Dio 4: Mapiranje epigenomske i transkriptomske međusobne igre tokom formiranja pamćenja i prisjećanja u ansamblu hipokampalnog engrama
Mar 22, 2022
ali.ma@wecistanche.com
Molimo kliknite ovdje za dio 3
RNA-seq
ul vode bez nukleaze), 30 minuta na 37c uz lagano ljuljanje. Prošireni fragmenti DNK su amplificirani i kodirani pomoću PCR reakcije (1 ciklus; 5 min – 72c, 30 sekundi – 98c, 10 ciklusa; 15 sekundi – 98c, 30 sekundi – 60c, 3 min – 72c). Prateći protokol proizvođača, amplificirana DNK je očišćena i pročišćena korištenjem 1,8x AMPure kuglica (AmpureXP perle, Beckman Coulter, A63880). Nakon QC bioanalizatora za veličinu i distribuciju biblioteke, biblioteke su sekvencionirane na Illumina Nextseq 550 platformi u MIT BioMicro centru.
Cistanche i Cistanches za poboljšanje pamćenja
ATAC-seq analiza—Neobrađeni fastq podaci o 40-bp očitavanja uparenog kraja sekvenciranja su poravnati sa referentnim genomom mm9 miša korištenjem Bowtie 2.0 u uparenom načinu rada50. Kolekcija Samtools51 korištena je za sortiranje, uklanjanje PCR duplikata (rmdup), indeksiranje BAM datoteka (indeks) i izračunavanje statistike biblioteke (flagstat, vidi dodatnu tabelu 13). BAM fajlovi su smanjeni sa pravilno poravnatih, uparenih i jedinstvenih čitanja na 50M. Otvoreni vrhovi hromatina su analizirani korišćenjem softvera MACS252 Diffbind v1.16.353 je identifikovao Diferencijalno dostupne regione (DAR) sa podrazumevanim parametrima i postavkama za korišćenje DESeq2 (granična vrednost; FDR < 0,01;="" promene="" na="" preklop=""> 1,5). Kompletna matrica normaliziranih brojanja (RPKM54) je dohvaćena paketom DiffBind. Za generaciju velikih tragova, fajlovi signala gomilanja (nagomilavanje fragmenata na milion čitanja) u biografskom formatu su napravljeni korišćenjem MACS2 call peak funkcije sa -B –SPMR zastavicama. Zatim je generirano normalizirano obogaćivanje preklopa (FE) preko ulaznih lambda staza korištenjem bdgcmp funkcije MACS2 sa postavkom - m FE. Zatim su bedGraph fajlovi konvertovani u bigwig format.
IGV55 alati su korišteni za vizualizaciju velikih datoteka. ChromHMM56 je korišten za uspostavljanje modela stanja hromatina iz dvije nezavisne studije koje su koristile masivno tkivo hipokampusa prije i nakon šoka stopala21,22 i da bi se utvrdilo da se obogaćivanje DAR-ova preklopi u odnosu na model stanja. Analiza obogaćivanja motiva57,58 i označavanje vrhova izvršena je pomoću HOMER59 alata. Svi kodovi su dostupni u dodatnoj softverskoj datoteci za ekstrakciju RNA i pripremu biblioteke—odmah nakon fiksacije i sortiranja (vidi pripremu tkiva), 4 ul proteaze je dodano u pufer za varenje (RecoverAll™ komplet za izolaciju ukupne nukleinske kiseline za FFPE, Life Technologies, AM1975) . Uzorci su inkubirani u toplotnim blokovima 15 minuta na 50 stepeni, zatim 15 minuta na 80 stepeni. Zatim, 0,75 mL Trizol LS (TRIzol™ LS reagens, Thermo Fisher Scientific, 10296028) i 0,2 mL fenola: otopina hloroforma (fenol: kloroform: izoamil alkohol, 1 faza, VWR) je dodano u svaki uzorak, nakon čega je dodan uzorak K169. snažno mućkanje 5 minuta na sobnoj temperaturi (RT). Suspenzija je stavljena u teške epruvete s Phase lock gelom (PLG, 5 Prime, 2302830) i centrifugirana na 13,000rpm tokom 5 min. Vodena faza s nukleinskim kiselinama ekstrahirana je iz epruveta u svježu Eppendorf epruvetu sa jednakom količinom etanola 100 posto. Prečišćavanje RNK je izvršeno Direct-zol™ RNA MicroPrep kompletom (Zymo Research, R2060) za prečišćavanje RNK, prema uputstvu proizvođača. RNA je eluirana (10 ul, DEPC) i zatim pohranjena na -80 stepeni. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian (Clontech, 635006) korišten je za pripremu biblioteke i amplifikaciju. Za pripremu biblioteke korištene su 3 biološke replike (N=3). Biblioteke su pripremljene prema uputstvima proizvođača bez dodatnog koraka fragmentacije (FFPE, opcija 2, vidi priručnik), sa iscrpljivanjem ribosomske cDNK i finalnom PCR amplifikacijom (15 ciklusa). Biblioteke su sekvencionirane na Illumina HiSeq 2000 platformi u MIT BioMicro centru.
RNA-seq analiza—Neobrađeni fastq podaci su usklađeni sa mišjim mm9 referencom
genom koristeći Bowtie 2.0. Mapirana očitanja iz genskih tijela (uključujući očitanja eksona i introna) obrađena su pomoću Cufflinks 2.260 i DEseq261 sa UCSC mm9 referentnim genskim napomenama kako bi se procijenila zastupljenost transkripta. Diferencijalna ekspresija gena i nizvodne analize izvedene su korištenjem DEseq2 i prilagođenih R skripti. Relativna brojnost transkripata mjerena je fragmentima po kilobazi egzona na milion mapiranih fragmenata (FPKM).
Za analizu transkripcionih programa, ekspresija svakog gena je različita procenjenamemorijafaze (Aktivirano -rano, Aktivirano -kasno, Reaktivirano) njihovom log2 puta promjenom (log2FC) iz bazalnog stanja. 1095 diferencijalno eksprimiranih gena (DEG) prošlo je granične kriterije, u kojima smo uočili barem u jednom poređenju P-vrijednosti< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">
Cistanche može poboljšati pamćenje
Snimanje konformacije hromozoma (Hi-C)
Jezgra iz fiksiranih ćelija (vidi pripremu tkiva) sortirana su u Eppendorf epruvete od 1,5 mL koje sadrže 500 ul svježeg ledeno hladnog pufera za lizu (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0,2% Igepal CA{{ 9}}, Pi i PCR voda) i zamrznuti na suhom ledu i čuvani na -80c do upotrebe. Hi-C biblioteke su pripremljene od 100,000 ćelija/grupi (sakupljene od dvije životinje) u dvije biološke replike, koristeći priručnik za Dovetail™ Hi-C komplet (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, SAD). Šest Hi-C biblioteka je sekvencionirano (upareni kraj) na Illumina Nextseq 500 platformi. HOMER Hi-C cjevovod je korišten za filtriranje eksperimentalnih artefakata kao što su cirkularizacija, samoligacije i PCR duplikati. Filtrirana očitanja su usklađena sa referentnim genomom miša (mm9) i dalje obrađena pomoću HOMER HI-C cevovoda.
HOMER-ovi Hi-C alati su korišteni za izvođenje analize glavnih komponenti (PCA) na Hi-C podacima za identifikaciju subnuklearnih odjeljaka (A i B) u rezoluciji od 50 Kb (pogledajte dodatni softver). Za analizu prekidača odjeljka, prvo smo oduzeli PC1 vrijednosti između grupa. Zatim smo identifikovali gornje BtoA prelaze kao regione sa PC1 promenom iznad 90. percentila i gornje AtoB prelaze kao regione sa PC1 promenom ispod 10. percentila. Budući da su subnuklearni odjeljci regulirani kao jedinice od nekoliko stotina kilobaza, konsolidirali smo uzastopne AtoB ili BtoA segmente od 50 Kb koji su bili na udaljenosti od 100 Kb jedan od drugog. Konsolidirane domene ukupne veličine manje od 200 Kb odbacili smo. Prekidač odjeljka je uzet u obzir samo ako je negativna vrijednost transformirana u pozitivnu vrijednost (i obrnuto). Konačno, upoređene su pozitivne i negativne vrijednosti prve komponente između sve tri populacije neurona (bazalna, aktivirana - rana i aktivirana - kasna).
Promotor capture Hi-C
Nakon fiksacije i sortiranja (vidi pripremu tkiva) ćelije su razvrstane u 1,5 mL Eppendorf epruvete koje sadrže 500 ul svježeg ledeno hladnog pufera za lizu (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0,2% Igepal CA{ {9}}, Pi i PCR voda), zamrznuti na suhom ledu i pohranjeni na -80c do upotrebe. Hi-C biblioteke su pripremljene od 10,000 ćelija /po grupi (N=3–4), kao što je prethodno opisano62, uz određene modifikacije. Uzorci su centrifugirani (4 stepena, 1600 g tokom 20 minuta) i peleta je resuspendirana u 400 ul 1,2x Cutsmart pufera (New England Biolabs,
SAD). Prva restrikcijska digestija izvedena je kako je opisano u originalnom protokolu sa 1,500 U HindIII (R3104L, New England Biolabs, SAD), kao 6-baznim rezačom (umjesto BglII u originalnom protokolu). Nakon označavanja biotinom i vezivanja preko noći (pogledajte originalni protokol za detalje), uzorci su centrifugirani (4 stepena, 1.600 × g tokom 15 minuta) i peleta je resuspendirana u 25 ul PBS-a. Suspenzija je inkubirana u 65c sa 3 ul proteinaze K 12-16h. Prečišćavanje Hi-C DNK je obavljeno kako je opisano u originalnom protokolu sa 100 ul zrna streptavidina (Dynabeads M-280-streptavidin, Life Technologies, 11205D). Za drugi restrikcijski enzim koristili smo 4-bazni rezač Hpych4V (10 U /po uzorku, R0620S, New England Biolabs, USA). Nakon A-tailing reakcije (pogledajte originalni protokol za detalje), uzorci su amplificirani korištenjem PCR-a (17 ciklusa) i pročišćeni zrncima AMPure XP. Hi-C biblioteke su eluirane u 20 ul 10 mM Tris-HCl (pH 8,5). Dizajn sistema za hvatanje mamaca za Promoter Capture Hi-C – Lista od 5000 promotora mišjih gena dobijena je iz prethodno objavljenog protokola u Schoenfelderu. et al.29. Lista sadrži samo transkripte sa biotipom regiona koji kodiraju proteine, sa HindIII restrikcijskim fragmentima. Dizajnirane su dvije sonde za hvatanje od 120 bp, po jedna na svakom kraju fragmenta. Sonde su sintetizovane od strane Agilent Technologies prema SureSelect sistemu za obogaćivanje cilja (Agilent Technologies).
Priprema i sekvenciranje Hi-C biblioteke za hvatanje promotora – Da bismo uhvatili Hi-C ligacione proizvode koji sadrže sekvence promotora, koristili smo prethodno objavljeni protokol29. Ukratko, blokatori hibridizacije (Agilent Technologies) dodani su u Hi-C DNK biblioteke. Hibridizacijski pufer i RNA mamaca za hvatanje pripremljeni su prema uputama proizvođača (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies). Zatim, Hi-C biblioteka DNK/hibridizacijski blokatori su zagrevani 5 minuta na 95 stepeni, pre nego što su sniženi na 65 stepeni. Hi-C bibliotečka DNK je pomiješana sa hibridizacijskim puferom (prethodno zagrijanim 5 min na 65 stepeni), a zatim sa prilagođenim sistemom za hvatanje mamaca (prethodno zagrijanim 3 min na 65 stepeni), koji se sastoji od 10,000 biotiniliranih RNK ciljane na krajeve restrikcionog fragmenta HindIII od 5000 promotora mišjih gena (Agilent Technologies, vidi Dodatni materijal za dizajn mamaca za hvatanje). Nakon 24 h na 65 stepeni u PCR mašini, izvršeno je skidanje biotina (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) i ispiranja prema SureSelect Target protokolu obogaćivanja (Agilent Technologies). Nakon završnog ispiranja, kuglice su resuspendovane u 30 μL NEBuffera 2 bez prethodnog eluiranja DNK, a PCR nakon hvatanja (četiri ciklusa amplifikacije pomoću univerzalnih prajmera illumine) je izveden na DNK vezanoj za kuglice putem biotinilirane RNK. Biblioteke Capture Hi-C su uparene-krajeve sekvencirane (Nextseq 500, Illumina).
Hi-C analiza promotorskog hvatanja – HiCUP cevovod63 je upotrijebljen za obradu neobrađenih očitavanja brzog sekvenciranja. Ovaj cevovod je korišten za mapiranje parova čitanja u odnosu na genom miša (mm9), za filtriranje eksperimentalnih artefakata (kao što su cirkularizirana čitanja i ponovne ligacije) i za uklanjanje duplikata čitanja. Za pc-HiC podatke, rezultirajuće BAM datoteke su smanjene uzorkovanja i obrađene pomoću CHiCAGO verzije 1.2.064, slijedeći zadane postavke za pozivanje značajnih interakcija. Svi detalji o ovom cevovodu dostupni su od Babraham Bioinformatics
Cistanche može poboljšati pamćenje
Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection
ArcCreERT2 miševi su anestezirani avertinom i infuzijom virusa AAV{{1}EF1a-DIO-hChR2-EYFP (Serotype5, dobijen iz UNC virusnog jezgra). Prvo je napravljena mala rupa na lobanji iznad dorzalnog hipokampusa (u odnosu na Bregmu: prednje-posteriorno −2.0 i mediolateralno ± 1,5), spuštena je Hamiltonova šprica sa 33-iglom do -1,8 DV i 500 ηl virusa je infundirano sa brzinom protoka od 50 ηl u minuti u oba hipokampusa. Igla je izvučena, nakon perioda od 10 minuta nakon injekcije, a miševima je ostavljeno da se oporave 4 dana.
