Dio Ⅰ Nedostatak Smad3 poboljšava terapiju dijabetesa i dijabetesne ozljede bubrega zasnovanu na otočićima promicanjem ćelijske proliferacije putem E2F3-zavisnog mehanizma

Abstract

1. Obrazloženje

Slaba proliferacija ćelija jedan je od štetnih faktora koji ometaju terapiju zamjene stanica otočića za pacijente s dijabetesom. Smad3 je važan transkripcijski faktor TGF-signalizacije i pokazalo se da promoviše dijabetes inhibirajući proliferaciju stanica. Stoga pretpostavljamo da otočići s nedostatkom Smad3-a mogu biti nova terapija zamjene ćelija za dijabetes.

2. Metode

Ovu hipotezu smo ispitali kod miševa sa dijabetesom tipa -1 izazvanih streptozocinom i db/db miševa sa dijabetesom tipa -2 presađivanjem otočića Smad3 nokaut (KO) i divljeg tipa (WT) ispod bubrežne kapsule, respektivno. Ispitivani su efekti Smad3KO u odnosu na zamjensku terapiju otočićima WT na dijabetes i dijabetičku ozljedu bubrega. Pored toga, RNA-seq je primijenjen za identifikaciju nizvodnog ciljnog gena koji leži u osnovi Smad3-regulisane proliferacije ćelija u Smad3KO-db/db naspram Smad3WT-db/db mišjih otočića.

3. Rezultati

U poređenju sa terapijom otočićima Smad3WT, liječenje otočićima Smad3KO je proizvelo mnogo bolji terapeutski učinak na dijabetes i tipa -1 i tip-2 jer značajno snižava nivoe glukoze u krvi i HbA1c u serumu i štiti od dijabetičkih ozljeda bubrega sprečavanjem povećanje serumskog kreatinina i razvoj proteinurije, ekspanzija mezangijalnog matriksa i fibroza. Oni su bili povezani sa značajnim povećanjem proliferacije presađenih ćelija i nivoa insulina u krvi, što je rezultiralo poboljšanom netolerancijom na glukozu. Mehanički, RNA-seq je otkrio da u poređenju sa Smad3WT-db/db otočićima miša, delecija Smad3 iz db/db mišjih otočića značajno povećava regulaciju E2F3, ključnog regulatora ulaska G1/S ćelijskog ciklusa. Daljnje studije su otkrile da se Smad3 može vezati za promotor E2F3, i na taj način inhibirati proliferaciju stanica putem mehanizma ovisnog o E2F3- jer je utišavanje E2F3 poništilo proliferativni učinak na Smad3KO ćelije.

4. Zaključak

Nadomjesna terapija s smad3-nedostatkom otočića može značajno poboljšati dijabetes tipa-1 i tip-2 i zaštititi od dijabetesne ozljede bubrega, što je posredovano novim mehanizmom ovisnosti o E2F3- ćelijska proliferacija.

Ključne riječi

Smad3, transplantacija ostrvaca, dijabetes, E2F3, ćelijski ciklus.

Kliknite ovdje da dobijeteCistanche koristi

Uvod

tip -1 i dijabetes melitus 2 (T1DM i T2DM). transplantacija ćelija ili otočića je atraktivna terapija i uspješno se primjenjuje kod pacijenata sa T1DM. Ostrva ili ćelije koje se koriste za transplantaciju obično su od kadaveričnih donora ili indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija (iPSC) [1, 2]. Više od 1500 slučajeva kliničke transplantacije otočića je završeno kod pacijenata sa T1DM prema dobro uspostavljenom Edmontonskom protokolu [1]. Iako oko 50 posto pacijenata drži inzulinsku neovisnost 5 godina nakon transplantacije, neuspjeh presađivanja je čest klinički problem. Jedan od faktora koji ometaju transplantaciju otočića je izuzetno niska stopa proliferacije presađenih stanica otočića [3]. Osim toga, opasni stimulansi iz mikrookruženja grafta kao što su upala, odbacivanje imunološkog alografta i metabolički stres mogu uzrokovati apoptozu i nekrozu presađenih stanica, što rezultira progresivnim gubitkom transplantata [1]. Stoga je poboljšanje proliferacije presađenih stanica ključno za uspjeh liječenja dijabetesa zasnovanog na transplantaciji otočića.

Transformirajući faktor rasta-beta (TGF-) signalizacija igra pleiotropnu ulogu u mnogim biološkim procesima. Transdukcija signala počinje vezivanjem TGF-liganda za njegov tip 2 receptor TGFBR2. Potonji regrutuje i aktivira receptor tipa 1 TGFBR1 fosforilacijom. Aktivirani TGFBR1 dalje fosforiliše receptorom regulisane Smad proteine ​​(R-Smads), Smad2 i Smad3. R-Smadi formiraju kompleks sa Smad4, koji se translocira u jezgro da bi transkripcijski regulisao ciljne gene [4, 5]. Izvještava se da otočić pankreasa održava univerzalno aktiviranu TGF-signalizaciju kao što je otkriveno relativno visokim nivoom fosforiliranog Smad2/3 u fiziološkim uvjetima. Međutim, kao odgovor na potrebu za inzulinom, TGF-signalna aktivnost je smanjena, praćena povećanom proliferacijom ćelija [6]. Pored toga, farmakološka inhibicija TGF-signalizacije promoviše ćelijsku proliferaciju in vitro i in vivo [7, 8]. Što je još važnije, delecija Smad3 rezultira snažnijom ćelijskom proliferacijom u poređenju sa delecijom Smad2 kod miševa sa parcijalnom pankreatektomijom, što ukazuje da je Smad3, ali ne i Smad2, primarni efektor nizvodno od TGF-signalizacije za regulaciju proliferacije ćelije [6]. Kasnije studije pokazuju da Smad3 potiskuje ćelijsku proliferaciju indukujući ekspresiju inhibitora kinaze zavisne od ciklina (CDKI), uključujući p16, p21 i p57 [7, 8].

Naš nedavni rad je također otkrio da brisanje Smad3 kod db/db miševa (Smad3KO-db/db) sprječava nastanak otvorenog dijabetesa bez gojaznosti, hiperglikemije, insulinske rezistencije i intolerancije na glukozu. Zanimljivo je da Smad3KO-db/db miševi pokazuju hiperplaziju otočića sa značajno povećanom proliferacijom stanica i perzistentnom hiperinsulinemijom [9]. To implicira da je Smad3 patogen kod dijabetesa i da ciljanje Smad3 u ćelije može predstavljati novu terapiju zamjene stanica ili otoka za dijabetes. Ovo je ispitano u ovoj studiji korištenjem transplantacije otočića Smad3 knockout (Smad3KO) kod miševa s dijabetesom tipa -1 izazvanog streptozocinom (STZ) i kod miševa s dijabetesom tipa -2 db/db.

Cistanche suplementi

Rezultati

1. Transplantacija otočića Smad3KO dala je bolji terapeutski učinak na dijabetes tipa -1 izazvan STZ

Da bismo uporedili terapijsku efikasnost Smad3KO naspram Smad3WT otočića kod dijabetesa, prvo smo izvršili transplantaciju singenog otočića ispod bubrežne kapsule STZ-induciranih dijabetičkih miševa gdje je hiperglikemija uzrokovana nedostatkom stanica. Miševi sa dijabetesom 7. dana nakon injekcije STZ su presađeni sa 3 doze otočića (50, 100 i 200 otočića po mišu) koji su svježe izolirani od Smad3WT ili Smad3KO miševa. I nasumični nivoi glukoze u krvi (RBG) i nivoa glukoze u krvi natašte (FBG) praćeni su sedmično tokom 16 sedmica. Doze za transplantaciju su odabrane na osnovu prethodnih nalaza da je transplantacija 300 otočića dovoljna za brzo obnavljanje euglikemije kod miševa sa osiromašenim stanicama [10]. Kao što je prikazano na slikama 1A do D, dijabetički miševi s lažnom operacijom razvili su upornu hiperglikemiju tokom 16 sedmica. Transplantacija sa malom dozom (50 otočića) Smad3KO ili WT otočića nije uspjela smanjiti nivoe RBG i FBG. Međutim, miševi dijabetičari koji su primili 100 Smad3KO otočića, ali ne istu dozu Smad3WT otočića, postepeno su povratili normalne RBG i FBG slične onima koji su primali 200 Smad3KO ili WT otočića. Također smo otkrili da se učinak snižavanja glukoze u krvi pripisuje isključivo transplantiranim otočićima jer se hiperglikemija ponovila odmah nakon uklanjanja bubrega koji nosi otočić od 16. tjedna nadalje (strelica, slika 1A).

Poremećena tolerancija glukoze je također razvijena u lažno operiranih dijabetičkih miševa, što je značajno olakšano transplantacijom visoke doze (200) Smad3KO ili WT otočića i 100 Smad3KO otočića, ali ne i niske doze od 50 Smad3KO ili WT otočića i 100 Ostrva Smad3WT (Slika 1E i G). Kao što se očekivalo, STZ-inducirani dijabetički miševi nisu razvili insulinsku rezistenciju.

Nasuprot tome, produženi odgovor na inzulin uočen je kod hiperglikemičnih miševa sa lažnom operacijom ili neefikasnom terapijom sa 50 Smad3WT ili KO otočića i 100 Smad3WT otočića (Slika 1F i H). U skladu s oporavljenom euglikemijom i poboljšanom netolerancijom na glukozu, dijabetički miševi koji su dobili 200 Smad3KO ili WT otočića i 100 Smad3KO otočića, ali ne i 50 Smad3KO ili WT otočića i 100 Smad3WT otočića, pokazali su sniženi nivo inzulina u krvi, povećan nivo Hb1pa1pa u krvi. i J). Nadalje, STZ-inducirani dijabetes uzrokovao je usporavanje rasta, koje je djelomično oporavljeno kod miševa kojima je presađeno 200 Smad3KO ili WT otočića i 100 Smad3KO otočića (Slika S1). Osim toga, STZ-inducirani dijabetički miševi također su razvili dijabetičku nefropatiju u 16. sedmici, što je pokazano mezangijalnom ekspanzijom, intersticijskom fibrozom, proteinurijom i povećanim serumskim kreatininom (Slika 2). Intrigantno, tretman sa 100 Smad3KO otočića, ali ne i 100 Smad3WT otočića, rezultirao je zaštitom od razvoja dijabetesne bolesti bubrega, iako je to također bilo primjetno kod dijabetičkih miševa tretiranih visokom dozom od 200 Smad3KO ili WT otočića (Slika 2). Ovi nalazi pokazuju bolju terapijsku efikasnost Smad3KO otočića na STZ-induciran dijabetes i sugeriraju oko 50 posto smanjenja otočića potrebnih za postizanje kompetentne kontrole glikemije i zaštite od dijabetičke ozljede bubrega primjenom nadomjesne terapije s nedostatkom Smad{34} dijabetes.

2. Transplantacija otočića Smad3KO dala je bolji terapeutski učinak na dijabetes tipa -2 kod db/db miševa

Prijavljeno je da transplantacija otočića poboljšava T2DM u modelu miša koji je hranjen dijetom s visokim udjelom masti i koji je izazvan niskom dozom STZ [11]. Zatim smo istražili da li transplantacija Smad3KO otočića također proizvodi bolji terapeutski učinak na T2DM tretiranjem db/db miševa sa 250 Smad3KO ili WT otočića od preddijabetičke dobi od 4 do 12 sedmice. Otkrili smo da transplantacija sa Smad3KO ili WT otočići nisu uticali na rast db/db miševa primatelja (Slika S2). Iako su db/db miševi koji su primili transplantaciju Smad3WT otočića pokazali trend smanjenja RBG i FBG u usporedbi s lažno operiranim db/db miševima, db/db miševi transplantirani s ekvivalentnom dozom Smad3KO otočića pokazali su značajno smanjenje RBG i FBG (Slika 3A i B). Intolerancija na glukozu razvijena kod db/db miševa značajno je poboljšana Smad3KO, ali ne i Smad3WT transplantacijom otočića, iako rezistencija na inzulin nije izmijenjena (Slika 3C-F). Konzistentno, u poređenju sa transplantacijom otočića Smad3WT ili lažnom operacijom, db/db miševi liječeni transplantacijom Smad3KO otočića također su pokazali značajno smanjenje nivoa HbA1c u krvi, što je bilo praćeno značajnim povećanjem nivoa inzulina u krvi (Slika 3G i H). Nadalje, tretman sa 250 Smad3KO otočića značajno je oslabio glomerularnu mezangijalnu ekspanziju (Slika 4). Međutim, budući da kod db/db miševa u dobi od 12 tjedana nisu zabilježene značajne promjene u serumskom kreatininu, proteinuriji i bubrežnoj fibrozi, nisu nađene očigledne promjene u ovim parametrima kod db/db miševa tretiranih Smad3KO ili WT otočićima (Slika 4). Zbirno, ovi podaci ponovo ukazuju da transplantacija Smad3KO otočića proizvodi bolji tretman u odnosu na Smad3WT otočiće kod miševa s dijabetesom tipa -2 db/db.

3. Nedostatak Smad3 podstiče proliferaciju ćelija u kalemljenim otočićima i kod STZ-indukovanih dijabetičkih miševa i kod db/db miševa.

Zatim smo istražili potencijalne mehanizme pomoću kojih transplantacija Smad3KO otočića proizvodi bolji terapeutski učinak i na T1DM i T2DM. Prvo smo ispitali ćelijsku masu u presađenim otočićima imunološkim bojenjem inzulinom. U STZ-induciranom dijabetesu, nismo uspjeli otkriti postojanje inzulinsko pozitivnih stanica ispod bubrežne kapsule kod miševa sa 50 Smad3KO ili WT otočića u 16. sedmici nakon transplantacije, što ukazuje na gubitak stanica. Neočekivano, dijabetički miševi koji su primali 100 Smad3WT otočića pokazali su samo nekoliko dispergiranih klastera stanica koje proizvode inzulin, ali je to u velikoj mjeri povećano kod dijabetičkih miševa tretiranih sa 100 Smad3KO otočića, što je rezultiralo skoro 17-putostrukim povećanjem ćelijske mase (Slika 5A i B). Zanimljivo je da su dijabetički miševi kojima je data visoka doza od 200 Smad3KO ili WT otočića pokazali sličnu ćelijsku masu (Slike 5A i B). Ovi nalazi su bili u skladu s dozno-ovisnim učinkom transplantacije otočića na hiperglikemiju kao što je prikazano na slikama 1A i B.

Zatim smo istražili da li je povećana ćelijska masa u transplantatu otočića Smad3KO povezana s pojačanom proliferacijom stanica. Dvobojna imunofluorescencija je pokazala da su u 16. sedmici nakon transplantacije otočića, miševi tretirani sa 100 Smad3WT otočića pokazali neotkrivene ili rijetke PCNA plus inzulin plus ćelije, što je prvenstveno povećano kod onih koji su primali 100 Smad3KO otočića ili visoku dozu od 200 WT otočića. otočića (Slika 5C i D). Zatim smo istražili da li Smad3 kontrolira ranu proliferaciju stanica u cijepljenim otočićima pod progresivnim dijabetičkim stanjima označavanjem BrdU 7. dana nakon transplantacije otočića kada je nivo glukoze u krvi ostao visok. Obilježavanje BrdU otkrilo je 3-putostruko povećanje BrdU plus inzulina plus ćelija u 100 graftova Smad3KO otočića u poređenju sa istom dozom Smad3WT otočića (Slike 5E i F). Ovaj nalaz ukazuje da nedostatak Smad3 u velikoj mjeri promoviše proliferaciju stanica kroz ćelijski ciklus S-faze u hiperglikemijskim uslovima, doprinoseći 17-putu porastu ćelijske mase kao što se vidi u sedmici 16 nakon transplantacije otočića (Slike 5A i B) . Uzeti zajedno, svi ovi nalazi ukazuju na to da nedostatak Smad3 u velikoj mjeri potiče proliferaciju ćelija, čime se obnavlja euglikemija kod STZ-induciranog dijabetesa tipa-1.

Slično tome, visoke ćelijske proliferativne aktivnosti su također otkrivene u transplantatu otočića Smad3KO kod dijabetičkih db/db miševa tipa -2, što je prikazano 5-putostrukim povećanjem ćelijske mase u poređenju sa onima sa graftom otočića Smad3WT na starosti 12 sedmica nakon transplantacije otočića (Slike 6A i B), što je bilo povezano sa 25-strukim povećanjem insulina plus PCNA plus ćelija (Slike 6C i D). Koristeći BrdU-obilježavanje, također smo otkrili 3-putostruko povećanje insulina plus BrdU plus ćelija u transplantatu otočića Smad3KO 7. dana nakon transplantacije kod 12-nedjeljnih db/db miševa (Slika 6E i F). Ovo otkriće još jednom potvrđuje da su ćelije kojima nedostaje Smad3 otporne na hiperglikemiju i da ostaju visoko proliferativne kako bi održale ćelijsku masu i poboljšale T2DM.

4. Nedostatak Smad3 potiče proliferaciju ćelija in vitro

Prijavljeno je da farmakološka inhibicija TGFBR1 potiče proliferaciju ćelija in vitro [7, 8]. Stoga smo istražili da li genetska delecija Smad3 također potiče proliferaciju stanica kultiviranjem Smad3KO i WT stanica otočića nakon čega slijedi označavanje BrdU. Dvostruka imunofluorescencija je pokazala da ćelije otočića kojima nedostaje Smad3 pokazuju značajno viši nivo BrdU-pozitivnih ćelija (5,7 posto) u poređenju sa stanicama otočića Smad3WT (2,4 posto) (Slike 7A i B). Povećana proliferacija Smad3KO ćelija takođe je demonstrirana povećanom ekspresijom PCNA kao što je otkriveno Western blot analizom (Slika 7C), potvrđujući ključnu regulatornu ulogu Smad3 u proliferaciji ćelija.

5. RNA-seq identificira E2F3 kao Smad3 ciljni gen koji regulira proliferaciju stanica

Da bismo otkrili nizvodni mehanizam Smad3 u regulaciji proliferacije stanica, izveli smo RNA-seq u otočićima izoliranim od db/m ili db/db miševa sa ili bez delecije Smad3 gena uključujući Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT -db/m, i Smad3KO-db/m miševi kao što je prethodno opisano [9]. Analiza obogaćivanja puta je provedena među diferencijalno eksprimiranim genima (DEG) između Smad3WT i Smad3KO otočića u db/m ili db/db pozadini. U genetskoj pozadini db/db, Smad3KO je rezultirao značajnim promjenama u genima ili putevima vezanim za ćelijski ciklus, što je otkriveno GO i KEGG analizom (Slika 8A i Slika S3). Uzimajući u obzir pojedinačne gene, RNA-seq analiza otkrila je povećanje ekspresije gena koji uključuju ciklin, ciklin zavisne kinaze (CDK) i porodicu proteina ciklusa ćelijske podjele (CDC) u Smad3KO-db/db otočićima u poređenju sa Smad3WT-db /db otočića, što je dalje potvrđeno u kultiviranim ćelijama otočića Smad3KO pomoću RT-PCR (Slika S4 A i C). Nasuprot tome, u genetskoj pozadini db/m, Smad3KO nije izazvao značajan uticaj na gene ili puteve vezane za ćelijski ciklus (Slike S3B i C). Prijavljeno je da TGF-/Smad3 signalizacija negativno reguliše ćelijski ciklus indukcijom gena inhibitora kinaze zavisnih od ciklina (CDKI) [7, 8, 12]. Iznenađujuće, nijedna ekspresija ovih CDKI gena nije bila potisnuta u Smad3KO-db/db otočićima in vivo i kultiviranim Smad3KO stanicama otočića kao što je otkriveno RNA-seq i RT-PCR, respektivno (Slika S4B i C). Nasuprot tome, nivoi ekspresije nekoliko CDKI gena kao što su p16, p18 i p57 bili su čak i povećani u kultivisanim ćelijama otočića Smad3KO (slika S4C). Ovo implicira da postoji alternativni mehanizam u Smad3-regulisanoj proliferaciji ćelija.

Stoga smo analizirali potencijal vezivanja Smad3 za promotorske sekvence 224 DEG u GO terminu ćelijskog ciklusa pomoću softvera ECR pretraživača (Slika 8A). Među njima, jedan gen po imenu E2F3 privukao je našu pažnju jer je ključ i terminalni izvršilac koji reguliše G1/S ulazak u ćelijski ciklus [13, 14]. Pronašli smo potencijalno mjesto vezivanja Smad3 u promotoru mišjeg E2F3 lokusa koji je također sačuvan kod ljudi (Slika 8B).

Cistanche tubulosa

Da bismo istražili je li E2F3 bitan za Smad3-regulisanu proliferaciju ćelija, ispitali smo povezanost između E2F3 i Smad3 u otočićima. U skladu s RNA-seq, imunohistohemija je otkrila da je ekspresija E2F3 u velikoj mjeri smanjena na otočićima Smad3WT-db/db miševa, ali da je značajno povećana kod Smad3KO-db/db miševa (slika 8C). Nadalje, povećana ekspresija E2F3 je također primijećena u kultivisanim ćelijama otočića Smad3KO na nivou RNK i proteina (Slika 8 DF). Nasuprot tome, adenovirusom posredovana tišina E2F3 poništila je proliferativnu aktivnost ćelija (insulin^plusBrdU^plus) u ćelijama otočića Smad3KO (Slika 9), otkrivajući suštinsku ulogu E2F3 u Smad3-reguliranoj proliferaciji ćelija.

Da bismo dalje potvrdili predviđeno vezivanje Smad3 u E2F3 promotoru, izvršili smo imunoprecipitaciju hromatina (ChIP) u izolovanim mišjim otočićima (slika 10A). Specifičnost Smad3 antitela korišćenog za ChIP prvobitno je potvrđena imunoprecipitacijom u mišjim ostrvcima (Slika 10B). ChIP PCR je potvrdio vezivanje Smad3 za E2F3 promotor kao anti-Smad3 antitijela, ali nijedan nespecifični IgG izotip nije uspješno precipitirao hromatinski fragment koji odgovara E2F3 promotoru (slika 10C). Kvantitativni RT-PCR otkrio je 6-struko obogaćivanje sekvence promotora E2F3 u ChIP testu sa Smad3 antitijelom u poređenju sa IgG izotipom (slika 10D), pokazujući da se Smad3 može vezati za promotorsku regiju genomskog lokusa E2F3 .

Da bismo potvrdili funkcionalni značaj vezivanja Smad3 na promotoru E2F3, konstruisali smo reporterski vektor luciferaze koji je pokretao mišji E2F3 promotor koji sadrži mesto vezivanja Smad3 ili njegov mutantni oblik (Slika 10E). Analiza dvostruke luciferaze u ćelijama HEK293T otkrila je robusnu transkripciju luciferaze koju pokreće klonirani promotor E2F3, koja je bila značajno inhibirana prekomjernom ekspresijom Smad3. Međutim, mutacija na mestu vezivanja Smad3 poništila je inhibitorni efekat Smad3 (slika 10F). Ovi nalazi dali su direktan dokaz za supresivnu ulogu Smad3 u transkripciji E2F3 vezivanjem za njegov promoter.

U ovoj studiji smo pokazali da je transplantacija otočića s nedostatkom Smad3- proizvela bolji terapeutski učinak na dijabetes i dijabetičku ozljedu bubrega kod STZ-indukovanih dijabetičkih miševa i db/db miševa. Kod dijabetesa izazvanog STZ, transplantacija 100 Smad3KO, ali ne i 100 Smad3WT otočića, rezultirala je 17-putostrukim povećanjem ćelijske mase, što je bilo povezano sa značajnim povećanjem nivoa insulina u krvi i time poboljšalo netoleranciju na glukozu i oporavilo euglikemiju, što je rezultiralo u zaštiti od dijabetesne ozljede bubrega.

Slični rezultati su također pronađeni kod T2DM kod db/db miševa kod kojih je transplantacija sa 250 Smad3KO otočića, ali ne i ista doza Smad3WT otočića, također povećala 5-putanu ćelijsku masu i dovela do bolje kontrole glikemije. Ovi nalazi upućuju na to da je nedostatak Smad3 otporan na dijabetičko mikrookruženje i u velikoj mjeri promovira ekspanziju presađenih stanica otočića i proizvodnju inzulina kako bi pokazao bolju kontrolu glikemije. Zanimljivo je da smo također otkrili da liječenje sa 100 Smad3KO otočića može proizvesti jednaku kontrolu glikemije kao korištenje 200 Smad3WT ili KO otočića kod STZ-induciranog dijabetesa. Ovo zapažanje sugerira da bi nedostatak Smad3 mogao u velikoj mjeri smanjiti (najmanje 50 posto) broj otočića potrebnih za uspješno uspostavljanje nezavisnosti od insulina u terapiji zamene ćelija otočića za T1DM. Ovi nalazi su u skladu s prethodnim izvještajem da predtretman otočića sa SB-431542, inhibitorom TGFBR1, promovira proliferaciju i funkciju ćelija nakon transplantacije [15]. Međutim, kako Smad2 također igra bitnu ulogu u oslobađanju inzulina stimuliranog glukozom u stanicama [16], ciljanje na Smad3, ali ne uzvodno na TGFBR1 u otočićima (ćelijama) može biti povoljnije za liječenje dijabetesa zamjenom stanica. Stoga, transplantacija otočića s nedostatkom Smad3- može klinički predstavljati novu terapiju i za T1DM i za T2DM. Osim toga, liječenje otočićima Smad3KO može također zaštititi od dijabetesne ozljede bubrega u 16 sedmici T1DM, iako to nije duboko u T2DM zbog minimalne dijabetesne ozljede bubrega koja se javlja kod db/db miševa u dobi od 12. sedmice.

Mehanički, otkrili smo da Smad3 funkcionira tako što potiskuje E2F3 kako bi inhibirao proliferaciju stanica. Ovo je potkrijepljeno dokazima da E2F3 promotor sadrži funkcionalno mjesto vezivanja Smad3, što je potvrđeno ChIP i testom reportera luciferaze. Ćelije otočića kojima nedostaje Smad3 pokazale su pojačanu proliferaciju u mehanizmu ovisnom o E2F3- jer je nokdaun E2F3 ukinuo ovu pro-proliferativnu aktivnost. E2F3 pripada porodici E2F i kritična je komponenta Rb-E2F mašinerije koja upravlja ulaskom G1/S ćelijskog ciklusa [13]. E2F su faktori transkripcije i konačni izvršioci za regulaciju gena koji orkestriraju napredak ćelijskog ciklusa [14]. Dokazano je da prekomjerna ekspresija E2F3 potiče proliferaciju stanica u otočićima glodara i ljudi [17]. Nalazi da Smad3 transkripcijski cilja na E2F3 da potisne ćelijski ciklus u ćelijama pružaju novi regulatorni mehanizam za proliferaciju ćelija. Prema tome, poremećaj Smad3 u stanicama otočića potiče proliferaciju stanica zavisnu od E2F3-, što je pokazano značajnim povećanjem PCNA plus ili BrdU plus ćelija koje proizvode inzulin, što sugerira da je tretman subterapeutskom dozom Smad3KO otočića dovoljan za proširenje stanice mase i inhibira i T1DM kod miševa izazvanih STZ i T2DM kod db/db miševa.

Herba CistancheiEkstrakt Cistanche

Prijavljeno je da TGF-signalizacija igra kritičnu ulogu u razvoju i funkciji ćelija otočića pankreasa, zaustavlja ćelijski ciklus i uzrokuje ćelijsku apoptozu indukcijom CDKI [7, 8, 18]. Na naše iznenađenje, i in vivo i in vitro eksperimenti su otkrili da transkripcija CDKI nije promijenjena ili čak povećana na otočićima Smad3KO (slika S4). Ovo odstupanje se može pripisati različitim eksperimentalnim uslovima. Rezultati u trenutnoj studiji izvedeni su od Smad3KO miševa (otočića). Međutim, prethodne studije su zasnovane na farmakološkoj inhibiciji TGFBR1, koja će uticati na celokupnu TGF-signalizaciju [7, 8]. Nadalje, korišteni su uzorci otočića mladih odraslih miševa (starosti od 8-10 sedmica), dok su u prethodnim studijama korišteni otočići relativno starih životinja ili kadaveričnih donora starijih ljudi [7, 8]. Kako ćelije otočića pokazuju akumulaciju CDKI-ja vezanu za starenje [19], CDKI-ovi u ostarjelim stanicama mogu biti osjetljiviji na inhibiciju TGF-signalizacije.

U ovoj studiji bilo je nekoliko ograničenja. Prvo, efikasnost transplantacije otočića istražena je na STZ-induciranom modelu dijabetičkog miša bez autoimune reakcije. Stoga, prednost Smad3KO u odnosu na Smad3WT terapiju otočićima za dijabetes također treba provjeriti u autentičnom T1DM modelu u budućnosti. Drugo, nalazi iz ove studije zasnovani su na terapiji Smad3KO ćelijama za cijelo otočiće, ali ne i za ćeliju. Nejasno je da li bi tipovi ćelija, osim ćelija na otočiću, izvršili ulogu zavisnu od Smada3- da moduliraju ćelijsku proliferaciju putem međućelijskih unakrsnih puteva. Stoga su opravdane daljnje studije sa Smad3KO specifičnim za ćelije. Nadalje, nalaze iz ove studije potrebno je provjeriti u uzorcima ljudskih otočića kako bi se dokazao njihov klinički značaj.

Reference

1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinička transplantacija otoka pankreasa. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.

2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Diferencijacija ljudskih pluripotentnih matičnih stanica do funkcionalnih stanica pankreasa za terapije dijabetesa: inovacije, izazovi i budući pravci. J Biol Eng. 2017; 11:21.

3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Histološka procjena grafta nakon kliničke transplantacije otočića. Transplantacija. 2009; 88: 1286-93.

4. Lan HY. Različite uloge TGF-beta/Smads u bubrežnoj fibrozi i upali. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.

5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. TGF-beta/Smad signalizacija kod renalne fibroze. Front Physiol. 2015; 6: 82.

6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Smad signalna mreža regulira proliferaciju stanica otočića. Dijabetes. 2014; 63: 224-36.

7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibicija TGF-beta signalizacije promovira humanu replikaciju beta-ćelija pankreasa. Dijabetes. 2016; 65: 1208-18.

8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanić V, et al. Kombinovana inhibicija puteva DYRK1A, SMAD i tritoraksa sinergije da izazove robusnu replikaciju u odraslim ljudskim beta ćelijama. Cell Metab. 2019; 29: 638-52 e5.

9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, et al. Nedostatak Smad3 potiče proliferaciju i funkciju beta ćelija kod db/db miševa kroz obnavljanje ekspresije Pax6. Theranostics. 2021; 11: 2845-59.

10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Metoda za izolaciju mišjih otočića i subkapsularnu transplantaciju bubrega. J Vis Exp. 2011.

11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. Transplantacija izotransplantata otočića poboljšava osjetljivost na inzulin u mišjem modelu dijabetesa tipa 2. Endokrine. 2021; 72: 660-71.

12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Indukcija p16ink4a i p19ARF od strane TGFbeta1 doprinosi zaustavljanju rasta i odgovoru na starenje u keratinocitima miša. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.

13. Dyer MA, Cepko CL. Regulacija proliferacije tokom razvoja retine. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.

14. Dyson N. Regulacija E2F proteinima iz porodice pRB. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.

15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Prolazna supresija signalizacije TGFbeta receptora olakšava transplantaciju ljudskih ostrvaca. Endokrinologija. 2016; 157: 1348-56.

16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Poremećaj SMAD2 u beta ćelijama pankreasa miša dovodi do hiperplazije otočića i poremećene sekrecije inzulina zbog slabljenja aktivnosti K plus kanala osjetljivog na ATP. Diabetologia. 2014; 57: 157-66.

17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P, et al. Prekomjerna ekspresija E2F3 potiče proliferaciju funkcionalnih ljudskih beta stanica bez indukcije apoptoze. Cell Cycle. 2013; 12: 2691-702.

18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. TGF-beta porodična signalizacija u kontroli proliferacije i preživljavanja ćelija. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.

19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Dijabetes melitus--napredak i izazovi u proliferaciji ljudskih beta-ćelija. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.

20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Ciljano narušavanje SMAD3 dovodi do oslabljenog imuniteta sluzokože i smanjene reakcije T-ćelija na TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.

21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Protokol za izolaciju otočića iz mišje pankreasa. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.

22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Transplantacija otočića pankreasa u kapsulu bubrega dijabetičkih miševa. J Vis Exp. 2007: 404.

23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, et al. Brisanje Smad3 sprečava fibrozu i upalu bubrega kod dijabetičke nefropatije tipa 2. Metabolizam. 2020; 103: 154013.

Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 i Hui-Yao Lan2,7

1 Istraživački centar za integriranu medicinu i odjel za nefrologiju, pridružena bolnica tradicionalne kineske medicine Jugozapadnog medicinskog univerziteta, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.

2. Odsjek za medicinu i terapiju, i Institut zdravstvenih nauka Li Ka Shing, Kineski univerzitet u Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Kina.

3. Zajednička laboratorija Guangdong-Hong Kong za imunološke i genetske bolesti bubrega, Narodna bolnica provincije Guangdong, Akademija medicinskih nauka Guangdong, Guangdžou, Guangdong, 510080, Kina.

4. Državna ključna laboratorija bioelektronike, ključna laboratorija Jiangsu za biomaterijale i uređaje, Škola bioloških nauka i medicinskog inženjerstva, Jugoistočni univerzitet, Nanjing, Kina.

5. Ključna laboratorija za prevenciju i upravljanje hroničnom bubrežnom bolešću grada Zhanjiang, Institut za nefrologiju, pridružena bolnica Medicinskog univerziteta Guangdong, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Kina.

6. Nacionalna baza za klinička istraživanja tradicionalne kineske medicine, pridružena bolnica tradicionalne kineske medicine Jugozapadnog medicinskog univerziteta, Luzhou, Sichuan, 646000, Kina.

7. Zajednička istraživačka laboratorija za imunološke i genetske bolesti bubrega CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital, Kineski univerzitet u Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Kina.