DIO Ⅰ: Upalni proces modulira ekspresiju i lokalizaciju WT1 u podocitima što dovodi do oštećenja bubrega
Mar 23, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ, PABLO ZAPATA-BENAVIDES I DR.
Uvod
Wilmov tumor-1 gen(WTI) je jedan od glavnih gena uključenih u preživljavanje podocita i neefikasnu bubrežnu filtraciju. Upalni procesi dovode dobubregneuspjeha ovo bi se moglo dogoditi kroz modulaciju WT1(Wilmov tumor-1 gen). WT1(Wilmov tumor-1 gen) kodira faktor transkripcije, protein cinkovog prsta koji ima četiri glavne izoforme alternativnim spajanjem u egzonu 5(17AA±) i egzonu 9(KTS±)(1). KTS-izoforma ima veći afinitet za DNK, KTS plus se ko-lokalizuje sa spliceosomskim proteinima u citoplazmi (2, 3).WT1(Wilmov tumor-1 gen) igra ključnu ulogu u embriogenezi, prvenstveno u gonadama ibubregrazvoj; kod odraslih, njegova ekspresija je ograničena na specijalizovane visceralne ćelije ububreg(podociti) i neophodan je za održavanje i modulaciju nekoliko gena, kao što su podokaliksin, nefrin (NPHS1) i faktor transkripcije uparene kutije (4-6). Mutacije ili smanjenje ekspresije WTl mogu dovesti do smanjene ekspresije nefrina i podokaliksina i povezano je sa nefropatijama kao što je glomeruloskleroza(5, 7-10).
Nefrotski sindrom je najčešći bubrežni sindrom u djetinjstvu, njegova histološka klasifikacija je Minimalna nefrotska promjena, fokalna segmentna glomeruloskleroza i difuzna mezangijalna skleroza, a prema stepenu odgovora na steroide klasificira se kao osjetljivi i rezistentni nefrotski sindrom (11) .
efekti cistanchea: protiv upale
mutacija WT1(Wilmov tumor-1 gen) se obično javlja kod djece sa nefrotskim sindromom otpornim na steroide, rijetkom bolešću koja pogađa 10-15 posto pacijenata sa nefrotskim sindromom(12,13). Oko 80 posto sve djece sa sporadičnim nefrotskim sindromom reagira na liječenje steroidima, međutim, nisu pronađene mutacije u WT1 (Wilmov tumor-1 gen) u velikoj kohortnoj studiji (14). Smanjenje ekspresije nefrotskog sindroma otpornog na steroide iu manjoj mjeri kod pacijenata sa nefrotskim sindromom osjetljivim na steroide (15). U mišjem modelu sistemske upale izazvane lipopolisaharidom (LPS), 24 h nakon primjene LPS-a, WT1(Wilmov tumor-1 gen) je translociran u citoplazmu i bio je povezan sa smanjenjem ekspresije nefrina, ključne komponente za održavanje prorezane dijafragme u podocitima i bitne za ispravnu glomerularnu filtraciju, pokazujući time WT1(Wilmov tumor-1 gen) djeluje kao transkripcijski faktor za regulaciju gena za nefrin (16).
U ćelijama raka pluća A459 tretiranim faktorom nekroze tumora-alfa (TNFa), translokacija WT1(Wilmov tumor-1 gen) uočen je protein u citoplazmu, što sugerira da upalni stimulus može promijeniti njegovu intracelularnu lokalizaciju i transkripcijsku funkciju (17). Fosforilacija može igrati ulogu u moduliranju regulatorne aktivnosti transkripcije WT1(Wilmov tumor-1 gen) ometanjem nuklearne translokacije, kao i inhibicijom WT1(Wilmov tumor-1 gen) DNK-vezivanje(18) fosforilacijom Ser-365 i Ser-393 posredovanom protein kinazom u domenu cinkovog prsta (19).
Sepsa je rezultat sistemskog inflamatornog odgovora i karakterizira je oslobađanje pro- i protuupalnih citokina izazvanih infekcijom. Akutna povreda bubrega je česta kod kritično bolesnih pacijenata u prisustvu akutne upale i ima snažnu vezu s progresijom hroničnog oštećenja bubrega (20,21). Postoje dokazi da upala igra važnu ulogu u oštećenju različitih organa, uključujućibubrezi(22). U ovom radu smo procijenili učinak proinflamatornih citokina na modulaciju WT1(Wilmov tumor-1 gen) ekspresija i njena translokacija u citoplazmu.
korist cistanche tubulosa: protiv karcinoma i rakatumor
Materijali i metode
Životinjski model. Ženke BALB/c miševa (stare 8-10 sedmica) su dobijene iz Harland Mexico (Meksiko Siti, Meksiko). Miševi su držani u kavezima pod kontroliranom sobnom temperaturom, vlagom i svjetlošću (12/12 h svjetlo-tamni ciklus) s vodom i hranom ad libitum. LPS Escherichia coli O111:B4 (Sigma Aldrich, Toluca, Meksiko Siti, Meksiko) i jedan injekcija LPS-a je davana u dozi od 8 mg/kg intraperitonealno(16); fiziološki rastvor je korišten za kontrolne, netretirane miševe. Miševi su žrtvovani intraperitonealnom injekcijom 200 mg/kg rastvora natrijum pentobarbitala u 12,24,36,48 i 72 h, sa n=5 u svakoj vremenskoj tački, a zatimbubregprikupljeno je tkivo i krv. Urin je sakupljen prije žrtvovanja životinja.
Dva miša zabubregeksplantima je injektirano 1 mg/kg LPS svaka 2 dana kako bi se izazvala hroničnabubreg povredakao pozitivna kontrola (21). Svi eksperimenti su izvedeni u skladu sa prethodnim odobrenjem Institucionalne komisije za njegu i korištenje životinja Fakulteta bioloških nauka (CEIBA-2016-034).
Bubregeksplantati. IzbubregBALB/c miševa, kriške tkiva debljine 250-300 um su pripremljene sa Krumdieck rezačem tkiva (Alabama Research and Development, Munford, AL, SAD) na 4 stepena uz konstantan protok pufera Krebs Henseleit bikarbonata (KB) koja je gazirana sa 5 posto CO2. Kriške su sakupljene u KB puferu na 4 stepena.Bubregeksplanti su postavljeni u 12-jažice sa Dulbecco modificiranim Eagleovim medijumom/F12 podlogom sa dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma i 5 posto antibiotika-antifungalnog agensa i inkubirani na 37 stepeni C, sa 5 posto CO i miješanjem na 25 rpm. Eksplanti su tretirani sa 10 ng/ml TNFa (R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD), 20 ng/ml interleukina 1 (IL1; R & D Systems) i 100 ng/ml LPS-a i analizirani na 6, 12 i 24h kasnije.
Urinarni protein. Uzorci urina su prikupljeni u svakoj vremenskoj tački iznad. Koncentracija proteina je izmjerena pomoću DC Protein Assay kita (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija, SAD), a albuminurija je procijenjena elektroforezom natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela i na osnovu veličine trake goveđeg serumskog albumina (16).
Proinflamatorni citokini. Nivoi IL6, IL1 i TNFa mjereni su korištenjem sendvič kitova za imunosorbentne analize (PeproTech, Mexico City, Mexico).
Kvantitativna lančana reakcija polimeraze (qPCR). Ukupna RNK je izolovana iz bubrežnog tkiva upotrebom Trizolw reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) prema uputstvima proizvođača. Jednolančana cDNK je sintetizovana reverznom transkripcijom korišćenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornija, SAD) prema uputstvima proizvođača. PCR u realnom vremenu je izveden korišćenjem 7500 Real-Time PCR sistema (Applied Biosystems) sa TaqMan testovima ekspresije gena. Uporedni PCR testovi u realnom vremenu izvedeni su za svaki uzorak u tri primjerka. Prajmeri za WT1(Wilmov tumor-1 gen) su proslijeđeni:5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3'; obrnuto:5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3';i sonda FAM:5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ;protokol je izveden za 95 stepeni 10 minuta i 40 ciklusa na 94 stepena za 30 s i 64 stepena C za 30 s. Relativni izraz WT1(Wilmov tumor-1 gen) gen je izračunat korištenjem jednačine 2-AACT(23) sa genom za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH) (Applied Biosystems) koji se koristi za normalizaciju.
Ekstrakt cistanche za liječenje bolesti bubrega
Ekspresija mRNA nefrina određena je sa 3 ug cDNK i sljedećim prajmerima: Naprijed: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3'i obrnuto:5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3'na 94 stepena 30 s,60 stepen stepena za 30 s i 72 stepen stepena za 30s za 30 ciklusa (372 bp)(16). Za ekspresiju GAPDH, prajmeri su korišćeni: naprijed:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3', revers:5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3', sa sljedećim reakcionim uslovima: 94 stepena za 40s, 60 stepeni za 30s i 72 stepena za 40s za 35 ciklusa (452 bp). Izraz WT1(Wilmov tumor-1 gen): Naprijed 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCCTTCATGTG-3', obrnuto 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3'na 94 stepena za 40 s, 64 stepena za 30 s i 72 stepena za 30 s za 30 bp). Izraz WT1(Wilmov tumor-1 gen) izoforme KTS± i 17 AA±(F2-R2 prajmeri za detekciju 17 AA plus /-i F3-R3 za otkrivanje KTS plus /-splacing izoforme) izvedeno je konvencionalnim PCR-om prema Oji et. .al.(24). Određivanje ekspresije -aktina izvršeno je prema Lauxet al. (25). Proizvodi su posmatrani korišćenjem elektroforeze 10% poliakrilamidnog gela za KTS±izoformu i 2% agaroznog gela za 17AA±izoformu.
Imunofluorescencija. Thebubreziod miševa tretiranih LPS-om i kontrole su fiksirane u 10 posto formalina i obrađene za bojenje hematoksilinom i eozinom, imunohistohemiju i imunofluorescenciju.
Za određivanje lokacije WT1(Wilmov tumor-1 gen) kod miševa tretiranih LPS-om, korišteni su {{0}}um-deblji dijelovi bubrežnog tkiva postavljeni na mikroskopska stakalca. Uzorci su devoskani, permeabilizirani sa Triton X-100 [0,1 posto Triton sa 1 posto natrijum citrata u fosfatnom puferu (PBS)], i isprani tri puta sa PBS. Tkiva su blokirana sa 20 posto fetalnog goveđeg seruma u PBS-u 30 minuta i inkubirana na 4 stepena preko noći s monoklonskim antitijelima na WT1(Wilmov tumor-1 gen) sc{{0}}(F-6) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, SAD) razrijeđen 1:100 u 10 posto fetalnog goveđeg seruma u PBS. Nakon ispiranja sa PBS, prisustvo vezanog antitijela je identificirano bojenjem kozjim antimišjim IgG Texas Red sc-2979 (Santa Cruz Biotechnology). Slajdovi su obojeni sa 4',6-diamidino-2-fenilindolom. Konačno, dijapozitivi su montirani i kvalitativno ispitani pomoću konfokalnog mikroskopa Olympus BX61W1 sa objektivom za uranjanje u vodu 40× i softverom Fluoview 4.0a (Olympus, Tokio, Japan).
Imunohistohemija. Odrediti fosforilirani (p)-WT1(Wilmov tumor-1 gen) u podocitima miševa tretiranih LPS-om, poliklonska antitijela na p-WT1(Wilmov tumor-1 gen) Korišteni su serin 393,sc-12933 i 363,sc-12934-R (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Slajdovi koji sadrže 4- μm dijelove bubrežnog tkiva su devoskarani i permeabilizirani .Imunohistohemija je obavljena pomoću Universal Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) prema protokolu proizvođača. Stakalca su pregledana pomoću svjetlosnog mikroskopa sa 100× uljnim imersionim objektivom (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Njemačka) .
Western blot. Ukupni protein je izolovan sa 200 ul pufera za lizu (1 posto Triton, 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,6), a koncentracija je izmjerena korištenjem DC Protein Assay kita (Bio-Rad). Protein (50 ug) je odvojen elektroforezom 12% natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela i analiziran western blottingom sa WT1(Wilmov tumor-1 gen) [F6] antitelo sc-7585(Santa Cruz Biotechnology). Uzorci su normalizovani korišćenjem anti-GAPDH (AB2302; Sigma, San Luis, MO, SAD). Proteini su vizualizirani korištenjem Lumi-Light Western Blotting sistema sc-2048 (Santa Cruz Biotechnology).
Prednost cistanchea: štiti bubrege
Rezultati
Indukcija ofbubregoštećenjakod BALB/c miševa pomoću LPS. Dobro je utvrđeno da je povreda podocita povezana sa povećanom proteinurijom. Albumin i ukupni proteini u urinu određeni su elektroforezom natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela i DC Protein Assay kitom (Bio-Rad). Značajno povećanje (p=0.001) albumina u urinu uočeno je 12 h nakon LPS tretmana, sa maksimalnim povećanjem na 24 h (215,87±1,41 ug/ml) u poređenju sa kontrolom (15,53 ±5,0 ug/ml）(Slika 1A) Primećeno je da koncentracija ukupnog proteina u urinu dostiže maksimum na 36 h (26,02±2,43 mg/ml) i bila je značajno viša u poređenju sa kontrolom (p=0.01) kao što je prikazano na slici 1. Oštećenje bubrega izazvano LPS-om je histološki analizirano.24 h nakon tretmana uočen je fokalni glomerulonefritis u bubrežnom tkivu, a najveće oštećenje nađeno je 36 h, povećanje veličine glomerula, sa mezangijalnim 48 h nakon toga uočen je postepeni oporavak glomerula do 72 h, kao što je prikazano na slici 1C.
Slika 1. Uticaj sistemske upale na bubreg.Koncentracije urinarnog albumina (A) i proteina u urinu (B) kao markera oštećenja bubrega kod miševa tretiranih lipopolisaharidom. C: Reprezentativna slika bubrežne histologije miša (bojenje hematoksilinom i eozinom) u različito vrijeme (12,24,36,48 i 72 h) nakon injekcije lipopolisaharida, sa poređenjem modela kronične upale, uvećanje 100×. Značajno drugačije na: *n<><0,0]><0.00>
Proizvodnja proinflamatornih citokina TNFa i IL1 u serumu od miševa tretiranih LPS. Da bi se potvrdilo da je oštećenje bubrega izazvano LPS-om, mjereni su nivoi proinflamatornih citokina pomoću enzimskog imunosorbentnog testa. Povećanje TNFa i I1 je uočeno nakon 12 h (3,6±0,9 ng/ml, 11,9±5ng/ml) i do 36h (4,44±0,1 ng/ml,18 ±0.9 ng/ml) tretmana LPS-om, nakon čega počinje opadati (Slike 2A i B). Ekspresija IL6 je povećana na 12 h (49,5 ng/ml) i 36 h (23,5 ng/ml) nakon tretmana, što je značajno više od kontrole (Slika 2C).
Slika 2. Vremenski tok nivoa proinflamatornih citokina faktor nekroze tumora-alfa (TNFa).(A), interleukin 1 (LL1)(B) i IL6(C) u serumu miševa nakon intraperitonealne primjene lipopolisaharida. Značajno različit na: *p Manje ili jednako 0.05,**p Manje ili jednako 0.01 i ***p Manje ili jednako 0,001 .
Ekspresija WTI gena u tkivu bubrega kod miševa tretiranih LPS. Da bismo odgovorili na naše centralno pitanje da li WT1(Wilmov tumor-1 gen) je moduliran upalnim procesom, a to je imalo efekte na bubrege, ukupna ekspresija WT1(Wilmov tumor-1 gen) određen je u uzorcima bubrega miševa sa sistemskom upalom u različito vrijeme u toku upale. WT1(Wilmov tumor-1 gen) mRNA je bila niža cijelo vrijeme analizirano u odnosu na kontrolu, s najnižom relativnom ekspresijom 36 h, a najvišom 12 h nakon indukcije sistemske upale kao što je prikazano na slici 3A. Osim toga, utvrđeno je da li je tretman LP indukovana modifikacija ekspresije egzona 5(17 AA±) izoforme i KTS± WTI pomoću PCR. Podaci su pokazali da nije došlo do deregulacije ekspresije ovih izoforma jer je uočeno isto ponašanje kao kontrolna grupa bez tretmana tokom sistemskog upalnog procesa izazvanog LPS (Slika 3B). Vestern bloting je pokazao da se protein WT1 smanjuje tokom upalnog procesa, sa blagim oporavkom 36 h nakon tretmana, međutim, količina WT1 je bila manja od one u neliječenoj kontroli (Slike 3C i D).
Slika 3. Utjecaj lipopolisaharida (LPS) na ekspresiju gena Wilms'tumor I (WT1) u tkivu bubrega kod miševa sa sistemskom upalom.A: Relativna ekspresija WTI mRNA.B: Relativna ekspresija izoforma KTS± i 17IAA±WT1.C: Nivoi WTI proteina imunoblotiranjem nakon LPS tretmana i D: Gustoća imunoblotinga za WT1. Značajno različita na:**p Manje od ili jednako 0.01 i ***p Manje ili jednako 0,001,
Fosforilacija i lokalizacija WTI u biopsijama bubrega miševa tretiranih LPS. Važan događaj u posttranslacijskoj modulaciji WTI proteina je fosforilacija aminokiseline 393, koja indukuje premještanje proteina u citoplazmu. Određena je fosforilacija i lokalizacija WT1 u uzorcima bubrega miševa tretiranih LPS-om. Fosforilacija WT1 je analizirana histohemijski, što ukazuje na prisustvo fosforiliranog WT1 u citoplazmi ćelija u dijelovima bubrežnog tkiva počevši 12 h nakon indukcije sistemske upale i održava se do 72 h. WT1 je fosforiliran3639 aminokiselinama kao što je prikazano na slici 4A. Lokacija WT1 proteina je analizirana imunofluorescencijom. Lokacija WT1 u podocitima u uzorcima bubrega miševa tretiranih LPS bila je uglavnom citoplazmatska, dok je u podocitima iz kontrolnih uzoraka lokacija bila nejasna (Slika 4B).
Slika 4. Fosforilacija i lokalizacija Wilmsovog tumora I (WTI) u uzorcima bubrega miševa tretiranih lipopolisaharidom.O: Imunohistohemijsko bojenje za fosforilisani (p)-WTI koje pokazuje povećanje fosforilacije na serinu 393 i 363 počevši od 12 h nakon primene LPS (uvećanje 100× na svetlosnom mikroskopu). B: Lokalizacija WTI imunofluorescencijom u bubregu; primjeri koji pokazuju manju nuklearnu lokalizaciju WT1(kvadrata)36 h nakon primjene lipopolisaharida (uvećanje 40× na konfokalnom mikroskopu).DAP1:4,6-Diamidino{11}}fenilindol.
Modulacija ekspresije WTI i nefrina u bubrezima kod miševa tretiranih LPS. Lokacija WT1 u ćeliji utiče na njenu biološku aktivnost. Prijavljeno je da citoplazmatski WT1 ne ispoljava transkripcionu aktivnost; iz tog razloga, ekspresija WT1 i mRNA nefrina je analizirana PCR-om u uzorcima bubrega miševa tretiranih LPS-om (Slika 5A). PCR je pokazao smanjenje mRNA nefrina sa 24 na 48 h, uz povećanje nakon 72 h (Slika 5B). ), dok se ekspresija WTI mRNA povećala nakon 12 h i nakon toga opala tokom kritičnih sati upale i oštećenja bubrega (24 i 36 h) i (Slika 5B).
Slika 5. Analiza ekspresije mRNA nefrina (NPHS1) i Wilmsovog tumora 1(WT1).O: U analizi ekspresije mRNA, NPHSI i WTI su se smanjili 24,36 i 48 h nakon indukcije sistemske upale upotrebom lipopolisaharida. B: Kvantifikacija traka prikazanih u A denzitometrijom i normaliziranih ekspresijom na gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu.
Eksplantati bubrega tretirani TNFa i IL1 moduliraju ekspresiju WTI i nefrina. Da bi se utvrdilo da li citokini moduliraju ekspresiju WT1, bubrežni eksplanti su kultivisani i tretirani citokinima TNFa i IL1 tokom 6, 12 i 24 sata da bi se analizirala ekspresija WT1 i nefrina pomoću PCR-a. Ekspresija mRNA nefrina je smanjena, a ekspresija mRNA WTI povećana nakon 24 sata kod bubrežnih eksplantata tretiranih TNFa i ILlb (Slika 6).
Slika 6.Analiza ekspresije mRNA nefrina (NPHS1) i Wilmsovog tumora 1 (WT1) u eksplantatu bubrega.A: Nivoi ekspresije mRNA NPHSi i WTI u različito vrijeme kod bubrežnih eksplantata izloženih 10 ng/ml faktora tumorske nekroze-alfa (TNF) i 20 nglml interleukina 16 (IL16)B: Relativna ekspresija dobijena denzitometrijskom analizom signalni proizvod. Trake su kvantificirane normalizacijom na gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu.
Lokalizacija WTI kod bubrežnih eksplantata imunofluorescencijom. Da bi se utvrdilo da li su TNFa i IL odgovorni za promjenu lokalizacije WT1 proteina, eksplantacije bubrega miša su tretirane TNFa i L1 i LPS tokom 24 sata. Kod eksplantata tretiranih sa ILlb i LPS, očigledna je nukleusna/citoplazmatska lokalizacija WTl proteina, a kod eksplantata tretiranih TNFa, uočena je citoplazmatska lokalizacija WT1 proteina; u međuvremenu, u netretiranim kontrolama, uočena je uglavnom nuklearna lokalizacija WT1 (Slika 7).
Slika 7. Lokalizacija Wilmsovog tumora 1(WTI) proteina imunofluorescencijom korištenjem Red TX (WT1) i 4',6-diamidino-2-fenilindola (DAPI)(nukleus) u podocitima iz tretiranih eksplantata bubrega sa l0 ng/ml faktora tumorske nekroze-alfa (TNFa), 20 ng/ml interleukina 16(L1B) i lipopolisaharida (LPS).Smanjena nuklearna lokalizacija WTas prikazana u eksplantatima tretiranim s TNFa u usporedbi s nuklearnom/citoplazmatskom lokalizacijom WTI pod tretmanima IL1 i LPS. Uvećanje, 40×.
