Dio 5: Mapiranje epigenomske i transkriptomske međusobne igre tokom formiranja pamćenja i prisjećanja u ansamblu hipokampalnog engrama

ali.ma@wecistanche.com

Kliknite ovdje do 6. dijela

Kliknite ovdje do 5. dijela

Prošireni podaci Slika 2: Stabilni DAR-ovi su pretežno obogaćeni za oznake pojačivača

(a) Tok rada za disekciju protočne citometrije različitih neuronskih populacija iz hipokampusa, tokommemorijaformiranje i pronalaženje. Reprezentativni FACS grafikoni koji pokazuju ekspresiju cjelokupne populacije (lijevi panel). Dalja selekcija je napravljena na pojedinačnim jezgrima i NeuN plus /DAPI plus populaciji (srednji panel). Na kraju, selekcija je izvršena na zatvorenoj podpopulaciji; GFP plus (prilagođen na ~2,5 posto od svih ćelija), ARC plus /GFP plus (~0.15 posto od svih ćelija) i jezgra su sortirani u 1,5 ml Eppendorf epruvete obložene sa 200 ul 1 posto PBS.

Kliknite zaCistanche ekstrakt u prahu poboljšava pamćenje

(b) Vennov dijagram (lijevo) i tabela (desno), ilustruju preklapanje između DAR-ova identifikovanih u različitim poređenjima u parovima tokommemorijaformiranje i opoziv.

(c) Statistička analiza zasnovana na ponovnom uzorkovanju izvršena je kako bi se utvrdilo da li su obogaćivanja stanja hromatina u odnosu na emisije ChromHMM (opažene) statistički značajna. Očekivano obogaćivanje izračunato je izvođenjem 10,000 randomiziranih skupova preklapanja (permutacija) između lokusa "svih dostupnih lokacija" i "svih lokacija modifikacija histona (tj. svih emisija)" i predstavljeno kao histogram u figura. Veličina uzorka svakog randomiziranog skupa određena je veličinom DAR-ova iz svake države. Izračunata je srednja vrijednost i standardna devijacija uzorka (dodatna tabela 3). Broj uočenih preklapanja između DAR-ova i svake emisije je izračunat i predstavljen kao linije. z-score je izračunat kao ugar; Z=(opažene vrijednosti (X) – srednja vrijednost uzorka (μ))/(standardna devijacija uzorka (σ)). z-score Basal vs. Early; SE 10.5, WE 6.9. Stabilan; SE 16.9, WE 12.7, sve p < 0,0001,="" z-score="" rano="" naspram="" kasno;="" sp="" 91.7,="" wp="" 38.7.="" kasno="" naspram="" ponovno="" aktiviranog;="" sp="" 26.8,="" wp="" 28.9,="" sve=""><0.0001. p-values="" (two-sided)="" were="" calculated="" from="" the="" z-table.="" a="" full="" analysis="" is="" reported="" in="" supplement="" table="">

(d) Kružni grafikon prikazuje procenat različitih stanja pojačivača, za sve stabilne regione. Preklapanje svakog stabilnog regiona izvršeno je sa prethodno objavljenim podacima H3K4me1 i H3K27ac ChIP-seq, dobijenim 1h nakon FS21. Stanja pojačivača su klasifikovana kao 'primed' – preklapanje sa regionima označenim samo sa H3K4me1, 'aktivna' – sa H3K4me1/H3K27ac ili 'latentna' – bez preklapanja.

(e) Motifs identified from nucleosome-free regions (NFR) on the ATAC-seq tracks from each state (Basal, Activated -early, Activated -late, and Reactivated). Peaks were divided into positions that were annotated to promoters (5kb from TSS) and enhancers (>5kb iz TSS-a). Veličina kruga označava postotak obogaćivanja (1–50 posto). Boja označava –log(P-vrijednost).

Prošireni podaci Slika 3: Koordinirano prajming epigenetskog stanja tokommemorijakodiranje i

(a) Osobine interakcija otkrivenih u Čikagu u svakoj fazi (Bazalno, Aktivirano -rano, Aktivirano -kasno i Reaktivirano). Zadane postavke i prag skora od 5 korišteni su u značajnom pozivu interakcije, koji se izvodi zajedno na svim replikama.

(b) Tortni grafikon predstavlja postotak svih interakcija otkrivenih u Chicagu koje su razgraničene ili H3K27ac/H3K4me1 (67,5 posto pojačivača ocjena), H3K4me3/H3K9ac (46,2 posto promotora) ili H3K27me3 (1,1 posto represivnih ocjena).

(c) Slika pretraživača WashU epigenoma, koja obuhvata oko 500 Kb regiona oko Eif4e2 gena. Lukovi pokazuju značajne uobičajene (crveni pravougaonik) i jedinstvene (strelica) pojačivače koji su u interakciji sa promoterima (plavi pravougaonik).

(d) Primjeri interakcija koje naziva Chicago. Grafičke prikaze koje prikazuju sve očitane zbrojeve od mamca-other-end (pojačivača), unutar 500–700 kb (uzvodno i nizvodno) od Grink3 i Wwc2 promoteri. Značajne interakcije koje je otkrio Chicago (skor veći od ili jednak 5) prikazane su crvenom bojom, a interakcije ispod praga (3 manje od ili jednake rezultatu < 5)="" su="" prikazane="" plavom="" bojom.="" sive="" linije="" pokazuju="" očekivani="" broj,="" a="" isprekidane="" linije="" gornju="" granicu="" intervala="" pouzdanosti="" od="" 95="" posto.="" (e)="" analiza="" preklapanja="" obogaćivanja="" između="" pojačivača="" koji="" djeluju="" u="" interakciji="" i="" dar-ova,="" koristeći="" proceduru="" permutacije="" na="" 10,000="" randomiziranim="" skupovima="" dostupnih="" lokacija.="" histogram="" predstavlja="" distribuciju="" slučajnog="" uzorkovanja="" dostupnih="" lokacija="" za="" svako="" stanje="" (bazalno="" naspram="" aktivirano="" -="" rano,="" aktivirano="" -rano="" naspram="" aktivirano="" -kasno,="" aktivirano="" -kasno="" naspram="" reaktivirano,="" stabilno).="" broj="" preklapanih="" lokusa="" prikazan="" je="" obojenim="" linijama="" od="" bazalnih,="" aktiviranih="" -rano,="" aktiviranih="" -kasno="" i="" reaktiviranih="" neurona.="" dar-ovi="" bas-a="" u="" odnosu="" na="" aktivirano="" -rano="" (z-score;="" 7.1,="" 7.7,="" 8.5,="" 10.9).="" dar-ovi="" aktiviranog="" -rano="" u="" odnosu="" na="" aktivirano="" -kasno="" (z-score;="" -0,1,="" -0,8,="" -2,4,="" -3,2).="" dar-ovi="" aktiviranog="" -kasno="" naspram="" reaktiviranog="" (0,4,="" 1,8,="" 0,4,="" -0,2).="" dar-ovi="" stabilni="" (z-score;="" 1,7,="" 2,0,="" 6,5,="">

Prošireni podaci Slika 4: Promjene hromatina koje se javljaju tokom rane faze omogućavanja

(a) Analiza preklapanja između imena gena iz diferencijalne analize u paru i prethodno objavljenih podataka i) aktiviranih ćelija DG granula 1 h nakon nove izloženosti32 ii) 24 h nakon FS20 i iii) nakon produžene stimulacije (6 h) kultiviranih kortikalnih ćelija miša neurona sa KCl33. Analiza je izvršena pomoću GeneOverlap R paketa.

(b) Egzoničko (crveno) i intronično (plavo) očitavanje kvantificirano je odvojeno za sve uslove i upoređeno sa transkripcijskom aktivnošću mjerenom pomoću DEseq2. Čitanja su normalizirana (RPKM) i log2FC promjene su predstavljene za svako stanje. violinski zaplet označava srednju vrednost,

interkvartilni raspon, te minimum i maksimum, jednosmjerna ANOVA (parametrijska, neuparena), bazalna u odnosu na rani; Ž (5, 248)=389.9. Rano naspram kasno; F (5, 2374)=2183. Kasno naspram ponovno aktiviranog. F (5, 1357) {{10}}.5, Svi Ps < 0.0001.="" bonferronijeva="" višestruka="" poređenja.="" ns="nije" značajno,="" ***p=""><>

(c) Odnosi egzon/intron su izmjereni u svakom klasteru u svim uslovima (Log2FC skala). dijagram violine pokazuje srednji, interkvartilni raspon i minimalni i maksimalni, jednosmjerni ANOVA (parametarski, neupareni), F (5, 1143)=260.2, P<0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test.="" n.s="non-significant," ***p="" <="">

(d) Analiza preklapanja između DAR-ova i DEG-ova tokom različitihmemorijafaze. DAR-ovi na intergenskim i intronskim regijama su mapirani na njihove odgovarajuće gene pomoću pc-HiC interakcijskih mapa. Analiza preklapanja je izvršena pomoću GeneOverlap R paketa. P-vrijednost (brojevi) i omjer šansi (boja) iz Fišerovog egzaktnog testa predstavljeni su u toplotnoj mapi. ns – nije značajno.

(e) Pirsonova korelacija između log2FC vrijednosti DAR-ova i log2FC DEG-ova koji su označeni za tu regiju (međugenski regioni su mapirani preko pc-HiC skupa podataka). Promjene pristupačnosti hromatina su upoređene sa raščlanjenim egzoničkim očitanjima (crvena linija), introničkim čitanjima (plave linije) i ukupnim promjenama transkripcije (i introničnim i egzoničkim čitanjima) mjerenim pomoću Desq2 (siva linija). Sve r i p-vrijednosti su navedene u dodatnoj tabeli 9.

Prošireni podaci Slika 5: Transkripcijske promjene u aktiviranim kasnim neuronima korelirale su više

(a) Egzoničko (crveno) i intronično (plavo) očitavanje kvantifikovano je odvojeno u svim uslovima za svaki od klastera identifikovanih na Slici 5B. Čitanja su normalizirana (RPKM) i log2FC promjene su predstavljene za svaki klaster.

(b) Odnosi egzon/intron su mjereni u svakom klasteru u svim uslovima. Violin dijagram pokazuje srednju vrijednost, interkvartilni raspon i minimum i maksimum, n=3 biološki nezavisnih uzoraka jednosmjerna ANOVA (parametrijska, neuparena), Dw – kasni klaster; Ž (3, 968)

652) = 93.97, P<0.0001. reactivation="" -cluster;="" f="" (3,="" 1600)="485.2,"><0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test="" to="" deseq2="" reads.="" ***p="" <="">

Prošireno Podaci Fig. 6: Izrazito vremenski transkripcijski programe su biće sinhronizovano to

zavisan način u prisustvu tamoksifena. U desnom panelu reprezentativne IHC slike DG. Zelena – AAV-eYFP, crvena – endogeni luk. Linija skale predstavlja 50 μm.

(b) Procjena morfologije bodlji tokom različitihmemorijafaze. Desni panel prikazuje jednu eYFP plus dendritičnu osovinu sa različitim tipovima bodlji (Stubby, Thin, Mushroom, Enlarged pečurka). Linija skale predstavlja 5 μm. boxplot označava srednji, interkvartilni raspon i minimum i maksimum, Aktivirano -rano: n=4 miševa /5 sekcija po životinji, Aktivirano -kasno: n=4 miševa /4 odjeljka po životinji, Reaktivirano: n=4 miševa /2 odjeljka po životinji. jednosmjerna ANOVA (parametrijska, neuparena), Stubby; F (2, 36)=2.313, P=0.1135. Thin; Ž (2, 36)=35.12, P<0.0001. mushroom;="" f="" (2,="" 36)="38.42," p="" <="" 0.0001.="" bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test,="" ***p="" <="">

(c) reprezentativne IHC slike i kvantifikacija nivoa proteina dva člana porodice EIF; (lijevo) Eif2a i (desno) Eif3e. Linija skale predstavlja 10 μm. Podaci za dendritičnu osovinu prikazani su kao omjer broja i dužine (μM). n=4 miševi /5 sekcija po životinji, boxplot pokazuje srednju vrijednost, interkvartilni raspon i minimalni i maksimalni, jednosmjerni ANOVA (parametarski, neupareni) sa Bonferronijevim testom višestrukih poređenja, ns - nije značajno, Eif2a Shaft; F (2, 20)=4.484, P=0.0246. Soma; F (2, 21)=19.58, P < 0,0001.="" (aktivirano="" -rano="" naspram="" aktivirano="" -kasno="" *p="0.0142," aktivirano="" -rano="" naspram="" reaktivirano="" *p="">< 0,0001,="" aktivirano="" -kasno="" naspram="" reaktivirano="" *p="0.0303)." eif3e="" shaft;="" f="" (2,="" 14)="1.983," p="0.1745." soma;="" f="" (2,="" 23)="8.309," p="0.0019," (aktivirano="" -rano="" naspram="" reaktivirano="" *p="0.0057," aktivirano="" -kasno="" naspram="" reaktivirano="" *p="" {{="">

(d) Tortni grafikon predstavlja procenat uvećanih bodlji pečuraka (Dh veći od ili jednak 3Dn) i pečuraka iz Aktiviranih -kasnih i Reaktiviranih neurona.

(e) Reprezentativne slike (lijevi panel) i kvantifikacija (desni panel) nivoa Gria1 mRNA, tokom različitih fazamemorija. Podaci su predstavljeni kao omjer između nekoliko punkta i dužine dendritske osovine. Linija skale predstavlja 10 μm. N=4 miševa /5 sekcija po životinji, okvirni dijagram pokazuje srednju vrijednost, interkvartilni raspon i minimum i maksimum, Shaft; jednosmjerna ANOVA (parametrijska, neuparena) F (2, 15)=10.41, P=0.0015. Bonferronijev test višestrukih poređenja, **P=0.0011. donji panel - Soma; jednosmjerna ANOVA F (2, 12)=0.13, P=0.88.

Prošireni podaci Slika 7: Interakcije sa različitim kombinatornim pojačivačima vode do usmjerenosti

(a) Vennovi dijagrami pokazuju postotak preklapanja između pristupačnosti hromatina (DAR) u svimmemorijafaze (BAS vs. Aktivirano -rano, svijetlozeleni mrežni krug; Aktivirano -rano vs. Aktivirano -kasno, tamnozeleni mrežni krug; Aktivirano -kasno vs. Reaktivirano, narandžasti mrežni krug) i ukupne promjene transkripcije iz svih identificiranih klastera (Dw – kasno, kasno, stabilno, reaktivacija, plavi mrežasti krug). Intergenski i intronski DAR-ovi su mapirani u svoje odgovarajuće gene pomoću pc-HiC interakcijskih mapa. Procenat preklapanja je izračunat iz svih identifikovanih DEG-ova u klasterima (n=1095).

(b) Analiza preklapanja između DAR-ova (u parovima) i DEG-ova iz svakog klastera. Intergenski i intronski DAR-ovi su mapirani u svoje odgovarajuće gene pomoću pc-HiC interakcijskih mapa.

Analiza preklapanja je izvršena pomoću GeneOverlap R paketa. P-vrijednosti i Jaccard vrijednosti (boja) iz Fišerovog egzaktnog testa prikazane su na toplotnoj karti (lijevo). Procenat preklapanja je izračunat iz svih identifikovanih DEG-ova u klasterima (desno).

(c) Reprezentativna slika hromatina i transkripcionih promena Gabrb3 lokusa iz Dw-late klastera. Dok su interakcije u ranom stanju bile između promotora i pojačivača s transkripcijskim aktivatorima (Ap1), interakcije u kasnom stanju bile su sa transkripcijskim represorima (Slug). Gornji tragovi pretraživača IGV genoma (ljubičasta - bazalna, svijetlo zelena - Aktivirana - rano, tamno zelena - Aktivirana - kasno i narandžasta - Reaktivirana) predstavljaju promjene transkripcije (ncRNA-sek), srednje staze pokazuju dinamiku pristupačnosti hromatina (ATAC-sek) na promotor (crveni pravougaonik) i pojačivač (sivi pravougaonik). Značajne interakcije promotera i pojačivača su predstavljene kao lukovi (trake WashU pretraživača). Donja staza predstavljaju motive koji su identificirani pomoću HOMER alata (Slug, Ap1 i Rest).

(d) Agregacije za pojedinačne motive. Vrijednosti obogaćivanja (motivi po bp/ po piku) šest odabranih motiva (dva represora, dva aktivatora i dva bivalentna) procijenjene su oko centra pikova (-/ plus 4000 bp) iz svakog klastera.

Prošireni podaci Slika 8: Predloženi model pristupačnosti hromatina, interakcije promotor-pojačivač i transkripcione dinamike neurona hipokampalnog memorijskog engrama

regije, koje nose motive aktivatora transkripcije. Ovo reprogramiranje promotor-pojačivača rezultira povećanom ekspresijom gena što vjerovatno omogućava stabilizacijumemorija. Podsjetimo - reaktivirani engramski neuroni su koristili podskup interakcija promotor-pojačivača, što je povezano s transkripcijskim promjenama uključenim u transport mRNA do sinaptičkih odjeljaka i translaciju proteina. Transkripcijski faktor – TF, E(1–3) – različiti pojačivači koji stupaju u interakciju sa istim promotorom, crveni – represori transkripcije, plavi – aktivatori transkripcije.

Dodatni materijal

Pogledajte web verziju na PubMed Centralu za dodatni materijal.

Priznanja

Zahvaljujemo E. Niederst, J. Penney, S. Barker, RT Stott, M. Victor, A. Watson, N. Dedić, E. Lockshin i članovima L.HT Lab-a na korisnoj raspravi i prijedlozima. Zahvaljujemo menadžerima laboratorije Y. Zhouu, E. McNamari na održavanju kolonije miševa. Zahvaljujemo P. Autissieru (Whitehead Institute) na pomoći oko FACS-a. Finansiranje: Ovi radovi su podržani od strane NIH grantova RF1AG062377, AF1AG054012, RO1NS102730, RF1AG064321, The JPB Foundation, The Alana Down Syndrome Research Foundation, The LuMind Down Syndrome Research Foundation, The LuMind Down Syndrome Research Foundation, the Cure Fundation, The RCUI, The Cure Alzheim, The RCUI, A.RC. Porodična fondacija Belfer za LH.T. Ovaj rad je također podržao NIH Grants R01AG058002, u01NS110453, R01NS115065, UG3NS115064, R01MH067151, R01MH119507, U01HG008155, U24HG009546, U24HG009446 u MKVD podržan je Aarf -19-618751 Grant iz Alzheimerovog udruženja . HSM podržava Burroughs Wellcome Fund i UNCF-Merck postdoktorska stipendija. C. A podržava JPB fondacija. RMR je podržan od strane NIH T32 grant 5T32HD09806. Komplet za pripremu Hi-C biblioteka primljen je kao velikodušan poklon od DovetailTM (v.1.03, Dovetail Genomics, Čikago, SAD). Zahvaljujemo timu Dovetail na korisnoj raspravi i prijedlozima.