DIOⅠ: Novi zaštitni efekti ekstrakta Cistanche Tubulosa protiv degenerativne retinopatije izazvane plavim svjetlom niske osvjetljenja

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Man-Ru Wu Cheng-Hui Lin Jau-Der Hob George Hsiao, Yu-Wen Cheng

Farmaceutski fakultet, Farmaceutski fakultet, Medicinski univerzitet Taipei, Tajpej, Odsjek za oftalmologiju, Taipei Medical University, Taipei, Odsjek za farmakologiju, Medicinski fakultet, Medicinski fakultet, Taipei Medical University, Taipei, Diplomski institut medicinskih nauka, College of Medicina, Taipei Medical University, Taipei, Ph.D. Program istraživanja i razvoja biotehnologije, Farmaceutski fakultet, Taipei Medical University, Taipei, Tajvan

Abstract

Pozadina/ciljevi:Fototoksičnost izazvana plavom diodom koja emituje diode (BLL) igra važnu ulogu u očnim bolestima i uzrokuje degeneraciju retine i apoptozu u stanicama pigmentnog epitela retine (RPE) kod ljudi.Ekstrakt Cistanche tubulosa (CTE)je tradicionalna kineska medicina sa mnogim korisnim zaštitnim svojstvima; međutim, nekoliko studija je ispitivalo okularnu zaštitnu ulogu CTE. U ovoj studiji smo istraživali mehanizme koji su u osnovi efekata CTE na apoptozu izazvanu BLL in vitro i in vivo. Metode: RPE ćelije su primijenjene u trenutnoj in vitro studiji i vitalnost ćelija je određena pomoću 3-(4,5-dimetiltiazol- 2-il)-2,{{6} }difeniltetrazolijum bromid test. Ekspresija proteina povezana sa apoptozom određena je Western blot analizom i imunofluorescentnim bojenjem. Smeđi norveški pacovi korišteni su za ispitivanje izloženosti komercijalno dostupnom BLL in vivo. Bojenje hematoksilinom i eozinom, terminalno označavanje deoksinukleotidil transferaze dUTP nick end labeling (TUNEL) i western blot testovi korišteni su za ispitivanje morfološke deformacije retine. Rezultati: CTE je značajno inhibirao oštećenje RPE izazvano hidrogen peroksidom, tertbutil hidroperoksidom, natrijum azidom i BLL. Nadalje, CTE je smanjio ekspresiju apoptotičkih markera kao što je cijepana kaspaza-3 i TUNEL bojenje nakon izlaganja BLL-u inaktivacijom apoptotičkih puteva, kao što je prikazano putem imunofluorescentnog bojenja. Pored toga, CTE je inhibirao BLL-indukovanu fosforilaciju c-Jun N-terminalne kinaze, ekstra kinaze povezane sa signalom 1/2 i p38 u RPE ćelijama. In vivo, oralna primjena CTE spasila je periodično smanjenje debljine retine izazvano 60-dnevnim izlaganjem BLL-u i smanjilo broj TUNEL-pozitivnih ćelija u modelu smeđeg norveškog štakora. Zaključak: CTE je potencijalno profilaktičko sredstvo protiv fototoksičnosti izazvane BLL

Cistanche tubulosa

Uvod

Studije o starosnoj makularnoj degeneraciji (AMD) objavile su da 8,7 posto svjetske populacije pati od ove bolesti [1]. AMD je neurodegenerativna bolest koja uzrokuje deformaciju fotoreceptora, atrofiju pigmentnog epitela retine (RPE), apoptozu ganglijskih stanica i gubitak centralnog vida u starijoj populaciji, te postaje globalni društveni teret. AMD se klasificira u suhu ili vlažnu formu [2, 3]. Poboljšanja u tehnologiji dovela su do toga da ljudi provode više vremena koristeći moderne digitalne uređaje, a samim tim ljudi su izloženi zračenju plave svjetlosti (BL) tokom dugih perioda. Međutim, pitanje fototoksičnosti izazvane BL u retini nije dobro istraženo. Prekomjerno izlaganje kratkovalnoj BL (450-495 nm) rezultira stvaranjem reaktivnih vrsta kisika (ROS), kao što su superoksid i hidroksilni radikali, koji uzrokuju povećanje potrošnje kisika i induciraju oštećenje mitohondrijske DNK. Akumulacija ROS dovodi do oksidativnog stresa i ekstenzivne akumulacije retinoidnih adukata, koji dodatno oštećuju mrežnicu [4]. Istraživanja su pokazala da je oksidativni stres vodeći faktor u patogenezi suhe AMD [5]. Nadalje, BL zračenje smanjuje ekspresiju retinalnih antioksidativnih enzima, kao što su superoksid dismutaza i katalaza, posredovanjem interakcija Bax/Bcl-2 proteina i promicanjem endogene proizvodnje ROS. Kao takve, RPE ćelije i mitohondrije spoljašnjeg segmenta fotoreceptora pate od povrede izazvane BL zračenjem [6, 7]. Osim stvaranja ROS, BL zračenje aktivira protein kinaze aktivirane mitogenom (MAPK), koje igraju važnu ulogu u preživljavanju stanica i apoptozi. Pro-apoptotski proteini povezani s apoptozom, kao što su Bax i kaspaza-3, aktiviraju se zračenjem diode koja emituje BL (BLL) preko c-Jun N-terminalne kinaze (JNK) i p38 puteva u RPE i ganglijske ćelije retine [8]. Štaviše, fosfatidilinozitol 3-kinaza (PI3K)/Akt i nuklearni faktor eritroid 2--zavisni od faktora 2 (Nrf2) antioksidativni putevi su komponente odbrambenog sistema RPE ćelija [{{34} }].

Ekstrakt Cistanche tubulosa (CTE)sadrži derivate feniletanoidnih glikozida i koristi se kao tradicionalna kineska medicina decenijama. Ehinakozid, akteozid i izoakteozid su tri glavna aktivna jedinjenja CTE-a za koje je okarakterisano da imaju neuroprotektivna svojstva, poboljšavaju pamćenje, regulišu imunitet i imaju svojstva protiv fibroze jetre [13, 14]. Ehinakozid je čistač ROS i štiti od apoptoze izazvane 1-metil-4-fenilpiridinijum jonom (MPP plus ) u životinjskim modelima Parkinsonove bolesti [15, 16]. Acteoside štiti od neurotoksičnosti izazvane amiloidom- - i smanjuje upalu stimuliranu lipopolisaharidom, koja se može pripisati translokaciji Nrf2 iz citoplazme u jezgro i vezivanju za elemente antioksidativnog odgovora. Trenutne dostupne terapije za vlažnu AMD, kao što su pegaptanib, ranibizumab, bevacizumab i aflibercept, koriste se za inhibiciju prekomjerne angiogeneze [17, 18]. Međutim, ne postoji efikasan tretman za suhu AMD, zbog višestrukih patoloških komplikacija ove bolesti.

U ovoj studiji demonstriramo zaštitne efekte CTE u RPE ćelijama i Brown Norway (BN) štakorima. Osim toga, primijenili smo dugotrajnu BLL izloženost niske luminante i na in vitro i in vivo modele kako bismo procijenili zaštitne efekte CTE. Otkrili smo da je CTE smanjio ekspresiju proteina povezanih s apoptozom nakon izlaganja BLL. Štaviše, CTE je smanjio broj terminalnih ćelija deoksinukleotidil transferaze dUTP nick end labeling (TUNEL) - pozitivnih ćelija u retini BN pacova nakon dugotrajnog izlaganja BLL niske luminancije. Ova studija pruža daljnji uvid u nove anti-apoptotičke efekte CTE-a i informacije o novoj strategiji za liječenje degeneracije mrežnice.

Ekstrakt Cistanche tubulosa (CTE): feniletanoidni glikozid

Materijali i metode

Hemikalije i proizvodi

CTE je velikodušno obezbijedila Sinphar Pharmaceutical Company (Yilan, Tajvan). Kompleti za otkrivanje smrti ćelije in situ (kat. br. 11-684-817-910) su kupljeni od Rochea (Mannheim, Njemačka).

RPE ćelijska kultura

RPE ćelije (ARPE{{0}} i ATCC® CRL-2302™) kupljene su od Američke kolekcije tipskih kultura (Manassas, VA) i uzgajane u Dulbeccovoj modificiranoj Eagle's mediju (Gibco, Grand Island, NY) dopunjen sa 10 posto fetalnog goveđeg seruma u vlažnoj atmosferi od 5 posto CO2 na 37 stepeni. ARPE-19 ćelije na prolazu 19–30 su održavane na posudama za kulturu ćelija 10-cm (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, Belgija). Nakon pasiranja sa 0,05 posto tripsin-etilendiamin tetrasirćetne kiseline (Gibco), ćelije su zamijenjene u omjeru 1:4. Prije testiranja, ARPE-19 ćelije su zasijane na 48-ploče (Orange Scientific) za analizu vitalnosti ćelija pri gustini od 1,0 × 105 ćelija/mL i na posude od 6-cm (Orange Scientific ) za Western blotting analize pri gustini od 2,0 × 105 ćelija/mL tokom 24 h. Nakon što su ARPE-19 ćelije dostigle 80 posto konfluentnosti, izvedeni su sljedeći eksperimenti.

Liječenje lijekovima i analiza vitalnosti stanica

RPE ćelije na prolazu 19-30 su posađene na 48- ploče i zajedno tretirane 24 h različitim koncentracijama CTE, vodikovog peroksida (H2O2), terc-butil hidroperoksida (t-BHP) i natrijum azida ( NaN3). Ćelije su potom uzgajane sa 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolijum bromidom (MTT) u konačnoj koncentraciji od 1 mg /mL i inkubirano 30 min. Dimetil sulfoksid (200 µL) je zatim dodan u svaku jažicu da se ćelije rastvore. Apsorpcija je izmjerena na 570 nm korištenjem Sunrise™ spektrofotometarskog čitača za enzimski imunosorbentni test (MRX-TC; Dynex Technologies, Chantilly, VA). Vrijednosti su korigovane za apsorpciju pozadine oduzimanjem odgovarajućih praznina. Podaci su iz pet nezavisnih testova.

Protokol izlaganja in vitro BL

Izvor svjetlosti i ćelijske ploče su postavljene na udaljenosti od 25 cm, kao što je opisano u našoj prethodnoj studiji [19]. Osvetljenost je mjerena svjetlomjerom (LM-81LX; Lutron Electronic Enterprise, Tajpej, Tajvan). BLL je dostigao maksimum na 460 nm (60 luksa) za naznačeno vrijeme (0–48 h), u zavisnosti od eksperimentalnog dizajna.

Western blotting

Nakon 0–48- h zajedničkog tretmana sa izlaganjem CTE i BLL, ćelije su dva puta isprane ledeno hladnim fosfatnim puferom (PBS) i resuspendirane u puferu za lizu radioimunoprecipitacije (1 posto Nonidet P-40, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM Na3VO4, 1 mM etilen glikol-bis (-aminoetileter)-N,N,N′,N′-tetraoctena kiselina, 1 mM NaF i koktel inhibitora proteaze/fosfataze). Ćelijski lizat je dobijen centrifugiranjem na 12, 000 × g tokom 35 minuta, a supernatant je sakupljen za određivanje koncentracije proteina putem Bradfordovog reagensa (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Jednake količine uzoraka proteina razdvojene su elektroforezom 10-12 posto natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnog gela i zatim prebačene na poliviniliden difluoridnu membranu. Nakon što je membrana blokirana sa 5 posto nemasnog mlijeka i inkubirana u Tris puferiranoj fiziološkoj otopini sa Tween 20 (TBST) 1 h, izvršeno je imunoblotiranje s primarnim antitijelima specifičnim za cijepanu kaspazu-3, fosfo-JNK, JNK , fosfo-p38, p38, fosfo-ekstracelularna signalna kinaza (ERK), ERK, Bcl-2, Bax, Fas-povezani protein sa domenom smrti (FADD), kaspaza-8 (GeneTex, Irvine , CA), Fas-ligand (Abcam, Cambridge, UK) i b-aktin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Mrlje su zatim inkubirane sa sekundarnim antitijelima konjugiranim s peroksidazom hrena (1:6000 u TBST; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) 1 h na sobnoj temperaturi. Koristeći poboljšani komplet za hemiluminiscenciju (Millipore, Billerica, MA), intenzitet traka na svakoj mrlji analiziran je softverom Image J nakon normalizacije na b-aktin.

Imunofluorescencija

RPE ćelije su fiksirane sa 4% paraformaldehida u PBS-u tokom 15 minuta. Triton X-100 u PBS-u (0.2 procenta) je zatim dodan ćelijama tokom 15 minuta, a zatim 5% fetalnog goveđeg seruma u PBS-u tokom 30 minuta; ćelije su zatim inkubirane sa antitijelom protiv cijepanja kaspaze-3 u omjeru 1:250 tokom 24 h (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Korišteno je kozje anti-zečje IgG sekundarno antitijelo (Dylight 594) u omjeru 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Ćelijska jezgra su obojena 4′-6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI; AAT Bioquest, Sunnyvale, CA). Promjene u fluorescenciji su uočene pomoću laserskog CS SP5 konfokalnog spektralnog mikroskopa (Leica, Teban Gardens, Singapur).

TUNEL bojenje

Fragmenti DNK, koji se mogu detektovati TUNEL testom, značajno su obeležje apoptoze. Koristili smo In Situ komplet za otkrivanje smrti ćelije (kat. br. 11-684-817-910; Roche) za mjerenje apoptotske programirane RPE ćelijske smrti prema protokolu proizvođača. Ukratko, fiksirali smo RPE ćelije sa 4 procenta paraformaldehida i označili prekide lanca DNK u enzimskoj reakciji da bismo otkrili TUNEL-pozitivne ćelije, koje su se predstavile zeleno-fluorescentnom bojom. Obojene ćelije su zatim skenirane i analizirane Tissue FAXS-plus Imaging System (TissueGnostics, Beč, Austrija). Deset hiljada događaja je izbrojano u zatvorenom RPE regionu, a mi smo analizirali slike za broj TUNEL-pozitivnih ćelija pomoću softvera TissueQuest/HistoQuest (TissueGnostics).

Eksperimenti na životinjama

Mužjaci BN pacova (300-350 g tjelesne težine) kupljeni su od Nacionalnog centra za laboratorijske životinje (Taipei, Tajvan) i držani 2-3 mjeseca. Pacovi su održavani u ciklusu 12-h/12-h svjetlo/mrak na 26 ± 1 stepen, 35-47 posto relativne vlažnosti i ad libitum pristup vodi i hrani. Netretirani pacovi su držani u mraku da služe kao kontrole. Protokole studije je odobrio Institucionalni komitet za njegu životinja Medicinskog univerziteta Taipei (broj odobrenja: LAC-2016-0442). Svi eksperimentalni postupci koji uključuju korištenje životinja bili su u skladu s izjavama Udruženja za istraživanje vida i oftalmologije za korištenje životinja u oftalmološkim i eksperimentalnim istraživanjima vida.

Model degeneracije retine kod štakora izazvan BLL-om

Koristili smo periodični model degeneracije mrežnjače sa dugotrajnom izloženošću BLL-u niske osvetljenosti, kao što je opisano u našoj prethodnoj studiji [19]. Ukratko, BN pacovi su podijeljeni u tri grupe: kontrolna grupa, koja je držana u mračnim uvjetima; grupa izložena BLL-u, koja je bila izložena periodičnom BLL-u u mraku bez proširenja zenice (460 nm, 150 luksa) 3 h dnevno tokom 60 dana; i grupu liječenu CTE plus izloženu BLL-u, koja je prethodno liječena CTE (100 mg/kg tjelesne težine) tokom 14 dana, a zatim istovremeno tretirana periodičnim izlaganjem BLL-u 3 h dnevno tokom 60 dana. Svi pacovi su vraćeni u kolonije životinja i normalan ciklus svjetlo/mrak (250 luksa, 12 h/12 ​​h) je nastavljen na kraju eksperimentalnog perioda.

Statistička analiza

Značajne razlike su izračunate korištenjem jednosmjerne analize varijanse praćene Tukeyjevim post hoc testom i testom višestrukih poređenja. Statistička značajnost određena je p-vrijednostima<>

Cistanche tubulosa proizvodi

Rezultati

CTE štiti RPE ćelije od oštećenja oksidativnim stresom

Za procjenu citotoksičnosti CTE putem MTT testa, nekoliko koncentracija CTE ({{{{20}}}}–500 ug/mL) primijenjeno je na RPE ćelije. CTE tretman nije imao očigledne toksične efekte na vitalnost RPE ćelija ni u jednoj od testiranih koncentracija (slika 1A). Stoga su u narednim eksperimentima korišteni 50 i 100 ug/mL CTE. Da bi se istražili anti-apoptotski efekti CTE, različiti oksidativni induktori (H2O2, t-BHP i NaN3) su istovremeno davani sa CTE na RPE ćelije tokom 24 h. H2O2, NaN3 i t-BHP su smanjili vitalnost ćelija i oštetili ćelije RPE na način koji zavisi od doze (isprekidane trake, slike 1B, 1C i 1D); Vijabilnost ćelija bila je značajno niža u ćelijama tretiranim sa 0,03 mM H2O2, 0,3 mM NaN3 i 0,3 mM t-BHP nego u kontrolnoj grupi.

Međutim, zajednički tretman sa 50 i 100 ug/mL CTE je oslabio oštećenje RPE ćelija izazvano H2O2-, NaN3- i t-BHP i preokrenuo smanjenje vitalnosti ćelije (crne trake, sl. 1B, 1C i 1D). Gore navedeni podaci sugeriraju da CTE spašava RPE ćelije od oštećenja oksidativnim stresom.

CTE inhibira smrt RPE ćelija izazvanu BLL

U našoj prethodnoj studiji, otkrili smo da je BLL citotoksičan za RPE ćelije, što se može pripisati promjenama u ekspresiji Bcl-2 i Bax. U ovoj studiji, dalje smo ispitali zaštitne efekte CTE na oštećenje RPE ćelija izazvano BLL. Postavili smo dvije plave električne LED ploče u inkubator stanične kulture. Udaljenost između izvora svjetlosti i ploča ćelija je bila 25 cm, a intenzitet BLL-a bio je 60 luksa, mjereno svjetlomjerom (slika 2A). MTT test je pokazao da izlaganje BLL-u u različitim vremenskim periodima (6-48 h) uzrokuje smrt RPE ćelija na način koji zavisi od vremena (slika 2B). Smanjenje vitalnosti ćelija izazvano BLL nakon 24 i 48 h značajno je oslabljeno kada su ćelije istovremeno tretirane sa CTE (100 ug/mL) (slika 2C). Ovi podaci sugeriraju da CTE štiti RPE ćelije od fototoksičnosti izazvane BLL.

CTE inhibira apoptozu izazvanu BLL u RPE ćelijama regulacijom Bcl-2/Bax i Fas/FasL puteva

Na osnovu potencijalnih zaštitnih efekata CTE u RPE ćelijama, dalje smo istraživali moguću uključenost CTE u ovaj proces. Ispitana su dva apoptotička signalna puta, tj. Bax/Bcl{{0}} i Fas/Fas ligand (FasL) putevi, te srodni proteini (npr. pro-kapaza-8 i pro-kaspaza -3; slike 3A i 3B). Utvrđeno je da izloženost BILL-u (6-48 h) povećava ekspresiju proteina Bax/Bcl-2, FasL i FADD na način koji zavisi od vremena (slika 3A). Štaviše, BLL je smanjio ekspresiju proteina prokapaze-3 i prokapaze-8, što je rezultiralo više oblika cijepanja kaspaze-3 i kaspaze-8 nakon izlaganja BLL-u, što je u skladu s našim prethodna studija [19]. Da bi se dalje procijenili zaštitni efekti CTE, različite koncentracije CTE su primijenjene na BLL izložene RPE ćelije (slika 3B). Nakon 48-h BLL izlaganja, CTE (50 µg/mL) je smanjio omjer Bax/Bcl-2. Nadalje, CTE (100 µg/mL) je smanjio ekspresiju proteina FasL i FADD, ali značajno povećao nivoe prokapaze-8 i prokapaze-3 (Sl. 3C i 3D). Studije su pokazale da je aktivacija kaspaze-3 marker apoptoze u RPE ćelijama [20]. Da bismo dodatno potvrdili zaštitne efekte CTE, izvršili smo imunofluorescentno bojenje cijepane kaspaze-3. Utvrđeno je da izlaganje BILL-u u trajanju od 48 sati izaziva cijepanje kaspaze-3 i translokaciju u jezgro, što rezultira apoptozom RPE ćelija (žute strelice, slika 4A). Međutim, kada su ćelije izložene BLL zajedno tretirane sa CTE (100 µg/mL), BLL-indukovana ekspresija cijepane kaspaze-3 je inhibirana. Da bismo bolje razumjeli anti-apoptotičke efekte CTE, koristili smo TUNEL bojenje za detekciju DNK fragmenata u RPE stanicama. Nakon 48-h BLL izlaganja, TUNEL-pozitivne ćelije su porasle sa 1,78 ± 0,36 procenata na 23,82 ± 0,33 procenata; ovaj efekat je oslabljen zajedničkim tretmanom sa CTE (23,82 ± 0,33 procenata do 2,22 ± 0,11 procenata; slike 4B, 4C i 4D). Ovi rezultati ukazuju da CTE tretman snažno štiti RPE ćelije od apoptoze izazvane BLL posredovanjem Bax/Bcl-2 i FasL/FADD puteva.

CTE inhibira BLL-indukovanu fosforilaciju proteina odgovora na stres u RPE ćelijama

Prethodne studije su pokazale da se MAPK putevi, kao što su ERK, JNK i p38 MAP, aktiviraju u RPE ćelijama i u retini nakon izlaganja ultraljubičastom svjetlu ili BL [21, 22]. Stoga, da bi se istražili regulatorni efekti CTE na MAPK put odgovora na stres nakon izlaganja BLL, 100 µg/mL CTE je primijenjen na RPE ćelije pod različitim vremenima izlaganja BLL (Slika 5A). Western blot analiza je pokazala da su fosforilisani ERK, JNK i p38 aktivirani nakon izlaganja BLL-u, ali značajno inhibirani nakon zajedničkog tretmana sa CTE u RPE ćelijama (slika 5B). Gore navedeni rezultati ukazuju da CTE inhibira oštećenje RPE ćelija izazvano BLL, što bi moglo biti povezano sa inhibicijom MAPK u RPE ćelijama.

CTE spašava oštećenje mrežnice izazvano BLL-om nakon dugotrajnog periodičnog izlaganja na modelu štakora

Da bismo procijenili zaštitne efekte CTE-a, izložili smo BN pacove dugotrajnoj izloženosti BLL-u tokom 60 dana i procijenili efekte CTE-a. Kao što je prikazano na šemi predstavljenoj na slici 6A, BN ​​pacovi su podijeljeni u tri grupe: kontrolnu grupu, grupu izloženu BLL-u i CTE plus BLL grupu (slika 6A). U grupi sa CTE plus BLL, BN pacovima je kontinuirano davan CTE (100 mg/kg tjelesne težine) oralnom gavažom jednom dnevno tokom 14 dana prije izlaganja BLL-u. Dana 0, BN pacovi su istovremeno tretirani sa CTE (100 mg/kg tjelesne težine) i izloženi BLL-u 3 h dnevno tokom 60 dana. Nakon 60 dana izloženosti BLL-u, životinje su žrtvovane za Western blot analizu i imunohistohemijsko bojenje. U grupi CTE plus BLL, ekspresija proteina prokapaze-3 u homogenatima oka štakora bila je veća nakon tretmana CTE nego u BLL grupi (slike 6B i 6C). Ovi podaci ilustriraju da CTE sprječava dugotrajnu fototoksičnost i apoptozu retine niske luminancije uzrokovanu BLL-om tako što inhibira aktivaciju cijepane kaspaze-3. Imunohistohemijsko bojenje pružilo je više dokaza u vezi sa zaštitnim efektima CTE na strukturu i fiziološke puteve retine (slika 7). Nadalje, nakon izlaganja BLL-u otkrili smo da je unutrašnji neuronski sloj smanjen i uočili morfološke deformacije na vanjskom neuronskom sloju (ONL), uključujući unutrašnji segment/spoljašnji segment u centralnoj i perifernoj retini, što je u skladu s našim prethodnim istraživanjem ( Slika 7B). Važno je da je CTE spriječio deformaciju RPE ćelija, oštećenje neuronskih ćelija i ukupno stanjivanje mrežnjače u grupi CTE plus BLL (slika 7C). Nadalje, nismo uočili TUNEL-pozitivne ćelije u centralnoj i perifernoj retini normalnih pacova (slike 8Ab i 8Bb). Suprotno tome, nakon izlaganja BLL-u tokom 60 dana, TUNEL-pozitivne ćelije su često detektovane u ONL centralne i periferne retine (slike 8Ae i 8Be). DAPI bojenje ONL centralne retine je značajno smanjeno u BLL grupi (slika 8Ad). Međutim, prisustvo TUNEL-pozitivnih ćelija je oslabljeno i DAPI bojenje centralne i periferne retine ONL je povećano u CTE plus BLL grupi (sl. 8Ai i 8Bi).

Cistanche tubulosa proizvodi

Sljedeći dio Ⅱ za nastavak