Dio Ⅰ Helator željeza, PBT434, modulira transcelularnu trgovinu željezom u mikrovaskularnim endotelnim stanicama mozga
Apr 28, 2023
Abstract
Gvožđe i drugi prelazni metali, kao što su bakar i mangan, neophodni su za podržavanje funkcije mozga, ali je prekomerna akumulacija citotoksična. Ova prekomjerna akumulacija metala, posebno željeza, uobičajena je za nekoliko neuroloških poremećaja; to uključuje Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, Friedrichovu ataksiju i druge poremećaje koji se manifestiraju neurodegeneracijom i povezanim nakupljanjem željeza u mozgu. Upravljanje fluksom gvožđa putem krvno-moždane barijere pruža prvu liniju odbrane od prekomerne akumulacije gvožđa u normalnoj fiziologiji i ovim patološkim stanjima. U ovoj studiji smo utvrdili da kelator željeza PBT434, koji se trenutno razvija za liječenje Parkinsonove bolesti i višestruke sistemske atrofije, modulira unos željeza u mikrovaskularne endotelne ćelije ljudskog mozga (hBMVEC) kelacijom ekstracelularnog Fe.2 plus. Tretman hBMVEC sa PBT434 dovodi do povećanja obilja transkripata za transferin receptor (TfR) i ceruloplazmin (Cp). Western blot i ELISA analize otkrivaju i odgovarajuće povećanje proteina. Unutar ćelije, PBT434 povećava detektabilan nivo dobrotvornog, labilnog Fe2 plus; podaci ukazuju da ovaj Fe2 plusse oslobađa iz feritina. Osim toga, PBT434 potencira efluks željeza vjerovatno zbog povećanja citosolnog željeznog željeza, supstrata za izvoznika željeza, feroportina. PBT434 se brzo i dvosmjerno uravnotežuje kroz hBMVEC krvno-moždanu barijeru. Ovi rezultati ukazuju da PBT434-kompleks gvožđa nije supstrat za unos hBMVEC i stoga podržava model u kojem bi PBT434 kelirao intersticijsko gvožđe i inhibirao ponovni unos gvožđa od strane endotelnih ćelija krvno-moždane barijere, kao i inhibiraju njegovo preuzimanje od strane drugih ćelija neurovaskularne jedinice. Sve u svemu, ovo predstavlja nov i obećavajući mehanizam za terapeutsko heliranje željeza.
Kliknite ovdje da dobijetekoje su prednosti Cistanchea
Uvod
Terapija kelacijom metala (MCT) se dugo koristila kao tretman za trovanje prijelaznim metalima i za genetske poremećaje u metabolizmu esencijalnog metalnog jona koji dovodi do prekomjerne akumulacije metala [1–3]. Dva primjera potonjeg su hiper-akumulacija bakra kod Wilsonove bolesti [4] i željeza u nasljednoj hemohromatozi [5]. I bakar i željezo su katalizatori oksidativnog stresa i stoga su citotoksični u koncentracijama koje premašuju sposobnost stanice i organizma da 'prate' ove redoks aktivne prijelazne metale [6, 7]. Akumulacija gvožđa je, posebno, uglavnom idiopatska; zaista, povećanje željeza je obilježje starenja mozga [8-10]. Patološki, ova akumulacija željeza u mozgu je karakteristika mutacija gena koji nisu povezani s metabolizmom željeza [11–15], kao i niza drugih neurodegenerativnih bolesti, od kojih nekima nedostaje specifična genetska veza kao što je starenje [16], Alchajmerova bolest [16]. 17], Friedreichova ataksija [18] i Parkinsonova bolest [19]. Kao grupa, takvi se poremećaji mogu smatrati neurodegeneracijom sa akumulacijom željeza u mozgu (NBIA) iako je ovaj akronim obično ograničen na one za koje je identificirana genetska veza [11, 13, 14].
U slučaju preopterećenja gvožđem, cilj je „očistiti“ telo od viška gvožđa zbog defekta u apsorpciji ili efluksu gvožđa ćelijama. Ovdje je cilj nadmašiti fiziološke kelatore željeza s lijekom; jedinjenje koje ima dobru farmakokinetiku i visok afinitet za fero gvožđe je ciljni lek. Budući da je tijelo prezasićeno esencijalnim metalom, malo je zabrinutosti zbog izazivanja nedostatka u toku liječenja. Liječenje cerebralne bolesti terapijom kelacijom željeza zahtijeva drugačiju strategiju. Ovo nije problem sistemskog preopterećenja gvožđem, već akumulacije gvožđa u područjima patologije sa štetnim nizvodnim posledicama. Akumulacija gvožđa povezana sa starenjem kod Parkinsonove bolesti (PD), na primer, potencijalno doprinosi oštećenju ćelija povezanih sa oksidativnim stresom [20]. Prekomjerno labilno željezo potiče pogrešno savijanje -sinukleina u neuronima crne supstance. Upotreba kelatora visokog afiniteta može dovesti do određenog smanjenja opterećenja gvožđem u mozgu, ali će sasvim sigurno izazvati nedostatak gvožđa koji je barem u starijoj populaciji kontraindiciran s obzirom na sistemski nedostatak željeza uobičajen za tu starosnu grupu [21] . Kelator sa optimalnim afinitetom ima potencijal da smanji nakupljanje gvožđa kao i prateći oksidativni stres zbog viška labilnog gvožđa i osnovnih bolesti.
Cistanche tubulosaiCistancheovi efekti
Jedan kelator odobren za upotrebu u liječenju preopterećenja gvožđem izazvanog transfuzijom kod pacijenata sa talasemijom je deferipron (DFP, robna marka Ferriprox) [5, 22]. DFP se također koristio u liječenju Friedreichove ataksije [23] i Parkinsonove bolesti [24, 25]. U meta-analizi se pokazalo da DFP osigurava značajno smanjenje sadržaja gvožđa u miokardu, kao i veću zaštitu srca kod pacijenata sa talasemijom od deferoksamina, klasičnog helatnog sredstva za gvožđe [5]. S druge strane, DFP se brzo metabolizira u jetri [26], a noviji rad je pokazao da helatira Fe2 plus na aktivnom mjestu histonskih lizin demetilaza ovisnih o željezu, aktivnost koja je u korelaciji s ranije neprepoznatom citotoksičnošću [27]. Ovo otkriće naglašava ključno ograničenje u korištenju terapije helacijom željeza, odnosno nadmetanje lijeka za fiziološki esencijalno željezo, bilo u skladištu željeza ili proteinu koji sadrži protetske vrste željeza. Bez obzira na to, DFP je, na primjer, pokazao djelotvornost u probnom tretmanu Parkinsonove bolesti faze 2, što pokazuju i analitički (smanjeno opterećenje željezom u mozgu pomoću T2- ponderisane MRI) i indeksi ponašanja (kognitivna i motorna neuronska funkcija) [ 24, 25].
Međutim, afinitet DFP-a za Fe3 plus ostaje zabrinjavajući. Stabilna vrsta DFP-gvožđa je tris-kompleks, [Fe(DFP)3] 0 [28]. Dok je neutralnost ovog kompleksa idealna za mobilizaciju gvožđa iz ćelije, konstanta stabilnosti za njega, ~1037, čini DFP pravim čistačem gvožđa; u ovom kontekstu, njegova inhibicija enzima gvožđa poput lizin demetilaze je predvidljiva [27]. Ova zabrinutost odražava potrebu za razvojem kelatora željeza koji imaju membransku permeabilnost DFP-a, ali znatno slabiji afinitet i za Fe2 plus i za Fe3 plus. Ova posljednja karakteristika ograničava uklanjanje lijeka iz protetskog metala i termodinamički potencijal helatnog agensa da katalizira autooksidaciju željeznog željeza koja rezultira proizvodnjom reaktivnih vrsta kisika. U suštini, jaki kelatori feri gvožđa katalizuju prooksidativno svojstvo Fe2 plus [29]. U ovoj studiji izvještavamo kako takav kelator željeza s umjerenim afinitetima za željezo i željezo modulira protok željeza u mikrovaskularnim endotelnim stanicama mozga koje formiraju krvno-moždanu barijeru (BBB).
Cistanche pilule
Ovaj lijek, PBT434 [5,7-dihloro-2-((metilamino)metil)-8-hidroksi-3-metilkinazolin-4 (3H)-on, Slika 1A] , formira kompleks bis-gvožđa sa log konstantama stabilnosti od ~11 i ~15 za Fe2 plusi Fe3 plus, odnosno [30]. PBT434 je spriječio gubitak neurona substantia nigra pars compacta (SNpc), snizio akumulaciju nigral-sinukleina, smanjio sadržaj željeza u srednjem mozgu povezan s modelom PD i spasio motoričke performanse u dva mišja modela Parkinsonove bolesti bez ikakvog očiglednog iscrpljivanja sistemskih zaliha željeza [30]. PBT434 je također efikasan u mišjim modelima višestruke sistemske atrofije (MSA) [30, 31], motoričkog poremećaja sličnog Parkinsonovoj bolesti, ali kojeg karakterizira pogrešno savijanje -sinukleina i naknadna akumulacija koja uzrokuje formiranje glijalnih citoplazmatskih inkluzija koje su zaštitni znak patologija bolesti [32]. Značajno je da je PBT434 smanjio markere oksidativnog stresa u modelima PD kod miševa [30] što ukazuje na to da 1) PBT434 cilja na zalihe željeza koje su inače bile pripremljene da funkcioniraju kao prooksidansi i 2) PBT434 nije potencirao ovu nastalu citotoksičnost zasnovanu na oksidaciji. PBT434 je na zadovoljavajući način završio studiju Faze 1 [33].
Rad koji je ovdje predstavljen je osmišljen da ispita uticaj koji PBT434 ima na trgovinu gvožđem u ćelijama barijere mozga, mikrovaskularnim endotelnim ćelijama koje zajedno sa osnovnom glijom formiraju krvno-moždanu barijeru. Ove studije su koristile dobro validiranu besmrtnu endotelnu ćelijsku liniju u monoslojnim i transwell formatima kulture [34–37]. Primarni cilj ovih studija bio je utvrditi kinetiku uzimanja i efluksa željeza iz ovih stanica i njihovu modulaciju pomoću PBT434. Transwell BBB model je također korišten za demonstriranje dvosmjernog transcelularnog protoka PBT434 preko barijere endotelnih stanica. Model je u molekularnom smislu pokazao da PBT434 inhibira apsorpciju gvožđa kelacijom dok stimuliše izliv gvožđa. Studije snimanja ćelija pokazuju da PBT434 pristupa istom labilnom bazenu gvožđa koji je sondirao klasični Fe2 plushelatni agens, 2,2'-bipiridin ili bipiridil, i fluorescentna sonda za obojeno gvožđe. Rezultati sugeriraju mogući mehanizam djelovanja za PBT434 koji uključuje inhibiciju unosa sistemskog gvožđa u BBB i naknadnu sekvestraciju moždanog gvožđa u intersticijalnom prostoru.
Rezultati
1. PBT434 nema citotoksične efekte na mikrovaskularne endotelne ćelije mozga
Da bismo odredili odgovarajući raspon radnih koncentracija za PBT434 u našoj in vitro ćelijskoj kulturi, koristili smo MTT test za praćenje hBMVEC mitohondrijalne funkcije kao odgovor na PBT434. Na osnovu prethodnih izvještaja [30], tretirani su rasponom koncentracija PBT434 do 100 μM tokom 24 sata. Nismo uočili značajne promjene u vijabilnosti hBMVEC ni sa jednom testiranom koncentracijom (slika 2).
2. PBT434 se brzo preuzima i prometuje preko hBMVEC barijere
PBT434 je oralno bioraspoloživi lijek koji može lako prodrijeti u BBB, kao što se vidi u studijama provedenim na miševima i ljudima [30, 38, 39]. Pratili smo akumulaciju PBT434 u hBMVEC uzgojenim u monoslojevima koristeći 14C-obilježeni PBT434 kao radiotracer. Podaci su pokazali da se u prvoj fazi 14C-PBT434 brzo uravnotežio između medijuma za unos i ćelije. Ovo početno upijanje je praćeno dodatnom sporom akumulacijom tokom 3 h koja je pokazala stopu od 30,1 ± 9,8 pmol/mg/h (slika 3A). U protokolu za unos, apsorpcija se gasi i ćelije se ispiru na 4˚C prije obrade za akumulaciju 14C-PBT434 (metode). U posebnom eksperimentu, ispitali smo efluks 14C-PBT434 iz hBMVEC nakon perioda punjenja od 30 minuta. U protokolu efluksa ćelije se ispiru na 25˚C. Podaci na slici 3B pokazuju da je u pranju na 25˚C izgubljeno približno 92 posto ćelija akumuliranog 14C-PBT434 (cf 550 pmol 14C-PBT434/mg proteina u 3A na 30 minuta do 43 pmol 14C-PBT433 protein na t=0 u 3B). Došlo je do daljeg sporog gubitka preostalog 14C-PBT434 (slika 3B). Podaci ukazuju na dva aspekta akumulacije i efluksa PBT434 putem hBMVEC-a. Protok kroz plazma membranu brzo dostiže ono što se čini kao ravnotežu, bilo tokom apsorpcije ili efluksa. Međutim, u oba procesa pojavljuje se još jedan sporiji proces. Ovo sugerira da je unutar ćelije, neki dio ćelije PBT434 u lokalu/stanju koje je u kinetičkom stabilnom odnosu sa frakcijom u ravnoteži sa vanćelijskim miljeom. Kinetička analiza zabilježena na slici 3B procijenila je da je ovaj skup PBT434 predstavljen sa 27±4 pmol/mg proteina u ćelijskom lizatu kada su ćelije tretirane sa 20 μM reagensa.
Da bismo ispitali transcelularni tok PBT434, upotrijebili smo dobro validiran in vitro model BBB-a koji koristi rast na apikalnoj strani transwell membrane [35, 36, 40, 41]. Barijerna svojstva ovih transwell kultura su potvrđena kvantificiranjem njihove transendotelne električne otpornosti (TEER) i nepropusnosti za FITC-obilježeni dekstran (S1 slika). Uporedili smo unos 14C-PBT434 na luminalnoj (ili apikalnoj, krvnoj strani) (slika 4A) sa unosom na abluminalnoj (ili bazolateralnoj, moždanoj strani) (slika 4C) membrani. U istom eksperimentu, odgovarajući efluks (transcelularni tok) je kvantifikovan pojavom 14C-PBT434 u efluksnoj komori (slika 4, paneli B i D). Brzine ovih procesa su date u Tabeli 1. Podaci o masi ilustrovani na Slici 4 (paneli B i D) pokazuju da je neto protok PBT434 kroz ovaj model krvno-moždane barijere bio isti u dva smjera. Bilo je 976±185 pmol 14C-PBT434 akumuliranog u bazalnoj komori (slika 4B) i 1033±210 pmol kvantificirano u bazalnoj komori (slika 4D). Ova bliska ekvivalencija se odrazila i na blisko slične stope efluksa PBT434 na dvije barijerne membrane (Tabela 1). Međutim, postojao je značajno veći unos PBT434 na bazolateralnoj membrani u ovom modelu barijere, što je ilustrovano ~50 posto većim gubitkom spoja iz bazalne komore (slika 4C) što je odgovaralo ~40 posto većoj stopi prividnog unosa stanica (Tabela 1). Predviđa se da će snažnije upijanje rezultirati većom akumulacijom. Analiza ćelija u 3h je pokazala da su zadržale ~6 μM PBT434 bez obzira na smjer fluksa. Vrijednosti su bile 8,1±1,3 μM (apikalno prema bazalnom) i 4,7±1,2 μM (bazalno prema apikalno). Kao što je gore navedeno, ova analiza prati ispiranje ćelija prije lize i kvantifikaciju ukupnog ćelijskog proteina i 14C-PBT434. Pored toga, medijum u apikalnoj komori je sadržavao RPMI plus 10 procenata FBS i 10 procenata NuSeruma, dok je bazalna, 'moždana' komora sadržavala samo RPMI (metode). Razuman zaključak bio je da je veće 'apsorpcija' na bazalnoj membrani odražavalo adsorpciju PBT434 na površini ćelije koja je bila ograničena u apikalnoj komori prisustvom proteinskih komponenti u serumu. Nakon pranja ćelija za akumulaciju PBT434, ovaj adsorbovani materijal (koji je registrovan kao 'uptake') je uklonjen. Ponavljanje ovog eksperimenta sa fluksom, ali sa serumom u bazalnoj komori, pokazalo je da, zaista, serum potiskuje ovu vjerovatnu površinsku apsorpciju PBT434 ćelije (S2 slika).
3. PBT434, za razliku od bipiridila, ne ograničava unutarćelijsku dostupnost labilnog željeza
Budući da PBT434 ima umjereniji afinitet prema željezu u usporedbi s klasičnim kelatorima željeza kao što su deferipron ili bipiridil, ispitali smo kako se ta razlika odražava u efektu PBT434 na ćelijski labilni bazen željeza (LIP) hBMVEC-a. Da bismo to učinili, iskoristili smo propusni, Fe2 plus-specifična fluorescentna boja FerroOrange, koja reaguje sa dobrotvornim citoplazmatskim gvožđem. Videli smo značajnu ablaciju fluorescencije u ćelijama kada su tretirane bipiridilom, u skladu sa helacijom LIP-a ovim kelatorom gvožđa visokog afiniteta i na taj način blokirajući delovanje fluorescentnog indikatora gvožđa (slika 5A). Nasuprot tome, PBT434 se nije takmičio sa FerroOrangeom za Fe2 plus, ponašanje u skladu s njegovim umjerenijim afinitetom [30]. Rezultati su pokazali da je PBT434, ali ne i PBT434-sastao sa neaktivnim derivatom, inducirao povećanje od 34 ± 9 posto Fe dostupnog FerroOrange-u2 plusšto sugerira da je ovaj helirajući agens mobilizirao željezo u ćeliji bez istovremene toksičnosti. Podaci predstavljeni u nastavku sugeriraju da je ovo željezo došlo iz feritina.
Ranije je pokazano da PBT434 obnavlja ekspresiju osiromašenog proteina feroportina kod miševa tretiranih MPTP na nivo sličan onom kod miševa bez lezije [30]. Ovaj rezultat, zajedno sa povećanjem intracelularnog obojenja gvožđem kao odgovor na PBT434, sugeriše potencijalni efekat na ćelijski sistem odgovora na gvožđe i funkciju nizvodnih proteina povezanih sa gvožđem. Da bismo to procijenili, prvo smo sproveli kvantitativnu PCR (qPCR) analizu učinka PBT434 na obilje transkripata za nekoliko proteina koji rukuju gvožđem (slika 6). Dok su transkripti za protein efluksa gvožđa, feroportin (Fpn) i dva citoplazmatska šaperona gvožđa, PCBP1 i 2 bili nepromenjeni, obilje mRNA za receptor transferina (TfR) i feroksidaze, ceruloplazmina (Cp), nije uticalo na promijeniti. TfR i Cp transkripti su povećani za 2,8 odnosno 3.6-puta, respektivno. Ekspresija transferinskog receptora (TfR) je povezana sa sistemom elementa koji reaguje na gvožđe (IRE)/regulatorni protein gvožđa (IRP) [42–44]. Povećanje TfR mRNA sugerira da se PBT434 takmiči sa PCBP1-zavisnom isporukom željeza za sklapanje Fe, S klastera koji pretvara regulatorni IREBP iz proteina koji vezuje RNA u citosolnu akonitazu [45]. Dakle, PBT434 pomjera ovu regulatornu modulaciju prema vezivanju RNK i odgovarajućoj inhibiciji degradacije TfR mRNA. Kod ćelijskog nedostatka gvožđa, ekspresija Cp je, delimično, regulisana HIF-1 [46]. Povećanje funkcije HIF-1 proizlazi iz smanjenja njegove hidroksilacije aktivnošću prolil hidroksilaze u reakciji ovisnoj o željezu [47]. Kao iu slučaju IREBP, čini se da PBT434 smanjuje količinu željeza koje služi kao kofaktor u HIF-1 hidroksilaciji i degradaciji. U ovom modelu, povećanje stabilnog nivoa ovog aktivatora transkripcije povećava transkripciju Cp.
Koristeći kombinaciju ELISA analize i Western blottinga, ispitali smo ekspresiju proteina koji rukuju gvožđem u PBT434 ili PBT434-met tretiranom hBMVEC; primjeri WB analiza dati su na slici 7A. Podaci su pokazali da je obilje TfR monomera i dimera značajno povećano za 24 sata kao i Cp (slike 7B i 7C). Oba povećanja su bila paralelna sa PBT434--ovisnim povećanjem odgovarajućih transkripata (slika 6). Nasuprot tome, ekspresija proteina efluksa željeza, Fpn, bila je neosjetljiva na tretman PBT434 (slika 7D).
Koristili smo ELISA kao dodatnu metodu za kvantifikaciju promjena nabora na koje ukazuju western blot podaci. Dakle, hBMVEC je tretiran sa PBT434 tokom 24 sata, a ćelijski lizati su analizirani ELISA testom za TfR (slika 8A). Prestruko povećanje TfR-a kao odgovor na tretman PBT434 kvantificirano ELISA-om bilo je ekvivalentno onom dobivenom analizom western blotova (slika 7B). ELISA je također korištena za procjenu količine izlučenog i GPI-vezanog Cp proteina, koristeći HepG2 ćelije kao pozitivnu kontrolu. Što se tiče Cp izlučenog u medijumu za rast, ovaj pristup je bio ograničen po tome što je obilje sCp-a iu HepG2 i hBMVEC kondicioniranom medijumu bilo na ili ispod donje granice osetljivosti ovog testa (S3 slika). Međutim, to je omogućilo procjenu obilja GPI-Cp. U ovoj metodi, ćelije su tretirane fosfatidilinozitol specifičnom fosfolipazom C (PI-PLC), koja cijepa GPI sidro; tako kondicionirani medij je koncentrisan i analiziran pomoću Cp-ELISA. Iako je ovaj pristup pokazao da je PBT434 povećao količinu GPI-Cp u HepG2 ćelijama, opet nije uspio da otkrije bilo koji Cp koji oslobađa PI-PLC (slika 8B). ELISA je također omogućila direktnu metodu za kvantifikaciju feritina. Da bi se to uradilo, hBMVEC je napunjen sa 1 uM Fe-citrata tokom 24 sata, nakon čega je usledio tretman u odsustvu ili prisustvu PBT434 tokom dodatnih 1 h. Dobijeni ćelijski lizati su podvrgnuti ELISA analizi na feritin (slika 8C). Za razliku od povećanja TfR, tretman sa PBT434 je srušio protein feritina (Ft) za ~18 posto. Zaista, ovaj gubitak Ft proteina je bio očigledan nakon samo 1 sata tretmana sa reagensom. Vremenska priroda ovog rezultata može se povezati sa povećanjem dobrotvornog Fe2 plus koji je gore naveden nakon 30-minutnog tretmana sa PBT434. Kao što je kasnije objašnjeno, smanjenje feritina je pokazano nakon tretmana sa drugim ćelijskim permeantnim Fe2 plus helatnim agensima [48].
4. 55Fe2 plusapsorpcija je inhibirana kompleksiranjem sa PBT434
S obzirom na brzu ekvilibraciju PBT434 u hBMVEC unutar 30 minuta, u poređenju sa sporim, dvofaznim unosom i ravnotežom Fe2 plus tokom 24 sata [49], pretpostavili smo da PBT434 i Fe2 plus ne dijele isti mehanizam preuzimanja. Da bi se ovo testiralo, monoslojevi su inkubirani sa radioaktivno obeleženim 55Fe2 plus u odsustvu ili prisustvu PBT434 ili PBT434-met, a 55Fe2 plus apsorpcija je praćena tokom 3 h (slika 9A). PBT434 je značajno smanjio stopu unosa 55Fe2 plus, kao i ukupnu akumulaciju 55Fe2 plus u ćelijskim lizatima (slika 9C). Ovaj efekat nije viđen kod PBT434-met. Poređenje stopa preuzimanja PBT434 i 55Fe pokazuje da se PBT434 i Fe2 plus preuzimaju odvojenim transportnim putevima. Nadalje, inhibicija uzimanja 55Fe u prisustvu PBT434, ali ne i PBT434-met, sugerira da ekstracelularni PBT434-kompleks gvožđa nije ligand za transportere gvožđa u hBMVEC-u, odnosno ZIP8, i ZIP14.
Cistanche suplementi
Da bismo dalje ispitali ulogu PBT434 u akumulaciji gvožđa, testirali smo efekat njegovog prethodnog izlaganja na 55Fe2 plus unos. Ćelije prethodno tretirane sa PBT434 koje su, nakon ispiranja, izložene 55Fe2 plus, pokazale su povećanje brzine unosa i akumulacije 55Fe2 plus nakon 3 sata (slika 9, paneli B i D). Ova povećana akumulacija se održavala najmanje 24 sata. Ovi podaci sugeriraju da prethodno izlaganje stanica PBT434 prolazno pojačava unos željeza. Neočekivano, predtretman sa PBT434-također je pokazao povećanje i apsorpcije i akumulacije (slika 9B), ali ovaj efekat nije bio toliko značajan ili postojan kao onaj koji pokazuje PBT434.
Pokazali smo da je uzimanje željeza iz 59Fe-transferina podržano feri redukcijom i fero-permeacijom na plazma membrani su [50, 51]. Jedan eksperimentalni ishod koji podržava ovaj TBI model preuzimanja gvožđa bio je ukidanje ovog unosa inhibicijom aktivnosti ekstra-citoplazmatske ferireduktaze; drugi rezultat je bio 60 posto inhibicije preuzimanja gvožđa TBI ferozinom, jakim helirajućim agensom fero gvožđa [50]. Ova potonja strategija je korištena da se pokaže da PBT434, ali ne i PBT{10}}, također inhibira unos željeza u TBI (Slika 10).
5. PBT434 stimuliše Fpn zavisan 55Fe2 plus efluks
PBT434 ima otprilike 20 posto sposobnosti deferiprona da proizvede prividnu stimulaciju Fe2 plus efluks iz neuronskih stanica [30]. Procijenili smo efluks 55Fe2 plus iz hBMVEC u odsustvu ili prisustvu PBT434 u kontrolnim ćelijama ili ćelijama tretiranim mini-hepcidinom, PR73. Hepcidin je peptidni hormon koji se nalazi i sistemski i u intersticijumu mozga koji se vezuje za Fpn i cilja na transporter radi razgradnje. Efekti hepcidina na funkciju izvoza gvožđa Fpn su opsežno proučavani [52–54]. Ranije smo pokazali da je efluks Fe2 plus iz hBMVEC zavisan od Fpn [35, 49]. PR73 ima EC50 od ~4 nM za degradaciju Fpn u GFP reporter testu [55]. hBMVEC u monoslojevima je napunjen sa 55Fe2 plus tokom 24 h u odsustvu ili prisustvu PR73. 55Fe-efluks je zatim kvantifikovan tokom perioda od 5 sati u stalnom odsustvu ili prisustvu PR73 u kombinaciji sa odsustvom i prisustvom PBT434 (slika 11). Dok je PR73 srušio efluks 55Fe iz kontrolne i PBT{31}}tretirane kulture, PBT434 je djelimično potisnuo inhibiciju zbog mini-hepcidina. U nedostatku PBT434, efluks gvožđa iz PR73-tretiranih kultura je smanjen za ~75 procenata, dok je nokdaun u kulturama tretiranim PBT{37}} bio samo ~50 procenata (slika 11 i tabela 2). Iz ovih rezultata mogu se izvući dva zaključka. Prvo, smanjenje Fpn-a od strane PR73 smanjuje efluks 55Fe u prisustvu kao iu odsustvu PBT434. Drugo, pod bilo kojim uslovom, PBT434 podržava značajnu, iako malu stimulaciju efluksa gvožđa.
Reference
1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Sintetički i prirodni kelatori željeza: terapeutski potencijal i klinička primjena. Future Med Chem. 2009; 1(9):1643–70.
2 . Nuñez MT, Chana-Cuevas P. Nove perspektive u terapiji kelacijom željeza za liječenje neurodegenerativnih bolesti. Pharmaceuticals (Basel). 2018; 11(4):109.
3. Tosato M, Di Marco V. Terapija kelacijom metala i Parkinsonova bolest: Kritički pregled termodinamike formiranja kompleksa između relevantnih metalnih jona i obećavajućih ili etabliranih lijekova. Biomolekule. 2019; 9(7).
4. Hedera P. Novosti o kliničkom liječenju Wilsonove bolesti. Appl Clin Genet. 2017; 10:9–19.
5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Komparativna efikasnost i sigurnost deferoksamina, deferiprona i deferasiroksa kod teške talasemije: meta-analiza 16 randomiziranih kontroliranih studija. PLoS One. 2013; 8(12):e82662.
6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Katalitički metali, askorbat i slobodni radikali: kombinacije koje treba izbjegavati. Radiat Res. 1996; 145(5):532–41. PMID: 8619018
7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Oksidativni stres: Ključni modulator u neurodegenerativnim bolestima. Molekule. 2019; 24(8).
8. Ashraf A, Clark M, So PW. Starenje Iron Mana. Front Aging Neurosci. 2018; 10:65.
9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrović K, Loitfelder M, et al. R2* mapiranje za željezo u mozgu: asocijacije na kogniciju u normalnom starenju. Neurobiol Aging. 2015; 36(2):925–32.
10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. Gvožđe, starenje mozga i neurodegenerativni poremećaji. Nat Rev Neurosci. 2004; 5(11):863–73.
11. Di Meo I, Tiranti V. Klasifikacija i molekularna patogeneza NBIA sindroma. Eur J Paediatr Neurol. 2018; 22(2):272–84.
12. Levi S, Finazzi D. Neurodegeneracija s akumulacijom željeza u mozgu: ažuriranje patogenih mehanizama. Front Pharmacol. 2014; 5:99–.
13. Levi S, Tiranti V. Neurodegeneracija s poremećajima akumulacije željeza u mozgu: vrijedni modeli usmjereni na razumijevanje patogeneze taloženja željeza. Pharmaceuticals (Basel). 2019; 12(1).
14. Meyer E, Kurian MA, Hayflick SJ. Neurodegeneracija s akumulacijom željeza u mozgu: genetska raznolikost i patofiziološki mehanizmi. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015; 16:257–79.
15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Neurodegeneracija s akumulacijom željeza u mozgu: pregled. Iran J Child Neurol. 2014; 8(4):1–8. PMID: 25657764
16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogio P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S, et al. Modeliranje neuroferitinopatije matičnim ćelijama otkriva željezo kao determinantu starenja i feroptoze tokom starenja neurona. Izvještaji o matičnim ćelijama. 2019; 13(5):832–46.
17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. Gvožđe i Alchajmerova bolest: od patogeneze do terapijskih implikacija. Front Neurosci. 2018; 12:632.
18. Llorens JV, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonzalez-Cabo P, Molto MD. Uloga željeza u Friedreichovoj ataksiji: uvidi iz studija o ljudskim tkivima i ćelijskim i životinjskim modelima. Front Neurosci. 2019; 13:75.
19. Puschmann A. Novi geni koji uzrokuju nasljednu Parkinsonovu bolest ili Parkinsonizam. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17(9):66.
20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Ciljanje metabolizma željeza u otkrivanju i isporuci lijekova. Nat Rev Drug Discov. 2017; 16(6):400–23.
21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Prevalencija anemije kod osoba starijih od 65 godina u Sjedinjenim Državama: dokaz visoke stope neobjašnjive anemije. Krv. 2004; 104 (8): 2263–8.
22. Pepe A, Meloni A, Capra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C, et al. Liječenje deferasiroksom, deferipronom i desferioksaminom kod pacijenata sa velikom talasemijom: poređenje srčanog gvožđa i funkcije utvrđeno kvantitativnom magnetnom rezonancom. Haematologica. 2011; 96(1):41–7.
23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A, et al. Deferipron kod Friedreichove ataksije: 6-mjesečno randomizirano kontrolirano ispitivanje. Ann Neurol. 2014; 76(4):509–21.
24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C, et al. Kelacija željeza u mozgu deferipronom u fazi 2 randomiziranog dvostruko slijepog placebom kontroliranog kliničkog ispitivanja u Parkinsonovoj bolesti. Sci Rep. 2017; 7(1):1398.
25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C, et al. Ciljanje kelatnog željeza kao terapeutskog modaliteta kod Parkinsonove bolesti. Antioksid Redox signal. 2014; 21(2):195–210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381
26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA, et al. Metabolički profili 1,2-dimetil- i 1,2-dietil-supstituisanih 3-hidroksi piridin-4-ona u urinu kod ljudi i pacova. Metabolizam i dispozicija lijekova. 1992; 20(2):256. PMID: 1352218
27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Ho PY, Bridges A, et al. Deferiprone: Pan-selektivna histon Lysine Demethylase Inhibition Activity and Structure Activity Study. Sci Rep. 2019; 9(1):4802.
28. Hider R. Nedavni razvoj usredsređen na oralno aktivne helatore gvožđa. Thalassemia Reports. 2014; 4 (2).
29. Kosman DJ. Metabolizam željeza u aerobima: upravljanje hidrolizom feri željeza i autooksidacijom željeza. Coord Chem Rev. 2013; 257(1):210–7.
30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera A, Masters CL, et al. Novo jedinjenje PBT434 sprečava neurodegeneraciju posredovanu gvožđem i alfa-sinukleinsku toksičnost u više modela Parkinsonove bolesti. Acta Neuropathol Commun. 2017; 5(1):53.
31. Heras-Garvin A, Refolo V, Schmidt C, Bradbury M, Stamler D, Stefanova N, urednici. PBT434 čuva dopaminergičke neurone, smanjuje alfa-sinukleinsku oligomerizaciju i poboljšava motornu funkciju u modelu transgene atrofije višestrukih sistema miševa. Annals of Neurology; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ SAD.
32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: Od osnovnih mehanizama do eksperimentalne terapije. Parkinsonizam povezan s poremećajem. 2020; 73:94–104.
33. Dawson VL, Dawson TM. Obećavajuće terapije za Parkinsonovu bolest koje modifikuju bolest. Science Translational Medicine. 2019; 11(520):eaba1659.
34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Komparativna studija četiri besmrtne linije kapilarnih endotelnih ćelija ljudskog mozga, hCMEC/D3, hBMEC, TY10 i BB19, i optimizacija uslova kulture, za in vitro model krvno-moždane barijere za studije propusnosti lijekova. Fluidi i barijere CNS-a. 2013; 10(1):33.
35. McCarthy RC, Kosman DJ. Ceruloplazmin glija i hepcidin različito reguliraju efluks željeza iz mikrovaskularnih endotelnih stanica mozga. PLoS One. 2014; 9(2):e89003.
36. Steimle BL, Smith FM, Kosman DJ. Nosači rastvora ZIP8 i ZIP14 regulišu akumulaciju mangana u mikrovaskularnim endotelnim ćelijama mozga i kontrolišu nivoe mangana u mozgu. J Biol Chem. 2019; 294(50):19197–208.
37. Stins MF, Badger J, Sik Kim K. Bakterijska invazija i transcitoza u transficiranim mikrovaskularnim endotelnim ćelijama ljudskog mozga. Microb Patog. 2001; 30(1):19–28.
38. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Prvo u ljudskom proučavanju PBT434, novog inhibitora male molekule agregacije -sinukleina (S4.001). Neurologija. 2019; 92(15 dodatak):S4.001.
39. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Studija faze 1 PBT434, novog inhibitora agregacije -sinukleina malih molekula, kod odraslih i starijih odraslih dobrovoljaca (4871). Neurologija. 2020; 94(15 dodatak):4871.
40. McCarthy RC, Kosman DJ. Aktivacija ekspresije ceruloplazmina ćelija glioblastoma C6 od strane susednih interleukina izvedenih iz endotelije ljudskog mozga u sistemu modela krvno-moždane barijere in vitro. Ćelijska komunikacija i signalizacija: CCS. 2014; 12:65.
41. McCarthy RC, Park YH, Kosman DJ. sAPP modulira efluks željeza iz mikrovaskularnih endotelnih stanica mozga stabilizirajući feroportin koji izvozi željezo. EMBO Reports. 2014; 15(7):809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889
42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Dva u tango: Regulacija metabolizma gvožđa kod sisara. Cell. 2010; 142(1):24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012
43. Zhou ZD, Tan EK. Signalni put regulatornog proteina gvožđa (IRP) – elementa koji reaguje na gvožđe (IRE) u ljudskim neurodegenerativnim bolestima. Molekularna neurodegeneracija. 2017; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/s{10}} PMID: 29061112
44. Crichton RR, Dexter DT, Ward RJ. Metabolizam željeza u mozgu i njegov poremećaj kod neuroloških bolesti. J Neural Transm. 2011; 118(3):301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066
45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A, et al. PCBP1-BolA2 chaperon kompleks isporučuje gvožđe za citosolni [2Fe-2S] skup klastera. Nat Chem Biol. 2019; 15(9):872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370
46. Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Fox PL. Uloga faktora koji izaziva hipoksiju-1 u transkripcijskoj aktivaciji ceruloplazmina nedostatkom gvožđa. J Biol Chem. 2000; 275(28):21048–54.
47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Hidroksilacija proteina pomoću faktora koji izaziva hipoksiju (HIF) Hidroksilaze: Jedinstvena ili sveprisutna? Ćelije. 2019; 8(5).
48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM, et al. Feroportinom posredovana mobilizacija feritinskog željeza prethodi degradaciji feritina od strane proteasoma. Embo j. 2006; 25(22):5396–404.
49. McCarthy RC, Kosman DJ. Feroportin i aktivnost egzocitoplazmatske feroksidaze potrebne su za efluks željeza iz mikrovaskularnih endotelnih stanica mozga. The Journal of Biological Chemistry. 2013; 288(24):17932–40.
50. McCarthy RC, Kosman DJ. Mehanistička analiza akumulacije gvožđa u endotelnim ćelijama BBB. Biometali. 2012; 25(4):665–75.
51. Kosman DJ. Telos metalo-redukcije i metalo-oksidacije u eukariotskoj trgovini gvožđem i bakrom. Metalomics. 2018; 10(3):370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341
52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA, et al. Strukturno-funkcionalna analiza feroportina definira mjesto vezivanja i alternativni mehanizam djelovanja hepcidina. Krv. 2018; 131(8):899–910.
53. Ganz T, Nemeth E. Hepcidin i homeostaza željeza. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823(9):1434–43.
54. Qiao B, Sugianto P, Fung E, Del-Castillo-Rueda A, Moran-Jimenez MJ, Ganz T, et al. Endocitoza feroportina izazvana hepcidinom ovisi o ubikvitinaciji feroportina. Cell Metab. 2012; 15(6):918–24.
55. Fung E, Chua K, Ganz T, Nemeth E, Ruchala P. Tiol-derivatizovani minihepcidini zadržavaju biološku aktivnost. Bioorg Med Chem Lett. 2015; 25(4):763–6.
Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J. Kosman
Odsjek za biohemiju, Jacobs School of Medicine i Biomedical Sciences, State University of New York u Buffalu, Buffalo, NY, Sjedinjene Američke Države
