DIO Ⅰ: Utjecaj uslova okoline na broj nefrona
Mar 20, 2022
za više informacija:ali.ma@wecistanche.com
DIO Ⅰ: Utjecaj uslova okoline na broj nefrona: Modeliranje bolesti majke i epigenetska regulacija u razvoju bubrega
Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse i dr.
1. Uvod
Na razvoj fetusa utiče in utero okruženje, a nepovoljna sredina može dovesti do bolesti kao što su hipertenzija, kardiovaskularne bolesti i hronične bolesti bubrega kasnije u životu [1-4]. Niz intrauterinih poremećaja može rezultirati smanjenjem nefrona i kompromitovanom bubrežnom funkcijom kod potomaka. Kod glodara, stanja koja dovode do smanjenog broja nefrona pri rođenju uključuju intrauterinu restrikciju rasta (IUGR), majčinu ishranu sa malo proteina, lekove (uključujući kortikosteroide ili nesteroidne antiinflamatorne lekove), monogenetske mutacije i niske nivoe vitamina A, kao i dijabetes kod majke. i nedostatak gvožđa [5-10]. Kod ljudi trenutno ne postoji neinvazivna metoda mjerenja broja nefrona. Međutim, postmortalne studije su pokazale negativnu korelaciju između broja nefrona i krvnog pritiska [4,11]. Osim toga, poznato je da su intrauterina stanja povezana sa smanjenim brojem nefrona, kao što je IUGR, povezana sa povećanom stopom hipertenzije i CKD[12].
Eksperimenti in vivo u kojima su štetna intrauterina stanja umjetno izazvana kod trudnih životinja pokazali su se neprocjenjivim za otkrivanje i opis bubrežnih promjena izazvanih kod potomaka. Međutim, svaka eksperimentalna intervencija tokom gestacije rezultira složenim promjenama u fiziologiji majke, placente i fetusa koje same mogu utjecati na okruženje metanefrousa u razvoju. Ex vivo tehnike modeliranja to zaobilaze tako što omogućavaju istraživanje razvoja bubrega potpuno odvojeno od utjecaja majke životinje, placente ili drugih organa fetusa. Izolovane kulture metanefroja na interfejsu srednjeg vazduha prvobitno je izveo Trowell 1950. godine [13], a kasnije su rafinirane kultivisanjem bubrega na filter membranama[14], dajući osnovu za jednovarijabilne uslove kulture.
Ukratko, postoji sve veći broj dokaza koji sugeriraju da su prenatalni inzulti povezani s niskim brojem nefrona relevantni za faktore rizika za hipertenziju i CKD. Da bi se razvile preventivne strategije kako bi se osigurala adekvatna obdarenost nefrona pri rođenju, neophodno je mehaničko razumijevanje faktora koji utiču na razvoj bubrega i nefrogenezu. U ovom radu, kultura metanefričkih organa korištena je za modeliranje različitih aspekata regulacije okoliša kako bi se proučavali njihovi efekti na rast bubrega i moguće implikacije na dugoročnu bubrežnu funkciju i korištena za skrining epigenetskih regulatora korištenjem malih spojeva odobrenih od strane FDA.
Click to Cistanche herba proizvodi za funkciju bubrega
2. Rezultati
2.1. Upotreba metanefričnih organskih kultura za proučavanje uticaja uslova okoline na razvoj bubrega
Za modeliranje nepovoljnih uslova okoline, bubrezi embriona embrionalnog dana (E)12.5 kultivisani su na interfejsu srednjeg vazduha (Slika 1A). Da bi se olakšalo praćenje razvoja nefrona i glomerula, Six2. Cre i Pod. Korišteni su dual-fluorescentni reporterski miševi (Slika 1B, C). Uobičajeno stanje tokom trudnoće je groznica, koja pogađa više od 10 procenata trudnoća tokom prvih 16 nedelja gestacije [15] Toplota je dobro okarakterisan teratogen, a pokazalo se da hipertermija tokom trudnoće dovodi do pobačaja fetusa, usporavanja rasta, i razvojni nedostaci, kao što su ageneza bubrega, hipoplazija i mala porođajna težina kod nekoliko vrsta [16-21]. Da bi se procijenio uticaj produženih hipertermičnih stanja u rasponu temperature na rast bubrega i formiranje nefrona, bubrezi su izolovani i održavani na 37 ili 40 stepeni (Slika 1D). Nakon 7 dana kulture, bubrezi kultivisani na 40°C bili su u prosjeku 18,36 posto manji od svojih kolega uzgojenih u fiziološkim uslovima (Slika 1E). Međutim, nije pronađena značajna razlika u broju glomerula po bubregu između grupa (Slika 1F). Ipak, smanjen ukupni rast bubrega pokazuje negativan uticaj povišene temperature na metanefrični rast.
Procjenjuje se da 19 posto trudnica pati od anemije uzrokovane nedostatkom gvožđa [22], nedostatak gvožđa je jedno od najrasprostranjenijih stanja sa potencijalom da poremeti razvoj bubrega [23]. Podaci in vivo su pokazali da su rast bubrega, broj glomerula i unos gvožđa u bubrege smanjeni tokom trudnoća koje su pogođene nedostatkom gvožđa kod majke [24]. Kako bi se procijenio utjecaj smanjene opskrbe željezom vezanog za transferin na rast bubrega i nefrogenezu, eksplanti su uzgajani u mediju koji je sadržavao 50 ug/mL holotransferina zasićenog željezom ili 50 ug/mL apotransferina osiromašenog željezom, respektivno. Bubrezi ograničeni željezom ostali su mnogo manji od svojih kolega s dovoljno željeza i pokazali su povećanu apoptozu u mokraćovodnim pupoljcima i smanjeno grananje i proliferaciju mokraćovodnih pupoljaka (Slika 1G, Dodatna slika S1A-F). Dok je populacija nefrona bila morfološki nepromijenjena, moglo se vidjeti smanjenje distalnog dijela nefrona u razvoju, kao i distalnih tubula (Slika 1H, I, Dodatna slika S1G-J). Bubrezi sa nedostatkom gvožđa bili su u prosjeku 47,9 posto veličine svojih kolega kultiviranih holo-transferinom (slika 1) i pokazali su smanjenje ukupnog broja glomerula po bubregu za 69,9 posto nakon 7 dana u kulturi (slika 1K) . Stoga je smanjenje gvožđa apo-transferinom pokazalo ozbiljne efekte na rast bubrega sa fenotipom potpuno proksimalne nefrogeneze.
Slika 1. Upotreba metanefričnih kultura organa za proučavanje uticaja uslova okoline na razvoj bubrega.(A) Urogenitalni greben iz embriona miša E12.5 (lijevi panel) je mikrohirurški ekstrahiran (drugi panel), a bubrezi su izolirani (treći panel) i stavljeni na Transwell umetke (desni panel). Skalirane šipke∶ 1 mm (lijeva ploča), 500 μm (treći panel). (B) Transgeni miševi sa dvostrukom Tomato/EGFP ekspresijom korišteni su za uslovno obilježavanje Six2-pozitivnih ćelija i njihovih potomaka koristeći Six2. Cre ili (C) podocin-pozitivne ćelije koje koriste Pod. Cre miševi. (D) Eksplanti iz istog embriona su kultivisani 7 dana na 37 ili 40 stepeni. Skala bar∶ 500 μm. （E） Površine eksplantata koje su uzgajane 7 dana na 37 ili 40 stepeni .n=40 parova, upareni t-test, srednja vrijednost±SD.(F) Broj glomerula u grupama eksplantata nakon 7 dana.n{{ 17}} parova, upareni t-test, srednja vrijednost ±SD. (G) Eksplanti iz istog embriona su kultivisani 7 dana u medijumu koji sadrži holo-Tf ili apo-Tf. Skala bar∶ 500 μm. (H) Širokopoljne slike holo-Tf i apo-Tf kultivisanog para eksplantata obojene na SIX2 i E-kadherin nakon 48 h kulture pokazuju normalan skup progenitorskih ćelija i defekte u ranoj morfologiji nefrona. Skala bar∶100 μm. (I) Slike širokog polja holo-Tf i apo-Tf kultivisanog para eksplantata obojene na WT1 i JAG1. Skala bar∶100 μm. （） Površine holo-Tf i apo-Tf kultiviranih eksplantata nakon 7 dana.n=30 parovi, upareni t-test, srednja vrijednost ± SD.(K) Broj glomerula u grupama eksplantata nakon 7 dana.n =17 parovi, upareni t-test, srednja vrijednost ± SD.
2.2. Ex Vio Izloženost visokoj glukozi dovodi do promjena u bubrezima u razvoju uzrokovanim dijabetičkom nefropatijom
Dijabetes majke je još jedno uobičajeno stanje tokom trudnoće, sa globalnom prevalencom hiperglikemije u trudnoći od ~17 posto i preko 20 miliona živorođenih svake godine [25]. Pokazalo se da dijabetes izazvan na modelima miševa i pacova dovodi do potomaka sa nižim brojem nefrona[10,26,27]. Kultura metanefričnih organa je ranije korištena za proučavanje uticaja visoke glukoze na razvoj bubrega [27-29]. Ranije smo izvijestili o smanjenju veličine, broja nefrona i metilacije DNK u uslovima visoke glukoze od 55 mM[30]. Za razliku od objavljenih podataka [28], u našim uzorcima nije se mogao vidjeti nikakav utjecaj na veličinu eksplanta ili broj glomerula kada su uzgajani u različitim 30 mM podlogama glukoze u usporedbi s kontrolnim uvjetima od 5 mM nakon 7 dana (dodatna slika S2A, B). Nadalje, nije se moglo otkriti smanjenje metilacije DNK na LINE-1 i glavnim satelitskim lokacijama (dodatna slika S2C, D). Dalje je analiziran efekat 55 mM visoke glukoze na razvoj bubrega nakon 7-dnevne kulture, pokazujući smanjenje brzine rasta počevši od 3. dana u kulturi (Slika 2A, B). Imunofluorescentno bojenje nije pokazalo morfološke defekte SIX2-pozitivnih progenitorskih ćelija (Slika 2C), ali je pokazalo smanjeno bojenje podocitnog markera podokaliksina (PODXL, Slika 2D). Utvrđeno je da glomeruli sadrže zadebljani glomerularni bazalni matriks vidljiv u histološkim bojama (slika 2E). Slični nalazi su napravljeni u elektronskoj mikroskopiji, pokazujući povećanje debljine bazalne membrane glomerula (Slika 2F), jednog od najranijih markera pred-dijabetesa i dijabetičke nefropatije (DN)[31,32], u pet od šest bubrega i nijednom od sedam kontrolnih bubrega legla. Da bi se dalje razotkrile promjene u transkriptomu, izvršena je analiza diferencijalne ekspresije gena u paru (DGE) kultura bubrega iz tri legla, pri čemu je jedan bubreg svakog embrija kultiviran s visokim sadržajem glukoze, a drugi s kontrolnim medijem i bubrezi su prikupljeni za analizu ( n=3).DGE je potvrdio regulaciju komponenata ekstracelularnog matriksa kao primarni biološki proces koji je reguliran naviše (dodatna tabela S1). Sniženo regulirani geni su uglavnom bili uključeni u (imuno)ćelijsku aktivaciju i egzocitozu/lučenje (dodatna tabela S1). Ontologija fenotipa sisara ukazala je na abnormalnu morfologiju korteksa bubrega i bubrežnog tjelešca zbog gena sa smanjenom regulacijom kao što su Pdgfb, Podxl, Ren, Ptpro, Mafb i Vegfa (dodatna tabela S1). Utvrđeno je da je ekspresija nekoliko gena u bubrezima, kao što su Angptl4, Spon2 (Mindin), Pappa i Txnip, za koje se pokazalo da se pojačano reguliraju kod dijabetičke nefropatije [33-36], povećana u hiperglikemijskim uvjetima. Da bi se uporedio profil ekspresije gena kulture bubrega visoke glukoze sa ljudskim DN, DGE podaci su upareni sa ljudskim podacima iz mikrodisekovanih glomerula i tubula iz biopsija pacijenata sa dijabetičkom nefropatijom iz Evropske banke bubrežne cDNA (ERCB). Od 216 različito reguliranih gena koji su upareni nakon grupne analize, 94 gena su odgovarajuće diferencijalno regulirana u glomerularnim i/ili tubularnim frakcijama (slika 2G). Preklapanje našeg modela i ljudskih DN gena pokazalo je da je 40 od 95 gena povećano u glomerulima i 34 gena u tubulima (25 zajedničkih gena) (slika 2H). Geni su uglavnom bili uključeni u organizaciju ekstracelularnog matriksa (COL4A5, COL4A6, COL8A2, LAMB3, LAMC3) i ćelijsku adheziju (ITGBL1, CLDN15). Dodatno, geni povezani sa dijabetesom, kao što su TXNIP, SPON2 i PAPPA, bili su povećani. Od 120 gena sa smanjenom regulacijom iz kultura bubrega, 22 su također bili sniženi u glomerulima, a 39 je također smanjeno regulirano u tubulima (uobičajeno 16 (Slika 2I). Ovi geni su bili uključeni u odgovor na endogeni stimulus (BMP2, KLF15, JUNB, CTSB), razvoj epitela nefrona (PTPRO, PODXL, VEGFA) i pozitivna regulacija hemotakse endotelnih ćelija (LGMN, P2RX4, VEGFA). Dodatno, geni povezani sa dijabetesom kao što su RASGRP3, SIRPA, GATM i ESM1 su bili smanjeni [ 37-39]. Diferencijalno regulirani geni koji se ne preklapaju sa ERCB podacima također odražavaju promjene povezane sa dijabetesom, kao što su ekstracelularni matriks (ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) ili gestacijski dijabetes (LAT2, HP, CXCL10, CD{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1). Dakle, razvoj bubrega u uslovima visokog nivoa glukoze pokazao je izuzetne sličnosti sa dijabetičkom nefropatijom odraslih ljudi.
Slika 2. Ex vivo visoka izloženost glukozi dovodi do promjena povezanih s dijabetičkom nefropatijom u bubrezima u razvoju.(A) Embrionalni bubrezi iz Pod.Cre; Paradajz/EGFP životinje uzgajane 7 dana u uslovima niske glukoze (LG, 5,5 mM -D-glukoza, 55 mM manitola) ili visoke glukoze (HG, 55 mM -D-glukoza). Skalirana traka: 500 um. (B) Površina bubrega HG i LG stanja.*,p=0.0474;*,p=0.0052;*,p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. Ex Vivo izloženost visokoj glukozi utječe na formiranje dugotrajne memorije putem metilacije DNK
Da bi se dalje razumjele molekularne promjene posredovane hiperglikemijskim okruženjem, kulture bubrega su uzgajane u uvjetima visoke glukoze 3,5 dana, a zatim su promijenjene u uslove niske glukoze u istom periodu (slika 3A). Zanimljivo je da inkubacija u fiziološkim uslovima nakon kraćeg perioda inkubacije u medijumu sa visokim sadržajem glukoze nije preokrenula smanjenje rasta nakon 7 dana u kulturi, pri čemu su kulture rasle istom brzinom kao i pod kontinuiranim tretmanom sa visokim sadržajem glukoze (Slika 3B). Nadalje, metilacija DNK pokazala je hipometilaciju LINE-1 elementa i glavnih satelitskih lokusa (Slika 2C, D), kao i trajnu hipermetilaciju DNK promotora Ppargcla, i pod visokim nivoom glukoze i pod obrnutim uvjetima (Slika 3E), što ukazuje na formiranje metaboličke memorije putem metilacije DNK zbog ranijih nepovoljnih uslova okoline kao sredstva fetalnog programiranja.
Slika 3. Ex vivo visoka izloženost glukozi utiče na formiranje dugotrajnog pamćenja putem metilacije DNK.(A) Snimanje E12.5 embrionalnih bubrega od dana 0 do 7. dana u mediju sa niskim nivoom glukoze (5,5 mM), medijumom sa visokim nivoom glukoze (55 mM) ili medijumom sa visokim nivoom glukoze tokom 3,5 dana i prelazak na medijum sa niskim nivoom glukoze za preostale dane. Traka skale: 500 um. (B) Površina bubrega preko 7 dana. Srednja vrijednost ± SD. n=36 bubrega. LG, tretman niske glukoze; HG, tretman visoke glukoze; HG do LG, 3,5 dana visoke i 3,5 dana niske razine glukoze.***,LG-HG (neupareni t-test):p=0.0004;**,LG-HG do LG (upareni t-test ):str<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4. Ex Vivo Small Compound Screen identifikuje epigenetičke regulatore razvoja bubrega
Rezultati ovog rada, kao i prethodnih radova, sugeriraju da epigenetski mehanizmi igraju ulogu u razvoju bubrega [30, A40-45]. Stoga smo željeli sistematski procijeniti učinak epigenetskih modulatora različitih klasa enzima na razvoj bubrega. Za ovo smo odabrali biblioteku od 22 mala jedinjenja odobrena od strane FDA sa demonstriranom inhibitornom aktivnošću [46-56] (Slika 4A). Koristeći Six2.Cre-reporter miševe za evaluaciju razvoja nefrona, bubrežne strukture su kultivisane 3 dana sa inhibitorima u medijumu. S vremenom se veličina povećava u odnosu na kontrolne organe legla, a morfologija je provjerena za abnormalnosti u razvoju (Slika 4B). Može se pokazati da nekoliko inhibitora ometa normalan ex vivo razvoj bubrega. HDAC inhibitor entinostat, inhibitor benzamid histon deacetilaze sa visokim afinitetom za HDAC1,2 i 3 [57], pokazao je dosljedno smanjenje rasta i nedostatak diferencijacije i proliferacije nakon 3 dana (slika 4C). TH39 se razvio kao selektivni inhibitor HDAC8 (IC50). HDAC8 88 nM, 26-put selektivan prema HDAC1,28-put selektivan prema HDAC6[56]), pokazao je sličnu ozbiljnu inhibiciju rasta u poređenju sa kontrolnim organima legla. Nadalje, kelatori željeza i inhibitori JmJC deferasiroksa i deferoksamina pokazali su smanjenje rasta analogno mediju s nedostatkom željeza. Dodatno, SET7/9 inhibitor ciproheptadin [58,59] pokazao je smanjenje rasta i nedostatak diferencijacije i proliferacije u poređenju sa kontrolnim bubrezima (Slika 4D), ali se činilo i da ometa Wnt signalizaciju (dodatna slika S3). Drugi HDAC, HAT, HDM i HMT inhibitori i DNMT inhibitor 5-azacitidin nisu pokazali smanjenje rasta ili razvojne anomalije unutar izmjerenog vremenskog okvira (Slika 4A).
Slika 4. Ex vivo mali ekran jedinjenja identifikuje modulatore razvoja bubrega.(A) Lista malih spojeva, njihovih epigenetskih ciljeva i korištenih koncentracija pokazuje smanjenje bubrežnog rasta s entinostatom, TH39, deferasiroksom, deferoksaminom i ciproheptadinom u 3 nezavisna eksperimenta nakon 3 dana u kulturi. Kontrolne kulture su tretirane sa DMSO. ***, p-vrijednost<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
