalnih stromalnih ćelija (BM-MSC) ljudske koštane srži sa vaskulogenim efektima rekombinantnog humanog relaksina (RLX) može potaknuti proliferaciju i funkciju EPC. CD34 plus EPC su izolovani iz krvi zdravih pacijenata i pacijenata sa ESKD, kultivisani dok se nisu formirali kasni EPC, a zatim stimulisani sa BM-MSC podlogom za stanje (CM; 25 procenata o), RLX (1 ili 10 ng/mL), ili oba kombinovani tretmani. Dok je sam RLX stimulirao proliferaciju EPC, formiranje kapilarne cijevi i zacjeljivanje rana in vitro, ove mjere su brže i značajno poboljšane kombinovanim efektima CM-a i RLX izvedenih iz BM-MSC u EPC dobijenim od zdravih i ESKD pacijenata. Ovi nalazi imaju važne kliničke implikacije, jer su identificirali novu kombiniranu terapiju koja može obnoviti i poboljšati EPC broj i funkciju kod pacijenata sa ESKD.

Ključne riječi: endotelne progenitorne ćelije; bolest bubrega u završnoj fazi; mezenhimske matične ćelije izvedene iz koštane srži; relaxin; zarastanje rana; angiogeneza; regeneracija

Kliknite ovdje da saznate više o cistanche za prodaju

1. Uvod

Hronična bolest bubrega(CKD) je globalni zdravstveni problem, definiran kao smanjenje brzine glomerularne filtracije (GFR) manje od ili jednako 60mL/min/1,73m², koji često dovodi do završne faze (stadij V) bolesti bubrega (ESKD; definira se kao GFR manji ili jednak 15 mL/min/1,73m2)[2]. Patološke karakteristike CKD-a uključuju tubularnu atrofiju povezanu sa smanjenjem bubrežnih kapilara i podocita, uništavanjem endotelnih stanica bubrega i razvojemfibroza bubrega[3,4]. Endotel bubrega je kompromitovan tokom ovih procesa, što dovodi do poremećene angiogeneze i funkcije bubrega [5]. Praćenjeoštećenje bubrega, endotelne progenitorne ćelije (EPC) izvedene iz koštane srži se regrutuju na mjesta ozljede kako bi se olakšalo obnavljanje tkiva [6]. EPC igraju ključnu ulogu u sazrijevanju i proliferaciji endotelnih stanica bubrega, vaskularnom integritetu i popravljanju oštećenog endotela. Međutim, cirkulirajući EPC brojevi se progresivno smanjuju kod pacijenata sa ESKD [7-9], što je u korelaciji sa štetnim kardiovaskularnim ishodima [9,10] i dugotrajnom smrtnošću.

Prijavljeno je da mezenhimalne stromalne ćelije (MSC) promovišu angiogenezu stimulacijom EPC programiranja. Međutim, dok su MSC-i procjenjivani u različitim kliničkim ispitivanjima [13], njihova sposobnost da olakšaju regeneraciju endotela bubrega nije istražena. Nedavne studije iz naše laboratorije su identifikovale poboljšani terapeutski potencijal kombinovanja MSC-ova dobijenih iz ljudske koštane srži (BM) sa antifibrotičnim agensom, odnosno rekombinantnim humanim (gen-2) relaksinom (serelaksinom; RLX[14) u poboljšanju stanja oštećenje bubrega,upalai fibroza u pretkliničkim modelima bolesti. Dok sam RLX može stimulirati proliferaciju EPC iz ljudske krvi i proizvodnju dušikovog oksida (NO) in vitro, i vaskulogenezu kod miševa in vivo[18], ostaje nepoznato da li bi njegovi kombinirani efekti s BM-MSC-ima mogli ubrzati i/ili poboljšati EPC- izvedena angiogeneza i zarastanje rana. Ova studija je stoga procijenila terapeutski potencijal kombinacije RLX i BM-MSC izvedenih kondicioniranih medija (CM) na zdravu u odnosu na ESKD proliferaciju EPC, angiogenezu i zacjeljivanje rana in vitro.

2. Materijali i metode

2.1.EPC izolacija i kultura iz periferne krvi

Nakon prijema potpisanog obrasca za pristanak pacijenta, oko {{0}} mL krvi od zdravih muškaraca kontrolne grupe prikupljeno je od Službe za krv Australijskog Crvenog križa. Nasuprot tome, samo ~5 mL krvi muških pacijenata sa ESKD prikupljeno je iz medicinskog centra Monash zbog njihovog zdravstvenog stanja. Svi uzorci krvi su obrađeni u roku od 24 sata od vremena uzimanja. Svi uzorci krvi su razrijeđeni sa 1× Hankovom izbalansiranom otopinom soli (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD) do ukupne zapremine od 20 mL. Zatim je krv pažljivo nanesena preko 15 mL Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Švedska) u Falcon epruvetu od 50 ml (BD Biosciences, San Jose, Kalifornija, SAD) i centrifugirana na 400× g 40 minuta na sobnoj temperaturi kako bi se odvojio pjenasti premaz od ostalih komponenti korištenjem metode odvajanja gradijenta gustine kao što je prethodno opisano [19,20]. Nakon gradijenta odvajanja, gornji sloj koji je sadržavao plazmu i trombocite je uklonjen pažljivim umetanjem serološke pipete, ostavljajući neometanom puhasti sloj koji sadrži mononuklearne ćelije iz periferne krvi (PBMC), koji se sastoji od endotelnih progenitor ćelija (EPC). Peleta je resuspendirana u 2 ml medija za rast endotelnih ćelija (EGM)-2 mikrovaskularnog (MV) Bullet Kit (proizvod #CC-3162, Lonza, Hayward, Kalifornija, SAD); dopunjen sa 5 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS), 0,04 posto hidrokortizona, 0,4 posto faktora rasta humanih fibroblasta (hFGF) i 0,1 posto faktora rasta vaskularnog endotela (VEGF), R3-inzulinu sličan faktor rasta (IGF) )-1, askorbinska kiselina, humani epidermalni faktor rasta (hEGF) i gentamicin sulfat/amfotericin (GA-1000), za kulturu izolovanih EPC. Ćelije su brojane korišćenjem CountessM automatizovanog brojača ćelija (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija, SAD) pre nego što su posejane na ploče/bočice za kulturu obložene fibronektinom.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 ćelija/kolonija) pomoću testa jedinice za formiranje kolonije (CFU).

2.2. Priprema kondicioniranog medija (CM) iz kultiviranog BM-MSC

Kako bi dodavanje BM-MSC-a u EPC kulture kompromitovalo krajnje tačke povezane s EPC-om za mjerenje, odlučeno je da bi bilo bolje analizirati efekte CM-a izvedenog iz BM-MSC-a na EPC funkciju, kao što je prethodno korišteno za analizu drugih krajnjih tačaka [19]. Ukratko, BM-MSC su uzgajani u Alpha-Minimum Essential Mediji (-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australija), dopunjeni sa 16 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS) i 1 posto 200 mM L-glutamin i 1 posto penicilina/streptomicina. Jednom kada su ćelije dosegle ~80 posto konfluentnosti, BM-MSC-ovi su dalje subkultivirani i postavljeni u 12-ploču sa gustinom od ~0,5×10 stepeni po jažici i održavani u kulturi 24-48 h kako bi se osigurala vezanost ćelije. Za pripremu kondicioniranog medija (CM) od BM-MSC-a, ćelije su nakratko isprane tri puta sa prethodno zagrijanim 1 mL 1× HBSS. Nakon koraka ispiranja, 500 μL bazalnog medija endotelnih ćelija bez faktora rasta seruma (EBM); Proizvod #CC-3121.Lonza, Hayward, Kalifornija, SAD) je dodan ćelijama i održavan u kulturi na 5 posto CO, 37 stepeni još 24 h. Na kraju ovog perioda inkubacije, CM je zatim sakupljen i centrifugiran na 400×g tokom 10 minuta kako bi se uklonili svi ćelijski ostaci. CM u alikvotima od 500 μL je pohranjen na -80 stepeni do buduće upotrebe.

2.3. Functional Assays

2.3.1. Tretman kultiviranih kasnih EPC-a

Nakon što su kasni EPC sakupljeni, izvršeni su funkcionalni testovi. Svi eksperimenti su izvedeni u odlomcima 3-6. Funkcionalni testovi su obavljeni kako bi se istražio učinak (i)25 posto kondicioniranih medija izvedenih iz BM-MSC (25 posto CM)[20]; (ii)1 [RLX-1] ili 10 [RLX-10 ]ng/mL [18] RLX (predstavlja cirkulišući nivo H2 relaksina koji se nalazi kod trudnica [21]); ili (i) kombinovani efekti 25 posto CM i 1 ili 10 ng/mL RLX; (iv) 20 posto FBS je korišteno kao pozitivna kontrola na proliferaciju i (angiogeni) potencijal formiranja cijevi kasnih EPC dobijenih od kontrolnih pacijenata . Grupe za tretman su upoređene sa netretiranim ćelijama.

2.3.2. Test održivosti i proliferacije

Održivost i proliferativni potencijal kasnih EPC-a utvrđeni su korištenjem {{0}}(4,5-dimethythiazol-2-il)-2,5- test difenil tetrazolijum bromida (MTT) prema uputstvima proizvođača (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australija). Ukratko, ~5×103 ćelija po jažici je zasejano u 96-ploče (BD Falcon, North Ryde, NSW, Australija), nakon čega su ćelije tretirane sa BM-MSC izvedenim CM, RLX (10 ng/ mL) ili kombinacija CM i RLXat 1 ili 10 ng/mL tokom 24 h. Na kraju perioda inkubacije, dodano je 10 μL MTT reagensa za označavanje (0,5 mg/mL, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australija) i inkubirano na 37 stepeni Cand 5 posto CO2 naredna 4 h. Ćelije su solubilizirane dodavanjem 100 μL otopine za solubilizaciju (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australija), a potencijal proliferacije kasnih EPC-a određen je mjerenjem apsorbancije svakog uzorka na 590 nm pomoću mikroploče. čitač (Bio-strategy, Balwyn North, VIC, Australija) i analiziran pomoću softvera SoftMax Pro za Windows OS (ver. 7.3, Molecular Devices LLC, Kalifornija, SAD). Svaka od tretiranih grupa je izvedena i analizirana u šest ponavljanja.

2.3.3. Test formiranja cijevi

Efekti različitih tretmana za promicanje angiogenog potencijala kasnih EPC-a, korištenjem eseja formiranja cijevi, određeni su pomoću μ-angiogeneze testa (Abidi, Fitchburg, WI, SAD). Ukratko, 10 μL Matrigela smanjenog faktora rasta (GFR) (Proizvod #356231, Corning, Tewksbury, MA, SAD) dodano je u unutrašnju jažicu μ-Slide kompleta za analizu angiogeneze (Abidi, Fitchburg, WI, SAD ). Konfluentne kulture kasnih EPC zasijane su na obložene ćelije i tretirane CM-om izvedenim iz BM-MSC, RLX(10 ng/mL) ili kombinacijom CM i RLX pri 10 ng/mL. Ukupni volumen od 50 μL ćelijske suspenzije koja sadrži ~1 × 104 ćelije je primijenjen na svaku jažicu. Slike su odmah snimljene i označene kao 0-satna vremenska tačka. Sposobnost ćelija pod različitim tretmanima da

epruvete su posmatrane i slike su snimljene na 2-24 h nakon sjetve ćelije pomoću svjetlosnog mikroskopa. Broj epruveta, dužina cevi i broj tačaka grananja određeni su korišćenjem softvera ImageJ.

2.3.4. Test zarastanja rana

Učinci različitih tretmana na regenerativni potencijal kasnih EPC-a određeni su pomoću testa zacjeljivanja rana. Da bi se izvršio test, ~1 × 10 ćelija je suspendovano u 50 μL medijuma za rast i zasijano u 2 jažice silikona u posudi od 35 mm za test zarastanja rana (Abidi Inc., Fitchburg, WI, SAD). Umjetne rane unutar posuda su stvorene blagim uklanjanjem silikonskih jažica sterilnom pincetom (razmak=500±100μm）. Posude su dopunjene sa 2 mL 50 posto EGM-2, uz dodatak raznih tretmani uključujući BM-MSC izveden CM, RLX(10 ng/mL) ili kombinaciju CM i RLX pri 1 ili 10 ng/mL. Broj ćelija koje su migrirale da zatvore ranu procijenjen je pomoću svjetlosne mikroskopije. migrirane ćelije su uhvaćene na 0-24 h nakon tretmana. Postotak površine zatvaranja jaza određen je korištenjem Image] softvera.

2.3.5. Analize slike

Sve analize slika za funkcionalne testove izvedene su pomoću ImageJ za MacOS (ver. 1.8, Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, MD, SAD). Za potencijal formiranja cijevi kasnih EPC-a, slike su analizirane korištenjem dodatka za analizu angiogeneze i zabilježena su četiri različita parametra uključujući ukupnu dužinu, broj mreža, broj spojeva i broj grana. Za test zarastanja rana, područje zatvaranja rane je analizirano ručnim označavanjem područja bez ćelija u svakoj od vremenskih tačaka. Sva mjerenja su obavljena najmanje 3 puta radi kontrole varijacija.

2.3.6. Imunofluorescencija

Lokalizacija proteina peptidnog receptora 1 porodice relaksin (RXFP1; srodni RLX receptor) u kultivisanim kasnim EPC je određena korišćenjem imunofluorescentnog bojenja. Prvo, ~1× 1{{20}} stepena ćelije uzgojene na 13 mm staklenom pokrovnom stakalcu (prevučenom poli-D-lizinom) u pločici 12-jažice su fiksirane u 4 posto PFA za 15 min na sobnoj temperaturi. Fiksne ćelije su blokirane radi nespecifičnog vezivanja proteina korišćenjem 1% goveđeg serumskog albumina (BSA) tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. Na kraju perioda inkubacije, ćelije su isprane u PBS-u 5 minuta (3 puta) i inkubirane sa zečjim poliklonskim RXFP1 antitelom (aa 609-624; A 9227;1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Nemačka )u 0,01 posto BSA preko noći na 4 stepena. Ćelije su isprane sa PBS i inkubirane sa kozjim anti-zečjim Alexa-fluor 594 sekundarnim antitijelom (1:500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Australija) u 0,01 posto BSA tokom 2 h na sobnoj temperaturi. Nuklearna boja je izvedena dodavanjem 40 μL DAPI u medijum za montažu Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornija, SAD) i pokriveno staklom. Imunoreaktivni RXFP1 protein je vizualiziran pomoću fluorescentnog mikroskopa pri uvećanju ×40 (Olympus BX51), a slike su spojene pomoću softvera ImageJ.

2.4. Statističke analize

Svi podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SEM i sve statističke analize su obavljene korištenjem GraphPad Prism'M (ver. 9; GraphPad Software Inc., San Diego, Kalifornija, SAD). Way-ANOVA je korištena da se uporedi učinak različitih tretmana na proliferaciju (MTT test) i angiogeni (test formiranja cijevi) potencijal kasnih EPC, nakon čega je uslijedio Tukeyjev post-hoc test kako bi se omogućila višestruka poređenja između tretiranih grupa. Ponovljena mjera - dvosmjerna - ANOVA je korištena da se uporedi učinak različitih tretmana na zatvaranje rane od strane kasnih EPC-a tokom vremena, nakon čega je uslijedio Tukeyjev post-hoc test za upoređivanje svake od grupa tretmana. P-vrijednost manja od 0.05 smatra se statistički značajnom.